Summary
ここでは、哺乳動物細胞由来のRNA:タンパク質(RNP)複合体の内因性RNA結合部位または「フットプリント」を濃縮するプロトコルを提示する。このアプローチは、RNPサブユニットの2つの免疫沈殿を伴い、したがって、並行してRNA免疫沈殿(RIPiT)と呼ばれています。
Abstract
タンデムにおけるRNA免疫沈殿(RIPiT)は、RNA:タンパク質(RNP)複合体内の一対のタンパク質のRNAフットプリントを濃縮する方法である。RIPiTは2つの精製ステップを採用しています。まず、タグ付きRNPサブユニットの免疫沈殿は、軽度のRNase消化およびその後の非回想性親和性溶出が続く。別のRNPサブユニットの第2の免疫沈殿は、定義された複合体の濃縮を可能にする。RNAおよびタンパク質の変性溶出に続いて、RNAフットプリントはハイスループットDNAシーケンシングライブラリーに変換されます。より一般的な紫外線(UV)架橋に続いて、RBP結合部位を濃縮する免疫沈殿(CLIP)アプローチとは異なり、RIPiTはUV架橋に依存しません。したがって、RIPiTはRNA相互作用に存在する多数のタンパク質に適用することができ、その先はRNA調節に不可欠であるが、RNAまたはUVクロスリンクに不十分に直接接触しない。RIPiTの2つの精製ステップは、目的のタンパク質が別の因子と連携して作用する結合部位を同定する付加的な利点を提供する。二重精製戦略はまた、背景を制限することによって信号を強化するのに役立ちます.ここでは、RIPiTを実行し、分離されたRNAフットプリントからハイスループットシーケンシングライブラリを生成するためのステップワイズ手順を提供します。また、RIPiTの利点とアプリケーションの概要を説明し、その制限事項について説明します。
Introduction
細胞内では、RNAはタンパク質と複合体内に存在し、RNA:タンパク質複合体(RAP)を形成します。RPは、RNA結合タンパク質(RRB、RNAを直接結合するもの)を中心に組み立てられますが、非RRB(RNAと結合するもので、RNAを結合しないもの)も含み、多くの場合、本質的に動的です。RRBとその共因子は、RRB内で一括して機能し、規制機能を実行します。例えば、ナンセンス媒介mRNA減衰(NMD)経路では、UPFタンパク質(UPF1、UPF2、およびUPF3b)は、早期に終了したリボソームを認識する。UPFタンパク質のそれぞれはRNAに結合することができますが、それらが一緒に組み立てるときだけ、活性NMD複合体が形成され始めます。この複合体内では、UPF1は非RBP SMG1によるリン酸化によってさらに活性化され、そのようなUPF1活性化は最終的にmRNA減衰誘導因子1、2の募集につながる。この例では、RBP は、NMD をトリガーする RNP 複合施設の採用およびアクティブ化に非 RBP 副要因を必要とします。RPのもう一つの性質は、その組成的不均一性である。異なる E、A、B、または C の複合体に存在するスプライセオソームを考えてみます。異なるスプリセオソーム複合体は、重複し、異なるタンパク質3を有する。RNP機能を研究するには、どのRNAがRBPとその関連タンパク質によって結合されているかを解明することが重要です。これを達成するために多くの方法が存在し、各アプローチには明確な長所と短所 4、5、6、7があります。
RBP結合部位を同定する広く一般的な方法-架橋に続いて免疫沈殿(CLIP)およびその様々なバリエーション - RBPをRNA8に架橋するために紫外線(UV)光に依存しています。ただし、これは、RNA に直接接触しない RP 内の非 RRB に対する効果的なアプローチではありません。ここでは、RNA 結合部位を分離して同定するために、RBP および非 RBP に適用可能な代替アプローチについて説明します。このアプローチは、連動してRNA免疫沈殿(RIPiT)と呼ばれる2つの免疫沈殿ステップからなり、単一の精製と比較してより高い特異性を達成するのに役立ちます(図1)9、10。個々の免疫沈殿(IP)ステップはCLIPと比較して低いストリンジェンシーで行うことができるので、RIPiTは免疫沈殿時に強い洗剤の存在に耐えることができる抗体の利用可能性に依存しない。RIPiTの最もユニークな利点は、2つの精製ステップで2つの異なるタンパク質を標的にする能力です。これは、他の同様の複合体11から組成的に異なるRNP複合体を豊かにする強力な方法を提供します。
RIPiTプロシージャへの小さなバリエーションは、RNP濃縮をさらに高めることができます。例えば、RP内のRNAタンパク質またはタンパク質とタンパク質の相互作用の一部は一過性であり、そのような複合体のフットプリントを効率的に精製することは困難である場合があります。このような相互作用を安定させるために、RPは細胞リシスおよびRIPiTの前にホルムアルデヒドと細胞内で架橋することができる。例えば、エキソン接合複合体(EJC)コア因子であるEIF4AIIIとEJC分解因子との間の弱い相互作用が、PYM12がより多くのRNAフットプリントが濃縮されるようなホルムアルデヒド処理で安定化できることを観察しました(データはが表示されます)。細胞採取およびRIPiTの前に、細胞はまた、特定の状態でRPを安定化または濃縮する薬物で治療することができる。例えば、翻訳中にmRNAから除去されるタンパク質を研究する場合(例えば、EJC 13、UPF114)、ピューロマイシン、シクロヘキシミドまたはハリントンチンなどの翻訳阻害剤による治療は、RNA上のタンパク質。
RIPiTから回収されるRNAの量は通常低い(0.5-10プレモル、すなわち、75 ntの平均RNA長を考慮して10〜250 ng RNA)。この主な理由は、特定のタンパク質のほんの一部のみがRP内の他のタンパク質と複合体内に存在する(第1ステップで行われた任意の「自由な」タンパク質IPが第2のIP中に失われる)。このRNAからRNA-Seqライブラリーを生成するために、我々はまた、このような低RNA入力に適した以前に公開されたプロトコルの適応を概説する 15,16 (図2), これは、3でハイスループットシーケンシング準備サンプルを得る日。
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Protocol
1. テトラサイクリン誘導性FLAGタグ付きタンパク質(POI)を発現する安定HEK293細胞株の確立
