Summary

Coincubation Assay zur Quantifizierung von Wettbewerbsinteraktionen zwischen Vibrio fischeri Isolaten

Published: July 22, 2019
doi:

Summary

Bakterien kodieren verschiedene Mechanismen für die Teilnahme an interbakteriellen Wettbewerb. Hier stellen wir ein kulturbasiertes Protokoll zur Charakterisierung von Wettbewerbsinteraktionen zwischen bakteriellen Isolaten und deren Auswirkungen auf die räumliche Struktur einer gemischten Population vor.

Abstract

Dieses Manuskript beschreibt einen kulturbasierten, coinkubischen Test zur Erkennung und Charakterisierung von Wettbewerbsinteraktionen zwischen zwei Bakterienpopulationen. Diese Methode verwendet stabile Plasmide, die es ermöglichen, jede Population mit unterschiedlichen Antibiotikaresistenzfähigkeiten und fluoreszierenden Proteinen für die Selektion bzw. visuelle Diskriminierung jeder Population unterschiedlich markiert zu werden. Hier beschreiben wir die Vorbereitung und Koinkubation konkurrierender Vibrio fischeri-Stämme, die Fluoreszenzmikroskopie-Bildgebung und die quantitative Datenanalyse. Dieser Ansatz ist einfach, liefert schnelle Ergebnisse und kann verwendet werden, um zu bestimmen, ob eine Population tötet oder das Wachstum einer anderen Population hemmt, und ob Der Wettbewerb durch ein diffusibles Molekül vermittelt wird oder einen direkten Zell-Zell-Kontakt erfordert. Da jede Bakterienpopulation ein anderes fluoreszierendes Protein ausdrückt, ermöglicht der Assay die räumliche Diskriminierung konkurrierender Populationen innerhalb einer gemischten Kolonie. Obwohl die beschriebenen Methoden mit dem symbiotischen Bakterium V. fischeri unter Verwendung von für diese Art optimierten Bedingungen durchgeführt werden, kann das Protokoll für die meisten kultivierbaren Bakterienisolate angepasst werden.

Introduction

Dieses Manuskript skizziert eine kulturbasierte Methode, um festzustellen, ob zwei bakterielle Isolate zu wettbewerbsorientierten Wechselwirkungen fähig sind. Bei der Untersuchung gemischter Populationen ist es wichtig zu beurteilen, inwieweit die bakteriellen Isolate interagieren, insbesondere ob Isolate direkt durch Interferenzmechanismen konkurrieren. Interferenzwettbewerb bezieht sich auf Wechselwirkungen, bei denen eine Bevölkerung das Wachstum direkt hemmt oder eine konkurrierende Bevölkerung tötet1. Diese Wechselwirkungen sind wichtig zu identifizieren, da sie tiefgreifende Auswirkungen auf die Struktur und Funktion einer mikrobiellen Gemeinschaft haben können2,3.

Mechanismen für mikrobielle Konkurrenz wurden weit in Genomen von Bakterien aus verschiedenen Umgebungen entdeckt, einschließlich sowohl wirtassoziierter als auch freilebender Bakterien4,5,6,7, 8,9. Eine Vielzahl von Wettbewerbsstrategien wurden beschrieben10,11 einschließlich diffusible Mechanismen, wie bakterizide Chemikalien1,12 und abgesonderte antimikrobielle Peptide13 , sowie kontaktabhängige Mechanismen, die einen Zell-Zell-Kontakt erfordern, um einen hemmenden Effektor in die Zielzellen9,14,15,16,17 zu übertragen ,18.

Obwohl kulturbasierte Coinkubationen häufig in der Mikrobiologie5,8,19verwendet werden, skizziert dieses Manuskript, wie der Assay verwendet werden kann, um den Mechanismus des Wettbewerbs zu charakterisieren, sowie Vorschläge zur Anpassung das Protokoll für die Verwendung mit anderen Bakterienarten. Darüber hinaus beschreibt diese Methode mehrere Ansätze zur Analyse und Darstellung der Daten, um verschiedene Fragen zur Art der Wettbewerbsinteraktionen zu beantworten. Obwohl die hier beschriebenen Techniken zuvor verwendet wurden, um den interbakteriellen Tötungsmechanismus zu identifizieren, der dem intraspezifischen Wettbewerb zwischen symbiotischen Stämmen von koisolierten Vibrio fischeri-Bakterien19zugrunde liegt, eignen sie sich viele Bakterienarten, einschließlich Umweltisolate und menschliche Krankheitserreger, und können verwendet werden, um sowohl kontaktabhängige als auch diffusible Wettbewerbsmechanismen zu bewerten. Schritte im Protokoll erfordern möglicherweise eine Optimierung für andere Bakterienarten. Angesichts der Tatsache, dass mehr Modellsysteme ihre Studien über die Verwendung isogener Organismen hinaus erweitern, um verschiedene Genotypen10,16,20,21, wird diese Methode eine wertvolle Ressource sein für Forscher, die verstehen wollen, wie sich der Wettbewerb auf Multi-Stamm- oder Multi-Arten-Systeme auswirkt.

