Coincubation Асссе для количественной оценки конкурентных взаимодействий между Vibrio fischeri Изоляты
Summary
Бактерии кодируют различные механизмы для участия в межбактериальной конкуренции. Здесь мы представляем культурный протокол для характеристики конкурентных взаимодействий между бактериальными изолятами и того, как они влияют на пространственную структуру смешанной популяции.
Abstract
Данная рукопись описывает культурный, монетный опрос для обнаружения и характеристики конкурентных взаимодействий между двумя бактериальными популяциями. Этот метод использует стабильные плазмиды, которые позволяют каждой популяции быть дифференимно помечены с различными возможностями устойчивости к антибиотикам и флуоресцентные белки для отбора и визуальной дискриминации каждой популяции, соответственно. Здесь мы описываем подготовку и coincubation конкурирующих штаммов Vibrio fischeri, флуоресцентную микроскопию изображений и количественный анализ данных. Этот подход прост, дает быстрые результаты, и может быть использован для определения того, одна популяция убивает или подавляет рост другой популяции, и является ли конкуренция опосредована через диффузионную молекулу или требует прямого контакта клеток. Поскольку каждая бактериальная популяция выражает различные флуоресцентные белки, анализ позволяет пространственной дискриминации конкурирующих групп населения в смешанной колонии. Хотя описанные методы выполняются с помощью симбиотической бактерии V. fischeri с использованием условий, оптимизированных для этого вида, протокол может быть адаптирован для большинства виновных бактериальных изолятов.
Introduction
В этой рукописи излагается культурный метод определения того, способны ли два бактериальных изолята к конкурентным взаимодействиям. При изучении смешанных популяций важно оценить, в какой степени бактериальные изоляты взаимодействуют, особенно в том, что изоляты непосредственно конкурируют с помощью механизмов помех. Интерференция конкуренции относится к взаимодействиям, где одна популяция непосредственно препятствует росту или убивает конкурента населения1. Эти взаимодействия имеют важное значение для выявления, поскольку они могут иметь глубокое воздействие на структуру микробного сообщества и функции2,3.
Механизмы микробной конкуренции были широко обнаружены в геномах бактерий из различных сред, включая как хос-ассоциированных и свободно живущих бактерий4,5,6,7, 8,9. Различные стратегии конкуренции были описаны10,11 в том числе диффузивные механизмы, такие как бактерицидные химические вещества1,12 и секретированные антимикробные пептиды13 , а также контактно-зависимые механизмы, которые требуют контакта клетокдля передачи ингибирующего эффектора в клетки-мишени 9,14,15,16,17 ,18.
Хотя культурные монеты обычно используются вмикробиологии 5,8,19, эта рукопись описывает, как использовать анализ для характеристики механизма конкуренции, а также предложения по адаптации протокол для использования с другими бактериальными видами. Кроме того, этот метод описывает несколько подходов к анализу и представлению данных для ответа на различные вопросы о характере конкурентных взаимодействий. Хотя методы, описанные здесь были использованы ранее для выявления межбактериального механизма убийства, лежащего в основе внутриспецифической конкуренции между симбиотических штаммов coisolated Vibrio fischeri бактерий19, они подходят для многие бактериальные виды, включая экологические изоляты и патогены человека, и могут быть использованы для оценки как контакт-зависимых, так и диффузионных конкурентных механизмов. Шаги в протоколе могут потребовать оптимизации для других видов бактерий. Учитывая, что все больше модельных систем расширяют свои исследования за пределы использования изогенных организмов, чтобы включить различные генотипы10,16,20,21, этот метод будет ценным ресурсом для исследователей, стремящихся понять, как конкуренция влияет на многослойные или многовидовые системы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Анализ монетокубации, описанный выше, представляет собой мощный метод обнаружения межбактериальной конкуренции. Такой подход позволил выявить внутривидовую конкуренцию среди изолятов V. fischeri и характеристику конкурентного механизма19. Хотя описанный метод был оптим…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить рецензентов за их полезную обратную связь. A.N.S. была поддержана Фондом Гордона и Бетти Мур через Грант GBMF 255.03 в Фонд исследований в области наук о жизни.