- 成長培地中の10 x 104細胞/mLの密度で安定に統合されたFlp組み換え標的(FRT)を持つ種子HEK293細胞(ダルベッコの改変イーグル培地[DMEM]+10%胎児ウシ血清[FBS]+1%ペニシリン-ストレプトマイシン[ペン/strep])井戸プレート。37 °C および 5% CO2 (後続のすべてのステップの標準的な成長条件) で加湿インキュベーターで一晩成長する細胞を許可します。
- 翌日、細胞は〜70%のコンフルエントでなければなりません。トランスフェクション試薬プロトコルによれば、FRT部位含有HEK293細胞を9:1比のpcDNA5-TETO-FLAG-POI:pOG44でトランスフェクトする。
注:FLAGタグは、シーケンスモチーフDYKDDK(D=アスパラギン酸、Y=チロシン、およびK=リジン)を有する。 - 24時間後、抗生物質の選択を開始する。培地を取り除き、100 μg/mLのハイグロマイシンを添加した新鮮な成長培地を追加します。72時間以内に、トランスフェクトされていない細胞は死に始めるはずです。
- すべての 48-72 h, 成長メディアを変更し、新鮮なハイグロマイシンを補う.
- 〜2週間の選択の後、安定してトランスフェクトされた細胞の離散コロニーが現れ始める。コロニーが肉眼で見たら、プレートに1 mLのトリプシンを加え、37°Cで5分間インキュベートします。DMEMで細胞を再中断し、新しい10cmプレートに細胞を移し、100 μg/mLのハイグロマイシンを補充した10mLの新鮮な成長培地に体積を調整する。プレートが約80%の合流性に達し、細胞をさらに膨張させて永久的なストックを準備できるようにします。
- 実験に最適なレベルのFLAG-POI発現を得るために必要なテトラサイクリン(Tet)の量を決定する。12ウェル形式で細胞を成長させ、0-1,000 ng/mL範囲の間でTetの滴定を行い、16〜24時間の間に、POIに対する抗体を用いて滴定サンプルにウェスタンブロットを行う。
注:最大60kDaまでのタンパク質の場合、FLAGタグ付きおよびタンパク質の内因性コピーは、ドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)上で解決され、FLAG-POIの発現レベルを内因性の対応するタンパク質と比較することができます。より大きなタンパク質の場合、Tet誘導サンプルのシグナル強度を未誘導サンプルと比較することができます。テトラサイクリンストック溶液は、100%エタノール中の1mg/mLで調製することができる。細胞培養作業のためのストックの希釈は、滅菌水またはリン酸緩衝生理食べ物(PBS)にする必要があります。テトラサイクリンストックは、毎月1回新鮮に準備する必要があります。
2. テトラサイクリン誘導およびRIPiT手順のための細胞の培養
- 種子は15 cm版の成長媒体の3 x 105細胞/mLの密度で安定に統合されたFLAG-POI HEK293。細胞が37 °C および 5% CO2で成長できるようにします。
注:一般に、3~5枚の15cmプレートは、目的のRNPの豊富さに応じて、RNAフットプリントの約2〜20pmolを得る。RPCがホルムアルデヒドを架橋し、厳しい条件下で精製する場合は、2倍の入力が必要になる場合があります。 - 細胞が収穫される前にFLAG-POIの発現を誘導するために、予め決定された最適濃度を培方にテトラサイクリンを加えます(ステップ1.6)16-24 hを参照してください。
注:成長培地を変える必要はありません。細胞は、播種後またはプレートが〜80%コンフルエントである場合に約72時間を収穫する準備ができている必要があります。細胞がコンフルエントになるのを避けることは重要です。
3. 細胞採取、ホルムアルデヒド処理、細胞分解
- 15cmプレートごとに15mLの冷蔵PBSで単層細胞を静かに洗います。その後、PBSの30 mLで細胞を掻き取ります。細胞が収穫前に薬物で治療された場合, 薬物でPBSを補う.50 mL円錐形チューブにすべての細胞を集みます。
注:弱い相互作用を維持するために、細胞はホルムアルデヒドと架橋することができる:ステップ3.1から最終濃度0.1%に細胞懸濁液にホルムアルデヒドを追加し、室温で10分間ロッカーにインキュベートする(表1))と5分間ロックします。 - ペレット細胞を400xgで4°Cで10分間、上清を廃棄する。
- 氷冷低トンリシスバッファーの4 mL中のライス細胞(HLB;表1)P1000 ピペットを使用してセルを再中断します。5 mLチューブに移し、氷の上で10分間リザートをインキュベートします。
- 氷浴にライサートを入れ、2sの一時停止で1 sパルスで30sの振幅10%で超音波処理します。次いで、5M NaClの108 μLを加えて150mMに塩濃度を調整する。
注:ホルムアルデヒド架橋サンプルは、SDSとデオキシコール酸ナトリウムをそれぞれ0.1%のリシスバッファーに含むことで、より厳格な分解および精製を受けることができます。 - 21,000 x gで21,000 x gでリサートを4°Cで10分間クリアします。入力中のタンパク質レベルのウェスタンブロット分析用の標識チューブに20 μL上清(細胞抽出物)を集めます(図3A参照)。
注:リサートが遠心分離機にある間、FLAGアガロースビーズを洗浄することができます(ステップ4.1参照)。FLAGアガロスビーズは、氷冷アイソトニック洗浄バッファーの4mLで3倍を予洗浄する必要があります(IsoWB,表1)。
4. フラグ免疫沈殿
- ステップ3.5から750 μLの予洗浄されたFLAGアガロースビーズを5mLチューブに塗布します(洗浄されたFLAGアガロースビーズのベッド体積は375μLになります)。FLAGアガロースビーズと細胞エキスを4°Cで1~3時間、穏やかな混合でインキュベートします。
注:FLAGアガロースビーズのこの体積は、広範囲のタンパク質に対して十分であるはずであるが、必要に応じて最適化することができる。 - ペレットフラグアガロースビーズを4°Cで1分間400xgで遠心分離により。枯渇細胞抽出物中のタンパク質レベルのウェスタンブロット分析用標識チューブ内の上清の20 μLを収集する(図3A参照)。残りの上清を破棄します。