Protocol

1. Bereiten Sie Stämme für die Coinkubation vor Wählen Sie einen geeigneten Referenzstamm, der als Ziel für den bakteriellen Wettbewerb während des Coinkubationstestes dient. Weitere Informationen finden Sie unter Diskussion über bewährte Methoden bei der Auswahl eines Referenzstamms und darüber, wie sich der Referenzstamm auf die Ergebnisse auswirkt. In diesem Protokoll dient der V. fischeri-Stamm ES114 als Referenzstamm. Bestimmen, welche Selektions- und Sc…

Representative Results

Um die Wechselwirkungen zwischen Bakterienpopulationen zu bewerten, wurde ein Coinkubations-Assay-Protokoll entwickelt und für V. fischerioptimiert. Diese Methode verwendet stabile Plasmide, die Antibiotikaresistenzgene und fluoreszierende Proteine kodieren, was eine Differenzauswahl und visuelle Diskriminierung jedes Stammes ermöglicht. Durch die Analyse der Daten, die aus dem Coincubation-Test gesammelt wurden, können das Wettbewerbsergebnis einer Interaktion und der Mechani…

Discussion

Der oben beschriebene Coincubation-Assay bietet eine leistungsstarke Methode, um interbakterielle Konkurrenz zu entdecken. Dieser Ansatz ermöglichte die Ermittlung des intraspezifischen Wettbewerbs zwischen V. fischeri Isolaten und die Charakterisierung des Wettbewerbsmechanismus19. Obwohl die beschriebene Methode für das marine Bakterium V. fischerioptimiert wurde, kann es leicht modifiziert werden, um andere Bakterienarten einschließlich klinischer und ökologischer Isolate …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken den Rezensenten für ihr hilfreiches Feedback. A.N.S. wurde von der Gordon and Betty Moore Foundation durch Grant GBMF 255.03 an die Life Sciences Research Foundation unterstützt.

Materials

1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fisher 05-408-129
10 μL multichannel pipette
100 μL multichannel pipette
300 μL multichannel pipette
10 μL single channel pipette
20 μL single channel pipette
200 μL single channel pipette
1000 μL single channel pipette
24-well plates Fisher 07-200-84 sterile with lid
96-well plates VWR 10062-900 sterile with lid
Calculator
Chloramphenicol Sigma C0378 stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg /mL LBS)
Fluorescence dissecting microscope with camera and imaging software
forceps Fisher 08-880
Kanamycin Sulfate Fisher BP906-5 stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS)
Nitrocellulose membrane (FS MCE, 25MM, NS) Fisher SA1J788H5 0.22 μm nitrocellulose membrane (pk of 100)
petri plates Fisher FB0875713 sterile with lid
Spectrophotometer
Semi-micro cuvettes VWR 97000-586
TipOne 0.1-10 μL starter system USA Scientific 1111-3500 10 racks
TipOne 200 μL starter system USA Scientific 1111-500 10 racks
TipOne 1000 μL starter system USA Scientific 1111-2520 10 racks
Vortex
Name Company Catalog Number Comments
LBS media
1M Tris Buffer (pH ~7.5) 50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base)
Agar Technical Fisher DF0812-17-9 15 g (Add only for plates)
DI water 950 mL
Sodium Chloride Fisher S640-3 20 g
Tryptone Fisher BP97265 10 g
Yeast Extract Fisher BP9727-2 5 g

