Coincubation Assay zur Quantifizierung von Wettbewerbsinteraktionen zwischen Vibrio fischeri Isolaten
Summary
Bakterien kodieren verschiedene Mechanismen für die Teilnahme an interbakteriellen Wettbewerb. Hier stellen wir ein kulturbasiertes Protokoll zur Charakterisierung von Wettbewerbsinteraktionen zwischen bakteriellen Isolaten und deren Auswirkungen auf die räumliche Struktur einer gemischten Population vor.
Abstract
Dieses Manuskript beschreibt einen kulturbasierten, coinkubischen Test zur Erkennung und Charakterisierung von Wettbewerbsinteraktionen zwischen zwei Bakterienpopulationen. Diese Methode verwendet stabile Plasmide, die es ermöglichen, jede Population mit unterschiedlichen Antibiotikaresistenzfähigkeiten und fluoreszierenden Proteinen für die Selektion bzw. visuelle Diskriminierung jeder Population unterschiedlich markiert zu werden. Hier beschreiben wir die Vorbereitung und Koinkubation konkurrierender Vibrio fischeri-Stämme, die Fluoreszenzmikroskopie-Bildgebung und die quantitative Datenanalyse. Dieser Ansatz ist einfach, liefert schnelle Ergebnisse und kann verwendet werden, um zu bestimmen, ob eine Population tötet oder das Wachstum einer anderen Population hemmt, und ob Der Wettbewerb durch ein diffusibles Molekül vermittelt wird oder einen direkten Zell-Zell-Kontakt erfordert. Da jede Bakterienpopulation ein anderes fluoreszierendes Protein ausdrückt, ermöglicht der Assay die räumliche Diskriminierung konkurrierender Populationen innerhalb einer gemischten Kolonie. Obwohl die beschriebenen Methoden mit dem symbiotischen Bakterium V. fischeri unter Verwendung von für diese Art optimierten Bedingungen durchgeführt werden, kann das Protokoll für die meisten kultivierbaren Bakterienisolate angepasst werden.
Introduction
Dieses Manuskript skizziert eine kulturbasierte Methode, um festzustellen, ob zwei bakterielle Isolate zu wettbewerbsorientierten Wechselwirkungen fähig sind. Bei der Untersuchung gemischter Populationen ist es wichtig zu beurteilen, inwieweit die bakteriellen Isolate interagieren, insbesondere ob Isolate direkt durch Interferenzmechanismen konkurrieren. Interferenzwettbewerb bezieht sich auf Wechselwirkungen, bei denen eine Bevölkerung das Wachstum direkt hemmt oder eine konkurrierende Bevölkerung tötet1. Diese Wechselwirkungen sind wichtig zu identifizieren, da sie tiefgreifende Auswirkungen auf die Struktur und Funktion einer mikrobiellen Gemeinschaft haben können2,3.
Mechanismen für mikrobielle Konkurrenz wurden weit in Genomen von Bakterien aus verschiedenen Umgebungen entdeckt, einschließlich sowohl wirtassoziierter als auch freilebender Bakterien4,5,6,7, 8,9. Eine Vielzahl von Wettbewerbsstrategien wurden beschrieben10,11 einschließlich diffusible Mechanismen, wie bakterizide Chemikalien1,12 und abgesonderte antimikrobielle Peptide13 , sowie kontaktabhängige Mechanismen, die einen Zell-Zell-Kontakt erfordern, um einen hemmenden Effektor in die Zielzellen9,14,15,16,17 zu übertragen ,18.
Obwohl kulturbasierte Coinkubationen häufig in der Mikrobiologie5,8,19verwendet werden, skizziert dieses Manuskript, wie der Assay verwendet werden kann, um den Mechanismus des Wettbewerbs zu charakterisieren, sowie Vorschläge zur Anpassung das Protokoll für die Verwendung mit anderen Bakterienarten. Darüber hinaus beschreibt diese Methode mehrere Ansätze zur Analyse und Darstellung der Daten, um verschiedene Fragen zur Art der Wettbewerbsinteraktionen zu beantworten. Obwohl die hier beschriebenen Techniken zuvor verwendet wurden, um den interbakteriellen Tötungsmechanismus zu identifizieren, der dem intraspezifischen Wettbewerb zwischen symbiotischen Stämmen von koisolierten Vibrio fischeri-Bakterien19zugrunde liegt, eignen sie sich viele Bakterienarten, einschließlich Umweltisolate und menschliche Krankheitserreger, und können verwendet werden, um sowohl kontaktabhängige als auch diffusible Wettbewerbsmechanismen zu bewerten. Schritte im Protokoll erfordern möglicherweise eine Optimierung für andere Bakterienarten. Angesichts der Tatsache, dass mehr Modellsysteme ihre Studien über die Verwendung isogener Organismen hinaus erweitern, um verschiedene Genotypen10,16,20,21, wird diese Methode eine wertvolle Ressource sein für Forscher, die verstehen wollen, wie sich der Wettbewerb auf Multi-Stamm- oder Multi-Arten-Systeme auswirkt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der oben beschriebene Coincubation-Assay bietet eine leistungsstarke Methode, um interbakterielle Konkurrenz zu entdecken. Dieser Ansatz ermöglichte die Ermittlung des intraspezifischen Wettbewerbs zwischen V. fischeri Isolaten und die Charakterisierung des Wettbewerbsmechanismus19. Obwohl die beschriebene Methode für das marine Bakterium V. fischerioptimiert wurde, kann es leicht modifiziert werden, um andere Bakterienarten einschließlich klinischer und ökologischer Isolate …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken den Rezensenten für ihr hilfreiches Feedback. A.N.S. wurde von der Gordon and Betty Moore Foundation durch Grant GBMF 255.03 an die Life Sciences Research Foundation unterstützt.
Materials
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 10 μL multichannel pipette | |||
| 100 μL multichannel pipette | |||
| 300 μL multichannel pipette | |||
| 10 μL single channel pipette | |||
| 20 μL single channel pipette | |||
| 200 μL single channel pipette | |||
| 1000 μL single channel pipette | |||
| 24-well plates | Fisher | 07-200-84 | sterile with lid |
| 96-well plates | VWR | 10062-900 | sterile with lid |
| Calculator | |||
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg /mL LBS) |
| Fluorescence dissecting microscope with camera and imaging software | |||
| forceps | Fisher | 08-880 | |
| Kanamycin Sulfate | Fisher | BP906-5 | stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS) |
| Nitrocellulose membrane (FS MCE, 25MM, NS) | Fisher | SA1J788H5 | 0.22 μm nitrocellulose membrane (pk of 100) |
| petri plates | Fisher | FB0875713 | sterile with lid |
| Spectrophotometer | |||
| Semi-micro cuvettes | VWR | 97000-586 | |
| TipOne 0.1-10 μL starter system | USA Scientific | 1111-3500 | 10 racks |
| TipOne 200 μL starter system | USA Scientific | 1111-500 | 10 racks |
| TipOne 1000 μL starter system | USA Scientific | 1111-2520 | 10 racks |
| Vortex | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LBS media | |||
| 1M Tris Buffer (pH ~7.5) | 50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base) | ||
| Agar Technical | Fisher | DF0812-17-9 | 15 g (Add only for plates) |
| DI water | 950 mL | ||
| Sodium Chloride | Fisher | S640-3 | 20 g |
| Tryptone | Fisher | BP97265 | 10 g |
| Yeast Extract | Fisher | BP9727-2 | 5 g |
References
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