Materials
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 10 μL multichannel pipette | |||
| 100 μL multichannel pipette | |||
| 300 μL multichannel pipette | |||
| 10 μL single channel pipette | |||
| 20 μL single channel pipette | |||
| 200 μL single channel pipette | |||
| 1000 μL single channel pipette | |||
| 24-well plates | Fisher | 07-200-84 | sterile with lid |
| 96-well plates | VWR | 10062-900 | sterile with lid |
| Calculator | |||
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg /mL LBS) |
| Fluorescence dissecting microscope with camera and imaging software | |||
| forceps | Fisher | 08-880 | |
| Kanamycin Sulfate | Fisher | BP906-5 | stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS) |
| Nitrocellulose membrane (FS MCE, 25MM, NS) | Fisher | SA1J788H5 | 0.22 μm nitrocellulose membrane (pk of 100) |
| petri plates | Fisher | FB0875713 | sterile with lid |
| Spectrophotometer | |||
| Semi-micro cuvettes | VWR | 97000-586 | |
| TipOne 0.1-10 μL starter system | USA Scientific | 1111-3500 | 10 racks |
| TipOne 200 μL starter system | USA Scientific | 1111-500 | 10 racks |
| TipOne 1000 μL starter system | USA Scientific | 1111-2520 | 10 racks |
| Vortex | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LBS media | |||
| 1M Tris Buffer (pH ~7.5) | 50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base) | ||
| Agar Technical | Fisher | DF0812-17-9 | 15 g (Add only for plates) |
| DI water | 950 mL | ||
| Sodium Chloride | Fisher | S640-3 | 20 g |
| Tryptone | Fisher | BP97265 | 10 g |
| Yeast Extract | Fisher | BP9727-2 | 5 g |
References
- Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 15-25 (2010).
- Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 2 (8), 632-642 (2004).
- Dörr, N. C. D., Blockesh, M. Bacterial type VI secretion system facilitates niche domination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 8855-8857 (2018).
- Maclntyre, D. L., Miyata, S. T., Kitaoka, M., Pukatzki, S. The Vibrio cholerae type VI secretion system displays antimicrobial properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19520-19524 (2010).
- Salomon, D., Gonzalez, H., Updegraff, B. L., Orth, K. Vibrio parahaemolyticus type VI secretion system 1 is activated in marine conditions to target bacteria, and is differentially regulated from system 2. PloS One. 8 (4), e61086 (2013).
- Sana, T. G., et al. Salmonella Typhimurium utilizes a T6SS-mediated antibacterial weapon to establish in the host gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), E5044-E5051 (2016).
- Schwarz, S., et al. Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions. PLoS Pathogens. 6 (8), e1001068 (2010).
- Wenren, L. M., Sullivan, N. L., Cardarelli, L., Septer, A. N., Gibbs, K. A. Two independent pathways for self-recognition in Proteus mirabilis are linked by type VI-dependent export. MBio. 4 (4), (2013).
- García-Bayona, L., Guo, M. S., Laub, M. T. J. E. Contact-dependent killing by Caulobacter crescentus via cell surface-associated, glycine zipper proteins. Elife. 6, 24869 (2017).
- Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. Multifaceted interfaces of bacterial competition. Journal of bacteriology. 198 (16), 2145-2155 (2016).
- Cornforth, D. M., Foster, K. R. Antibiotics and the art of bacterial war. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10827-10828 (2015).
- Shank, E. A., Kolter, R. New developments in microbial interspecies signaling. Current Opinion in Microbiology. 12 (2), 205-214 (2009).