References

  1. Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 15-25 (2010).
  2. Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 2 (8), 632-642 (2004).
  3. Dörr, N. C. D., Blockesh, M. Bacterial type VI secretion system facilitates niche domination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 8855-8857 (2018).
  4. Maclntyre, D. L., Miyata, S. T., Kitaoka, M., Pukatzki, S. The Vibrio cholerae type VI secretion system displays antimicrobial properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19520-19524 (2010).
  5. Salomon, D., Gonzalez, H., Updegraff, B. L., Orth, K. Vibrio parahaemolyticus type VI secretion system 1 is activated in marine conditions to target bacteria, and is differentially regulated from system 2. PloS One. 8 (4), e61086 (2013).
  6. Sana, T. G., et al. Salmonella Typhimurium utilizes a T6SS-mediated antibacterial weapon to establish in the host gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), E5044-E5051 (2016).
  7. Schwarz, S., et al. Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions. PLoS Pathogens. 6 (8), e1001068 (2010).
  8. Wenren, L. M., Sullivan, N. L., Cardarelli, L., Septer, A. N., Gibbs, K. A. Two independent pathways for self-recognition in Proteus mirabilis are linked by type VI-dependent export. MBio. 4 (4), (2013).
  9. García-Bayona, L., Guo, M. S., Laub, M. T. J. E. Contact-dependent killing by Caulobacter crescentus via cell surface-associated, glycine zipper proteins. Elife. 6, 24869 (2017).
  10. Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. Multifaceted interfaces of bacterial competition. Journal of bacteriology. 198 (16), 2145-2155 (2016).
  11. Cornforth, D. M., Foster, K. R. Antibiotics and the art of bacterial war. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10827-10828 (2015).
  12. Shank, E. A., Kolter, R. New developments in microbial interspecies signaling. Current Opinion in Microbiology. 12 (2), 205-214 (2009).
  13. Roelofs, K. G., Coyne, M. J., Gentyala, R. R., Chatzidaki-Livanis, M., Comstock, L. E. Bacteroidales secreted antimicrobial proteins target surface molecules necessary for gut colonization and mediate competition in vivo. MBio. 7 (4), e01055-e01016 (2016).
  14. Dey, A., Vassallo, C. N., Conklin, A. C., Pathak, D. T., Troselj, V., Wall, D. Sibling rivalry in Myxococcus xanthus is mediated by kin recognition and a polyploid prophage. Journal of bacteriology. 198 (6), (2016).
  15. Danka, E. S., Garcia, E. C., Cotter, P. A. Are CDI systems multicolored, facultative, helping greenbeards?. Trends in Microbiology. 25 (5), 391-401 (2017).
  16. Willett, J. L., Ruhe, Z. C., Coulding, C. W., Low, D. A., Hayes, C. S. Contact-dependent growth inhibition (CDI) and CdiB/CdiA two-partner secretion proteins. Journal of molecular biology. 427 (23), 3754-3765 (2015).
  17. Cianfanelli, F. R., Monlezun, L., Coulthurst, S. J. Aim, load, fire: the type VI secretion system, a bacterial nanoweapon. Trends in Microbiology. 24 (1), 51-62 (2016).
  18. Joshi, A., Kostiuk, B., Rogers, A., Teschler, J., Pukatzki, S., Yildiz, F. H. Rules of engagement: the type VI secretion system in Vibrio cholerae. Trends in microbiology. 25 (4), 267-279 (2017).
  19. Speare, L., et al. Bacterial symbionts use a type VI secretion system to eliminate competitors in their natural host. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), E8528-E8537 (2018).
  20. Shank, E. A. Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions. Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
  21. Long, R. A., Rowley, D. C., Zamora, E., Liu, J., Bartlett, D. H., Azam, F. Antagonistic interactions among marine bacteria impede the proliferation of Vibrio cholerae. Applied and Environmental Microbiology. 71 (12), 8531-8536 (2005).
  22. Dunn, A. K., Millikan, D. S., Adin, D. M., Bose, J. L., Stabb, E. V. New rfp-and pES213-derived tools for analyzing symbiotic Vibrio fischeri reveal patterns of infection and lux expression in situ. Applied and Environmental Microbiology. 72 (1), 802-810 (2006).
  23. Sana, T. G., et al. The second type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa strain PAO1 is regulated by quorum sensing and Fur and modulates internalization in epithelial cells. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 27095-27105 (2012).
  24. Bachmann, V., Kostiuk, B., Unterweger, D., Diaz-Satizabal, L., Ogg, S., Pukatzki, S. Bile salts modulate the mucin-activated type VI secretion system of pandemic Vibrio cholerae. PLoS. 9 (8), e0004031 (2015).
  25. Ishikawa, T., Rompikuntal, P. K., Lindmark, B., Milton, D. L., Wai, S. N. Quorum sensing regulation of the two hcp alleles in Vibrio cholerae O1 strains. PloS One. 4 (8), e6734 (2009).
  26. Ishikawa, T., et al. Pathoadaptive conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio cholerae O1 strains. Infection and immunity. 80 (2), 575-584 (2012).
  27. Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY. Environmental Microbiology. 12 (8), 2302-2311 (2010).
  28. Meibom, K. L., Blockesh, M., Dolganov, N. A., Wu, C. Y., Schoolnik, G. K. Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae. Science. 310 (5755), 1824-1827 (2005).
  29. Borgeaud, S., Metzger, L. C., Scrignari, T., Blockesh, M. The type VI secretion system of Vibrio cholerae fosters horizontal gene transfer. Science. 347 (6217), 63-67 (2015).
  30. Townsley, L., Mangus, M. P. S., Mehic, S., Yildiz, F. H. Response of Vibrio cholerae to low-temperature shift: CpsV regulates type VI secretion, biofilm formation, and association with zooplankton. Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 00807-00816 (2016).
  31. Huang, Y., et al. Functional characterization and conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio fluvialis. Frontiers in microbiology. 8, 528 (2017).

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Cite This Article
Speare, L., Septer, A. N. Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates. J. Vis. Exp. (149), e59759, doi:10.3791/59759 (2019).

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