- FLAGアガロースビーズを洗浄するには、IsoWBの4 mLを追加し、再中断します。ペレットビーズは4°Cで1分間400 x gです。上清を慎重に取り除きます。4xを繰り返します。
注:ホルムアルデヒド架橋されたAPの厳格な洗浄のために、SDSとデオキシコレートナトリウムのそれぞれ0.1%を最初の2つの洗浄ステップの洗浄バッファーに含めることができます。
5. RNase I 消化
- RNase IをIsoWBの750 μLで0.002-0.01単位/mLに希釈する(所望のフットプリントサイズに対する適切な濃度は経験的に決定する必要がある)。IsoWB-RNase Iを加えてフラグアガロースビーズを洗浄し、4°Cで10分間穏やかに混合してインキュベートします。
- ペレットビーズは4°Cで1分間400 x gです。ウェスタンブロット分析用の標識チューブに20μL上清(RNase I溶出)を集みます。IsoWB-RNase Iを廃棄し、ステップ4.3で説明するように、IsoWBでフラグアガロースビーズを4倍に洗浄します。
6. アフィニティの溶出
- 溶出バッファーのストックを調(IsoWBでは250ng/mLのFLAGペプチド)。375 μLの溶出バッファーをFLAGアガロースビーズに塗布し、1-2hのために4°Cで穏やかに振り、FLAG IPのタンパク質のウェスタンブロットに対する溶出の15 μLアリコートを収集します(図3A参照)。
注:アフィニティ溶出が進行中の場合、セクション7を実行することができる。
7. 磁気ビーズ抗体結合
- 50 μLの磁気ビーズ(ダイナビーズ;材料の表)1.5 mLチューブで1 mL IsoWBの3倍。コンジュゲーションバッファの100 μLで磁気ビーズを再中断します。適切な量の抗体を添加する(IPに使用する抗体の正確な量は、各抗体について経験的に決定する必要がある)。
注:タンパク質A磁気ビーズはウサギで産生される抗体に最適ですが、プロテインG磁気ビーズはマウス抗体に適しています。磁気ビーズの互換性チャートは、各抗体に適したビーズを選択するためにサプライヤーのウェブサイトで入手可能です。 - 磁気ビーズをコンジュゲーションバッファで2x洗浄する(表1)。少なくとも10分間室温で混合物をインキュベートし、RIPiT希釈バッファーの375 μLで磁気ビーズを再中断します。次のステップまで氷の上に保存します。
8. 第2の免疫沈殿
- ステップ6.1から目的のタンパク質に対する抗体に結合された磁気ビーズに残りのFLAGアフィニティ溶出を適用します。4°Cで1-2hで穏やかな混合でインキュベートし、磁石上の磁気ビーズを捕捉し、ウェスタンブロットを介して非結合タンパク質の分析のために15 μLの上清を収集します。磁気ビーズを1mLのIsoWBで7倍洗います。
9. 脱次溶出
- 磁気ビーズに100 μLの透明サンプルバッファー(表1)を追加し、P200ピペットで再サスペンドします。氷の上で10分間インキュベートし、ビーズを定期的に再濁させるのを穏やかにフリックします。
- 磁石上の磁気ビーズを捕捉し、ウェスタンブロットを介してRIPiT溶出中のタンパク質の分析のために15 μLの溶出を収集します(図3A参照)。残りの溶出を新しいラベル付き 1.5 mL チューブに転送します。
注:サンプルがホルムアルデヒド架橋された場合、サンプルは架橋を逆にするために1時間65°Cでインキュベートする必要があります。 - 様々なステップ(入力、FLAG IP枯渇、FLAG IP、第2IP枯渇、第2IP溶出)で収集されたサンプルに対してウェスタンブロットを実行します。2つの餌タンパク質に対する抗体を用いてブロットし、その他の介数が知られている場合、および少なくとも1つの非相互作用RBPを陰性対照対として(図3A)。
10. RNA抽出とエンド硬化
- RIPiT溶出に、RNaseフリーddH2Oの320 μL、フェノールクロロホルムイソアミルアルコール(PCIAA、pH 4.5)の400μL、30sの渦を加え、室温で12,000 x gで5分間、3500°Cの別々のフェーズに入れます。3M酢酸ナトリウムの35μL、1M MgCl2の1μL、グリコーゲンの10μg、100%エタノールの1mLを加えます。-20 °Cで一晩インキュベートします。
- ペレットRNAに、遠心分離機を12,000 x gで4°Cで30分間使用します。70%エタノールでRNAを洗浄します。
- RNase I切断後にRNAに残された3'リン酸塩を除去するには、RNaseフリーddH2Oの17 μLでRNAペレットを再ステースし、10x T4ポリヌクレオチドキナーゼ(PNK)バッファー(材料表)およびT4 PNKの1μLの2μLを添加する。37 °Cで30分間インキュベートします。
注:T4 PNKの3'ホスファターゼ活性はpH 617で最適な活性を有する。PNK反応バッファーは、T4 PNKの5'キナーゼ活性に最適化され、7.6のpHを有する。エンド硬化反応のpHを調整する試みが試みられたが、この工程をさらに最適化することができる。 - 管にPCIAA pH 4.5のRNaseフリーddH2Oおよび400 μLの380 μLを加加える。30sの渦、5分間12,000 x gの遠心分離機で水相を収集し、3M酢酸ナトリウムの35 μL、1M MgCl2の1μL、グリコーゲンの10μg、および100%エタノールの1mLを加加える。
- -20 °Cで一晩インキュベートします。ペレットと上記のように70%エタノールでRNAを洗浄します。RNaseフリー水の4.5 μLでRNAを再中断します。
11. RNAフットプリントのサイズと豊富さの推定
-
成功したRIPiTは、RNA断片の1pmol以上を得ることが期待されます。実際の収量を定量化するには、RIPiT RNAの0.7 μL(総収量の約1/6)を新しいチューブに移します。10x T4 PNK バッファーの 2 μL、1 mM ATP の 1 μL、40 μCi γ32P-ATP (ストックの 0.5−1.0 μL)、および T4 PNK の 1 μL を追加します。体積を10μLに調整し、37°Cで30分間インキュベートします。
- 並列PNK反応では、低範囲のDNAラダーと0.1pmolの合成RNAまたはDNAオリゴ(20〜40 nt)を標識し、サイズと量の基準を使用します。
