Coincubation Assay pour quantifier les interactions concurrentielles entre Vibrio fischeri Isolates
Summary
Les bactéries encodent divers mécanismes pour s’engager dans la concurrence interbactérienne. Ici, nous présentons un protocole basé sur la culture pour caractériser les interactions concurrentielles entre les isolats bactériens et leur impact sur la structure spatiale d’une population mixte.
Abstract
Ce manuscrit décrit un test de coincubation fondé sur la culture pour détecter et caractériser les interactions concurrentielles entre deux populations bactériennes. Cette méthode utilise des plasmides stables qui permettent à chaque population d’être étiquetée différemment avec des capacités distinctes de résistance aux antibiotiques et des protéines fluorescentes pour la sélection et la discrimination visuelle de chaque population, respectivement. Ici, nous décrivons la préparation et la coincubation des souches concurrentes de Vibrio fischeri, l’imagerie par microscopie de fluorescence et l’analyse quantitative des données. Cette approche est simple, donne des résultats rapides, et peut être utilisée pour déterminer si une population tue ou inhibe la croissance d’une autre population, et si la concurrence est négociée par une molécule diffusible ou nécessite un contact direct cellule-cellule. Parce que chaque population bactérienne exprime une protéine fluorescente différente, l’épreuve permet la discrimination spatiale des populations concurrentes au sein d’une colonie mixte. Bien que les méthodes décrites soient effectuées avec la bactérie symbiotique V. fischeri en utilisant des conditions optimisées pour cette espèce, le protocole peut être adapté pour la plupart des isolats bactériens culturables.
Introduction
Ce manuscrit décrit une méthode basée sur la culture pour déterminer si deux isolats bactériens sont capables d’interactions concurrentielles. Lors de l’étude des populations mixtes, il est important d’évaluer dans quelle mesure les isolats bactériens interagissent, en particulier si les isolats sont directement en concurrence par des mécanismes d’interférence. La concurrence d’interférence se rapporte aux interactions où une population inhibe directement la croissance ou tue une population concurrente1. Ces interactions sont importantes à identifier car elles peuvent avoir des effets profonds sur la structure et la fonction d’une communauté microbienne2,3.
Des mécanismes de concurrence microbienne ont été découverts largement dans les génomes de bactéries provenant d’environnements divers, y compris les bactéries associées à l’hôte et les bactéries vivant librement4,5,6,7, 8,9. Diverses stratégies de concurrence ont été décrites10,11 comprenant des mécanismes diffusibles, tels que les produits chimiques bactéricides1,12 et les peptides antimicrobiens sécrétés13 , ainsi que les mécanismes dépendants du contact qui nécessitent un contact cellule-cellule pour transférer un effecteur inhibiteur dans les cellules cibles9,14,15,16,17 ,18.
Bien que les coincubations basées sur la culture soient couramment utilisées en microbiologie5,8,19, ce manuscrit décrit comment utiliser le résultat pour caractériser le mécanisme de la concurrence, ainsi que des suggestions pour adapter protocole d’utilisation avec d’autres espèces bactériennes. En outre, cette méthode décrit de multiples approches pour analyser et présenter les données pour répondre à différentes questions sur la nature des interactions concurrentielles. Bien que les techniques décrites ici aient été utilisées précédemment pour identifier le mécanisme de mise à mort interbactérienne sous-jacent à la concurrence intraspécifique entre les souches symbiotiques des bactéries coisolées de Vibrio fischeri 19,elles conviennent de nombreuses espèces bactériennes, y compris les isolats environnementaux et les agents pathogènes humains, peuvent être utilisées pour évaluer les mécanismes concurrentiels dépendants du contact et les mécanismes de concurrence diffusibles. Les étapes du protocole peuvent nécessiter une optimisation pour d’autres espèces bactériennes. Étant donné que plus de systèmes modèles élargissent leurs études au-delà de l’utilisation d’organismes isogéniques pour inclure différents génotypes10,16,20,21, cette méthode sera une ressource précieuse chercheurs qui cherchent à comprendre comment la concurrence a un impact sur les systèmes multi-souches ou multi-espèces.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le résultat coincubation décrit ci-dessus fournit une méthode puissante pour découvrir la concurrence interbactérienne. Cette approche a permis d’identifier la concurrence intraspécifique entre les isolats de V. fischeri et de caractériser le mécanisme concurrentiel19. Bien que la méthode décrite ait été optimisée pour la bactérie marine V. fischeri, elle peut être facilement modifiée pour accueillir d’autres espèces bactériennes, y compris des isolats cliniques…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier les évaluateurs pour leurs commentaires utiles. A.N.S. a reçu le soutien de la Fondation Gordon et Betty Moore par l’entremise de Grant GBMF 255.03 à la Life Sciences Research Foundation.
Materials
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 10 μL multichannel pipette | |||
| 100 μL multichannel pipette | |||
| 300 μL multichannel pipette | |||
| 10 μL single channel pipette | |||
| 20 μL single channel pipette | |||
| 200 μL single channel pipette | |||
| 1000 μL single channel pipette | |||
| 24-well plates | Fisher | 07-200-84 | sterile with lid |
| 96-well plates | VWR | 10062-900 | sterile with lid |
| Calculator | |||
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg /mL LBS) |
| Fluorescence dissecting microscope with camera and imaging software | |||
| forceps | Fisher | 08-880 | |
| Kanamycin Sulfate | Fisher | BP906-5 | stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS) |
| Nitrocellulose membrane (FS MCE, 25MM, NS) | Fisher | SA1J788H5 | 0.22 μm nitrocellulose membrane (pk of 100) |
| petri plates | Fisher | FB0875713 | sterile with lid |
| Spectrophotometer | |||
| Semi-micro cuvettes | VWR | 97000-586 | |
| TipOne 0.1-10 μL starter system | USA Scientific | 1111-3500 | 10 racks |
| TipOne 200 μL starter system | USA Scientific | 1111-500 | 10 racks |
| TipOne 1000 μL starter system | USA Scientific | 1111-2520 | 10 racks |
| Vortex | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LBS media | |||
| 1M Tris Buffer (pH ~7.5) | 50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base) | ||
| Agar Technical | Fisher | DF0812-17-9 | 15 g (Add only for plates) |
| DI water | 950 mL | ||
| Sodium Chloride | Fisher | S640-3 | 20 g |
| Tryptone | Fisher | BP97265 | 10 g |
| Yeast Extract | Fisher | BP9727-2 | 5 g |
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