- Roelofs, K. G., Coyne, M. J., Gentyala, R. R., Chatzidaki-Livanis, M., Comstock, L. E. Bacteroidales secreted antimicrobial proteins target surface molecules necessary for gut colonization and mediate competition in vivo. MBio. 7 (4), e01055-e01016 (2016).
- Dey, A., Vassallo, C. N., Conklin, A. C., Pathak, D. T., Troselj, V., Wall, D. Sibling rivalry in Myxococcus xanthus is mediated by kin recognition and a polyploid prophage. Journal of bacteriology. 198 (6), (2016).
- Danka, E. S., Garcia, E. C., Cotter, P. A. Are CDI systems multicolored, facultative, helping greenbeards?. Trends in Microbiology. 25 (5), 391-401 (2017).
- Willett, J. L., Ruhe, Z. C., Coulding, C. W., Low, D. A., Hayes, C. S. Contact-dependent growth inhibition (CDI) and CdiB/CdiA two-partner secretion proteins. Journal of molecular biology. 427 (23), 3754-3765 (2015).
- Cianfanelli, F. R., Monlezun, L., Coulthurst, S. J. Aim, load, fire: the type VI secretion system, a bacterial nanoweapon. Trends in Microbiology. 24 (1), 51-62 (2016).
- Joshi, A., Kostiuk, B., Rogers, A., Teschler, J., Pukatzki, S., Yildiz, F. H. Rules of engagement: the type VI secretion system in Vibrio cholerae. Trends in microbiology. 25 (4), 267-279 (2017).
- Speare, L., et al. Bacterial symbionts use a type VI secretion system to eliminate competitors in their natural host. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), E8528-E8537 (2018).
- Shank, E. A. Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions. Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
- Long, R. A., Rowley, D. C., Zamora, E., Liu, J., Bartlett, D. H., Azam, F. Antagonistic interactions among marine bacteria impede the proliferation of Vibrio cholerae. Applied and Environmental Microbiology. 71 (12), 8531-8536 (2005).
- Dunn, A. K., Millikan, D. S., Adin, D. M., Bose, J. L., Stabb, E. V. New rfp-and pES213-derived tools for analyzing symbiotic Vibrio fischeri reveal patterns of infection and lux expression in situ. Applied and Environmental Microbiology. 72 (1), 802-810 (2006).
- Sana, T. G., et al. The second type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa strain PAO1 is regulated by quorum sensing and Fur and modulates internalization in epithelial cells. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 27095-27105 (2012).
- Bachmann, V., Kostiuk, B., Unterweger, D., Diaz-Satizabal, L., Ogg, S., Pukatzki, S. Bile salts modulate the mucin-activated type VI secretion system of pandemic Vibrio cholerae. PLoS. 9 (8), e0004031 (2015).
- Ishikawa, T., Rompikuntal, P. K., Lindmark, B., Milton, D. L., Wai, S. N. Quorum sensing regulation of the two hcp alleles in Vibrio cholerae O1 strains. PloS One. 4 (8), e6734 (2009).
- Ishikawa, T., et al. Pathoadaptive conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio cholerae O1 strains. Infection and immunity. 80 (2), 575-584 (2012).
- Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY. Environmental Microbiology. 12 (8), 2302-2311 (2010).
- Meibom, K. L., Blockesh, M., Dolganov, N. A., Wu, C. Y., Schoolnik, G. K. Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae. Science. 310 (5755), 1824-1827 (2005).
- Borgeaud, S., Metzger, L. C., Scrignari, T., Blockesh, M. The type VI secretion system of Vibrio cholerae fosters horizontal gene transfer. Science. 347 (6217), 63-67 (2015).
- Townsley, L., Mangus, M. P. S., Mehic, S., Yildiz, F. H. Response of Vibrio cholerae to low-temperature shift: CpsV regulates type VI secretion, biofilm formation, and association with zooplankton. Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 00807-00816 (2016).
- Huang, Y., et al. Functional characterization and conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio fluvialis. Frontiers in microbiology. 8, 528 (2017).