- 26%尿素-PAGEゲル(20 x 27 x 0.45 mm 3)で標識されたRNA/DNAを解決します。ゲルは、事前実行前に35 W.フラッシュウェルで30分間事前実行し、サンプルをロードする前に、ブロモフェノール青色染料フロントがゲルの終わりに近くなるまで35 Wで実行する必要があります。
- 8 x 11インチのフィルターペーパーにガラス板からゲルを慎重に取り除きます。紙の上にゲルを置き、ゲル乾燥装置に入れ、プラスチックラップで覆います。80°Cで1時間真空で乾燥ゲル。
- 乾燥したゲルを一晩、または適切な信号が検出されるまで、リンスクリーンに露出させます。画像ホスホスクリーン。RIPiTからの良質のRNAは、最小限の顕著なバンドで、レーンにスミアとして表示されるはずです(図3B)。RNAを定量化するには、RIPiTレーン内の所望サイズのRNA断片のシグナル強度を、標識された合成オリゴの0.1pmolからの信号と比較します。
注:あるいは、RNAフットプリントの大きさおよび量は、高感度バイオアナライザ(図3C)を用いて検証することができる。
12. アダプターライゲーション
- 少なくとも3つのRNAが3.8 μLの水に溶解するようにRIPiT RNAを調べなさい。
- 0.2 mLポリメラーゼ連鎖反応(PCR)チューブで、RNAの3.8μL、miR-CAT-33の1μLを予備アデニル化アダプター(7 μM)(材料の表)を組み合わせます。サーマルサイクラーで10分間、16°Cで5分間熱サイクラーで混合をインキュベートし、4°Cで保持します。
注:前アデニル化リンカーは、オリゴ合成サービスから注文するか、または任意のオリゴ合成サービスからのカスタム無人化DNAオリゴをMth RNAリガーゼ(材料の表)を使用してアデレーズし、ゲル精製することができる。 - 同じチューブに、10x T4 RNAリガーゼバッファーの1.5 μL、50%ポリエチレングリコール8000(PEG-8000)の7.5 μL、20mMジチオトレトール(DTT)の0.75 μL、およびT4 RNL2 Trの0.45 μLを追加します。
注:50%PEG-8000は、購入したRNAリゲスとバッファが付属しています。PEG-8000の解決は粘性であり、ゆっくりとピペットされるべきである。 - サーマルサイクラー中の反応を6時間30°Cでインキュベートし、65°Cで10分間ライガーゼを不活性化し、次いで4°Cで保持する。
13. 逆転写
- ステップ12.4からのライゲーションミックスを用いたチューブに、レギュラーおよびビオチン化dNTPの混合物を含む4xデオキシヌクレオチド三リン酸(dNTP)ミックスの11.25 μLを加え(表1参照)、10 μM RTプライマー(材料の表)の1.0 μLを含む。.ルセフリーの水。65°Cで5分間インキュベートし、4°Cで保持します。
- チューブを氷に移し、MgCl2(表1)、100mM DTTの2.25 μL、1.2 μLの逆転写酵素を45μL(材料表)の最終容積に加え、5xファーストストランド(FS)バッファーの9.0 μLを追加します。
- 55°Cで30~60分間熱サイクラーでインキュベートし、70°Cで15分間逆転写酵素を不活性化し、4°Cでサンプルを保持します。
14. RT製品の精製
- RT反応に2x尿素負荷バッファ(表1)の45 μLを追加します。45 μLの低域DNAラダーの1 μgを希釈し、2x尿素負荷バッファーの45 μLを追加します。
- 10%尿素-PAGEゲル(20 x 28 x 0.15 cm3;表 1)8ウェル櫛で。シリンジまたはピペを使用して、0.5xトリス/ボレート/EDTA(TBE)バッファでウェルをフラッシュします。
注:上記の自家製ゲルは、拡張RT製品を拡張RTプライマーから分離する場合に、より良い解像度を提供します。代替として、プレキャスト尿素-PAGEゲルを使用することもできます(材料の表)。プレキャストゲルは、ウェルあたりの最大容積が小さいため、サンプルを複数のウェルに分割する必要があります。プレキャストゲルは150−200Vで実行する必要があります。 - 30分間35Wでゲルを事前に実行し、再びウェルをフラッシュし、ブロモフェノール青色染料フロントがゲルの端から約1インチに移行するまで、サンプルをロードし、35Wでゲルを実行します。
注:ゲルの過熱を防ぐために、事前実行と最終実行中に金属ヒートシンクを使用してください。 - 0.5倍TBEで調製した1x金核酸ゲル染色液で5分間ゲルを染色します。この染料は光に敏感なので、光の露出は避けてください。
- 520 nm励起および580 nm発光フィルターを使用して文書化目的のための蛍光スキャナ上のイメージゲル。蛍光スキャナが使用できない場合は、青色光トランジリューヌを使用します。RT 製品は、拡張されていない RT プライマーの上からスミアとして表示されます (図4)。
注:金核酸ゲル染色剤は、UV光源を持つゲルドック上で容易に可視化されますが、損傷を防ぐために貴重なRT製品をUVにさらすことは重要です。 - 青色光トランジルミネーションでゲルを可視化し、ゲルからRT製品を取り除きます。30-200 nt (図4) の範囲の拡張子で DNA を切断することをお勧めします。切除したゲル片をきれいな表面に置き、スライスを小片にミンチして表面積を増やします。慎重に1.5 mLチューブに移し、800 μLのDNA溶出バッファーを追加します(表1)。
- ゲル片を室温で一晩にわたってDNA溶出バッファーと穏やかに混合してインキュベートします。
- 溶出バッファーをゲルから分離し、2 mL回収管に入れたセルロースアセテートフィルターカラム(材料の表)を通してスラリーを通過させます。
- 1.5 mLチューブで、ストレプトアビジンビーズ洗浄バッファー(表1)の500μLで10μLのストレプトアビジン磁気ビーズを洗浄します。合計 3 回の洗い流しを繰り返します。ビーズを乾かさないようにしてください。DNA溶出バッファーの10 μLでビーズを再中断する(表1)。
- ステップ14.8でゲル片から分離した溶出バッファーを、洗浄されたストレプトアビジン磁気ビーズを含むチューブに移す。
- 室温で少なくとも8時間の穏やかな混合でインキュベートします。磁石上のビーズを捕捉し、上清を取り除き、RNaseフリー水の10 μLで磁気ビーズを再中断し、0.2 mL PCRチューブに移します。
15. RT製品の循環化
- ストレプトアビジンビーズで捕捉されたRT製品は、ビーズに結合しながら円形化されます。磁気ビーズスラリーに、10倍の円化反応バッファーの2.0 μL、1mM ATPの1.0 μL、50mM MnCl2の1.0 μL、5Mベタインの4.0 μL、ssDNAリガーゼI(材料の表)の1.0 μLを加え、およびRNaseフリー水の1.0 μLを添加する。
- 熱サイクラー上の円化反応を60°Cで4時間インキュベートし、80°Cで10分間加熱し、4°Cで保持してssDNA ligase Iを不活性化します。
16. テスト PCR
- 大規模なPCRに進む前に、円形製品の一部を使用して、各サンプルの増幅サイクルの理想的な数を決定します。このステップは、PCR反応成分がより高いPCRサイクルで制限されるにつれて、過剰増幅を防止し、PCRアーティファクトを制限するのに役立ちます。
- ステップ15.2、5倍反応バッファーの9.0 μL、0.9 μL 10 M dNTP、10 μM PE1.0プライマーの2.25 μL(材料表)、10μM PE2.0素数の2.25 μLを調製、0.045 μLの高忠実度DNAポリメラーゼ(材料表)、及び水。
- 反応をうまく混合し、3つの15 μL反応に分割します。これらの3つの反応のそれぞれは、PCRサイクルの可変数の影響を受けます.理想的なサイクル数は 7 ~ 14 です。したがって、8 サイクル、11 サイクル、および 14 サイクルのテスト PcR を実行します。
- 次の PCR 条件を使用してください: 98 °C - 30 s;98 °C - 5 s;65 °C - 10 s;72 °C - 15のs;72 °C - 2分;12 °C - ホールド。
- 6倍ゲルローディング染料の3 μLを追加し、青色染料フロントがゲルの3/4を移行するまで、10%ネイティブPAGEゲルで解決します。ステップ14.4および14.5(図5)のように、金核酸ゲル染色および画像を使用してゲルを染色する。
- PCR サイクルの理想的な数を選択するには、サイクル数の増加から PCR 製品を比較します。過剰増幅アーティファクトなしで期待されるサイズの製品の最大量を生み出すサイクル番号を選択します(例えば、DNAスミアは予想される製品よりもはるかに大きく、PE1.0およびPE2.0プライマーの顕著な枯渇が見られない場合(赤い矢印を参照)。図5)。
17. 大規模なPCR
- ステップ 16.2 のように 45 μL PCR 反応を調作成し、PCR を繰り返します。150Vで10%ネイティブPAGE上のPCRを解決し、青色光トランジルミネーション上の1x金核酸ゲル染色と画像で染色します。
- ゲルからPCR製品を物品を取り出し、3mLシリンジに移します。注射器を使用してゲルを粉砕し、1.5 mLチューブに押し出します。
注:円形化時の未拡張RTプロダクトは151 bpのPCRプロダクトを得る。したがって、この手順では、サイズが 151 bp より大きい製品を選択する必要があります (図6)。 - DNA溶出バッファーの900 μLを追加し、穏やかな混合で一晩室温でインキュベートします。
- ゲルスラリーを2mL回収管に入れたセルロース酢酸フィルターカラムに移す。12,000 x gで3分間スピンし、上清を新鮮なチューブに集めます。
- 破砕されたゲルにさらに400μLのDNA溶出バッファーを加え、1.5 mLチューブに移します。2回目の溶出のためにさらに4時間、穏やかな混合でインキュベートします。
- すべての溶出物をプールし、それぞれ400 μLで3つのチューブに分割します。100%エタノールと10μgのグリコーゲンを1mL添加してDNAを沈殿させる。渦と-20 °Cで少なくとも2hをインキュベートします。
- 4°Cで30分間12,000 x gのペレットDNA。70%のエタノールでDNAペレットを洗浄します。
- ピペッティングによってすべてのエタノールを慎重に除去し、20 μLの水でDNAペレットを素早く再中断します。
注:この段階では、DNAペレットを乾燥させないようにすることが重要です。 - DNAサンプルの小さな部分を使用して、フルオロメーターと高感度DNAバイオアナライザを介してPCR産物のサイズと濃度を決定します。サンプルを送信して、プラットフォームの 1 つでシーケンスを行うことができるようになりました。
- シーケンス化された読み取りは、処理(例えば、アダプターの取り外し、シーケンスを維持するためのトリミング>30 Phredスコア)、参照ゲノムに合わせ、UCSCゲノムブラウザなどのブラウザ上で可視化することができる(図7)。
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Representative Results
RIPiTが成功すると、目的のタンパク質と他の既知の相互作用タンパク質の両方の免疫沈殿と、非相互作用タンパク質の不在が生じる。図3Aに見られるように、MagohとEIF4AIIIの両方がRIPiT溶出で検出されたが、HNRNPA1は検出されなかった(レーン6)。並行して、RNP複合体と共精製したRNAフットプリントは、自動無線撮影(図3B)またはバイオアナライザ(図3C)を介して検出された。ピューロマイシン治療はRNAのEJC占有率を増加させると予想され、図3Bのピューロマイシン処理RIPiTにおいてより強いRNAフットプリントシグナルが観察された(レーン2および3を比較)。深いシーケンシングのためのサンプルを生成するには、アダプターをRNAにライディングし、アダプター配列にアニールするプライマーを使用してRNAをDNAに転写することを逆にする必要があります。逆転写ステップは、逆転写産物の精製のために、ビオチン化ヌクレオチドを組み込む。逆転写に続いて、製品は尿素-PAGE(図4)によって拡張されていないアダプターから分離する必要があります。次に、逆転写産物を円形化し、PCR増幅する。適切な数のPCRサイクルは、循環積を過剰に増幅してはなりません。過剰増幅はプライマーの枯渇および異常なPCRプロダクトをもたらす(図5、レーン4を参照)。過剰増幅の証拠のない最大の増幅を持つサイクルの数は、大規模なPCR(図5レーン3および図6)に使用するのに最も適しています。
図 1: RIPiT の主な手順を概説する回路図。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: RIPiT RNA をハイスループット シーケンス用のライブラリに変換するためのワークフローを示す回路図。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: RIPiTからのRNAおよびタンパク質収量の推定。(A)RIPiT手順の各主要工程から精製されたタンパク質のウェスタンブロット。(B) フラグ-MAGOH:EIF4AIII RIPiTのRNAフットプリントの自動無線撮影画像を用いて、ピューロマイシン処理細胞と未処理細胞を比較した。赤いボックスは、最終的にシーケンス ライブラリに変換される RNA フットプリント サイズを示します。(C) バイオアナライザを用いて可視化した場合、パネルBのレーン2のようにRIPiTからELPiTから離離されたRNAのプロファイル。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4:10%尿素-PAGEゲルでリジェクトし、金核酸ゲル染色で染色した逆転写(RT)生成物。赤い箱は、拡張RT産物のゲル精製のために取り除かれたゲル領域を示す。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5: 8% 非回電ページで解決されたテスト PCR。14サイクル(赤い箱)に現れる異常な大きなPCR製品と、過剰増幅を示すプライマー(赤い矢印)の並列枯渇に注意してください。この試料について、大規模PCR(青い箱)に対して11サイクルを選択した。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6:大規模なPCRは8%の非脱ニーページで解決されました。赤い箱は、ゲル精製のために切除されたゲル片を示す。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 7: FLAG-MAGOH:EIF4AIIIフットプリントの分布を示すMAPK1遺伝子のゲノムブラウザスクリーンショットは、RIPiTの代表的な結果である。赤い矢印は、期待される正規の EJC 結合部位を示します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| Pbs | 137 mM ナクル 2.7 mM KCl 10 mM Na2HPO4・7H2O KH2PO4 pH 7.4 |
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| クエンチング バッファ | 2.5 M グリシン 2.5 mM トリスベース |
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| 低調圧リシスバッファー (HLB) | 20 mM トリス-HCl pH 7.5 15 mM ナクル 10 mM エダ 0.5% イゲパル 0.1% トリトン-X-100 1xアプロティニン* 1x ルププチン* 1xペプスタチン* 1 mM PMSF (フェニルメチルスルホニルフッ化物) * |
*毎回新鮮に追加する必要があります |
| アイソトニックウォッシュバッファ(IsoWB) | 20 mM トリス-HCl pH 7.5 150 mM ナクル 0.1% イゲパル |
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| コンジュゲーション バッファ | 0.02% ポリソルベート-20 1x PBS |
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| サンプル バッファのクリア | 100 mM トリス-HCl pH 6.8 4% SDS 10 mM エダ |
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| 4xdNTPmix | 0.25 mM dGTP 0.25 mM dTTP 0.175 mM dATP 0.1625 mM dCTP 0.075 mMビオチン-dATP 0.0875 mMビオチンdCTP |
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| 5x ファーストストランド バッファ w/o MgCl2 | 250 mM トリス-HCl pH 8 375 mM KCl |
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| RIPiT希釈バッファー(1 mL) | 1 mL IsoWB 5 μL 200x BSA 20 μL 10% トリトン-X-100 20 μL 0.5M EDTA 1xアプロティニン* 1x ルププチン* 1xペプスタチン* 1 mM PMSF* |
*毎回新鮮に追加する必要があります |
| 2x ローダリングロードバッファ | 3 mL 5x TBE 1.8 g フィコルタイプ 400 尿素 6.3 g 3 mg ブロモフェノール ブルー 3 mg キシレン シアノール 音量を 15 mL ddH2O に調整する |
溶液に入るには、ビーカーに水にチューブを入れ、10-15分ホットプレート上で沸騰させる15 mLにボリュームを調整した後、染料を追加します。 |
| 尿素-ページゲル | 6 M ウレア アクリルアミド:ビサクリアミド(40%[w/v])を適切なパーセンテージに 0.5x TBE 0.01% テメッド |
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| DNA溶出バッファー | 300 mM ナクル 1 mM エダ |
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| ストレプトアビジンビーズウォッシュバッファ | 0.5 M ナオ 20 mM トリス-HCl pH 7.5 1 mM エダ |
表 1: バッファー。
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Discussion
ここでは、RIPiT を正常に実行するための重要な考慮事項について説明します。何よりも、個々の IP を最適化して、各ステップで可能な限り高い効率を実現する必要があります。ここで説明する細胞の入力数に対するFLAGアガロースビーズの量は、我々がテストしたタンパク質の広い範囲に対して堅牢であることが証明されています。パートナータンパク質のほんの一部のみがFLAGタンパク質と共免疫沈殿しているので、効率的な第2のIPに必要な抗体の量は通常低い(10 μg未満)。小規模なRIPiT(10cmプレートから)に続いて、2つの免疫沈殿ステップの間に各画分におけるタンパク質のウェスタンブロット検証は、スケールアップする前に手順の効率と特異性を評価するのに非常に有用であることが証明されます。標的タンパク質と複合体内の他の予想される相互作用タンパク質の両方が溶出中に検出されるべきである。また、枯渇したライザス(FLAG-agaroseまたは磁気ビーズに結合しない)のタンパク質のアッセイは、免疫沈殿効率と複合体に組み立てるタンパク質の割合の良好な推定値を有することも有益です。さらに、この分析は、RnP内のRNA依存性相互作用からRNA依存性相互作用を分離するのにRNase消化条件が十分であるかどうかをも知らせます。したがって、負の制御を含めるのと同じくらい重要であり、理想的には目的のRNPとは無関係のRBPである。たとえば、図3Aでは、HNRNPA1 は入力に存在しますが、RIPiT 溶出では検出されません。HNRNPA1 は、EJC と直接相互作用しないが、EJC および HNRNPA1 が同じ RNA 分子に結合している場合に EJC と間接的に相互作用する RBP です。溶出における陰性対照タンパク質の検出は、RIPiT特異性が不十分であるか、またはRNAフットプリントが不十分である。このような場合、得られたRNAフットプリントは、目的のタンパク質のフットプリントを完全に反映するものではない。サイズ50-200 ntのフットプリントは、その後のRNA-Seq.RNase I処理の持続時間または使用される酵素の量を最適化して、所望のサイズのフットプリントを得るために最適化することができます。最良のシナリオは、目的のサイズ範囲で良好な信号を得ることであり、最も最適な条件でも長く短いRNAを持つことは避けられないことに注意してください。RIPiTは、単一のRBPの結合部位を得るためにも使用することができる。このような場合、同じタンパク質を2つの異なる抗体で免疫沈殿させることができ、まず親和性タグに対して抗体を用いて、次にタンパク質自体に対する抗体を用いて18。最後に、陰性対照RIPiTは、FLAGタグ付き対照タンパク質(例えば、緑色蛍光タンパク質)を第2のIP中の無関係タンパク質に対する抗体と組み合わせて発現する細胞から並行して行うことができる。
多くの利点にもかかわらず、RIPiTアプローチのいくつかの制限、および可能な救済策を考慮することが重要です。最初の精製後の親和性溶出の要件は、タグ付けされたタンパク質を発現するために生物学的源を必要とする。細胞株または目的の生物に部位特異的な組換えシステムが利用できない場合、CRISPR/Casベースのゲノム編集アプローチ19を用いて内因性遺伝子座にFLAGタグ(8アミノ酸)などの短い親和性タグを導入することができる。FLAGタグは、FLAG抗体が親和性溶出に適しており、ホルムアルデヒド架橋と組み合わせて使用できる高いイオン強度および軽度の変性条件に耐えることができるため、このアプローチに理想的なエピトープです。RIPiTアプローチのもう一つの制限は、細胞材料の大規模な入力のための要件です。これは、RBPのほんの一部がRNP内の他のタンパク質と相互作用する可能性が高いので、ある程度は避けられないままであるかもしれません。ライブラリの準備方法を改善すると、大きな入力要件を減らすのに役立ちます。これらのステップをさらに合理化するための考え方としては、2回目のIP洗い流し直後およびRNPの最終溶出の前に、磁気ビーズ上でRNA 3'エンドの脱リン酸化およびアダプタライゲーションを実施することが含まれます。このようなアプローチは、現在のCLIP-Seq手順およびRIPiT20の最近説明されたバリエーションで正常に実装されています。このような変化はまた、ライブラリ準備手順の初期段階からいくつかの時間のかかるRNA精製ステップを削除します。さらに、RNA上のRBPの架橋部位のヌクレオチドレベル分解能を提供するCLIPとは異なり、RIPiTフットプリントの分解能は数十のヌクレオチドのレベルにとどまる。最後に、RPは複数のRRBを含み得るように、RIPiT濃縮RNA部位は、多くのRRBの結合部位の混合物を含む。個々のRBPによって結合されたコンセンサスシーケンスが急速に増加するペースで明らかにされ、現在容易に利用可能である21、22、23として、この情報は、RBPサイトの品揃えをデコンボルブするために利用することができますRIPiT出力で充実。これらの課題にもかかわらず、RIPiT-Seqは、細胞を制御するRNA機械の内部動作に関するユニークな洞察を提供できる動的、不均一、さらには一時的なRNP複合体のRNAフットプリントを捕捉するための効果的な手順です。関数。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
この研究は、NIH助成金GM120209(GS)によってサポートされました。著者らは、OSUCCCゲノミクス共有リソースコアのサービス(CCCサポートグラントNCI P30 CA16058)に感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-FLAG Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| ATP, [γ-32P]- 3,000 Ci/mmol 10 mCi/mL EasyTide, 250 µCi | PerkinElmer | BLU502A250UC | |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (200) | Fisher | 14-823-435 | |
| Betaine 5M | Sigma | B0300 | |
| biotin-dATP | TriLink | N-5002 | |
| biotin-dCTP | Perkin Elmer | NEL540001EA | |
| Branson Sonifier, Model SSE-1 | Branson | ||
| CircLigase I | VWR | 76081-606 | ssDNA ligase I |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher | 11995-065 | |
| DNA load buffer NEB | NEB | ||
| Dynabeads Protein A | LifeTech | 10002D | |
| Flp-In-T-REx 293 Cell Line | ThermoFisher | R78007 | |
| GeneRuler Low Range DNA Ladder | ThermoScientific | FERSM1203 | |
| Hygromycin B | ThermoFisher | 10687010 | |
| Mini-PROTEAN TBE Gel 10 well | Bio-Rad | 4565013 | |
| Mini-PROTEAN TBE-Urea Gel | Bio-Rad | 4566033 | |
| miRCAT-33 adapter 5′-TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGddC-3′ | Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| Mirus transIT-X2 transfection reagent | Mirus | MIR 6004 | |
| Mth RNA ligase | NEB | E2610S | |
| PE1.0 5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| PE2.0 5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTC GGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATC*T-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1, pH 6.7, 100 mLl) | Fisher | BP1752I-100 | |
| Purple Gel Loading Dye (6x) | NEB | NEB #7025 | |
| Q5 DNA Polymerase | NEB | M0491S/L | |
| RNase I, E. coli, 1,000 U | Eppicenter | N6901K | |
| SPIN-X column | Corning | CLS8160-24EA | |
| Streptavidin beads | ThermoFisher | 60210 | |
| Superscript III (SSIII) | ThermoScientific | 18080044 | reverse transcriptase enzyme |
| SybrGold | ThermoFisher | S11494 | gold nucleic acid gel stain |
| T4 Polynucleotide Kinase-2500U | NEB | M0201L | |
| T4RNL2 Tr. K227Q | NEB | M0351S | |
| Tetracycline | Sigma | 87128 | |
| Thermostable 5´ App DNA/RNA Ligase | NEB | M0319S | |
| TruSeq_SE1 5′-pGGCACTANNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE10 5′-pGGTGTTCNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE11 5′-pGGTAAGTNNNNNAGATCGGAA GAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE12 5′-pGGAGATGNNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE2 5′-pGGGTAGCNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE35′-pGGTCGATNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE4 5′-pGGCCTCGNNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE5 5′-pGGTGACANNNNNAGATCGGAAGA GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE6 5′-pGGTAGACNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE7 5′-pGGGCCCTNNNNNAGATCGGAAG AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCT TCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE8 5′-pGGATCGGNNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTT CCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| TruSeq_SE9 5′-pGGACTGANNNNNAGATCGGAAGAG CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′ |
Any | this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform | |
| Typhoon 5 Bimolecular Imager | GE Healthcare Life Science | 29187191 |
References
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