人类肠道器官脂滴形成特征化和定量的荧光测定
Summary
该协议描述了在脂肪酸刺激下人体肠道器官中脂液滴（LD）形成的表征测定。我们讨论了这种测定如何用于LD形成定量，以及如何用于影响LD形成的药物的高通量筛选。
Abstract
膳食脂质被肠道上皮作为游离脂肪酸（FAs）。这些FA在细胞内转化为甘油三酯（TG）分子，然后被包装成胆小微子，以输送到淋巴或细胞体脂液滴（LDs），用于细胞内储存。在TG合成的最后一步中，二乙二醇丙酸酶（DGAT）的催化活性是LD的形成的关键步骤。LD对缓冲有毒脂质物种和调节不同细胞类型的细胞代谢非常重要。由于人类肠道上皮经常面临高浓度的脂质，LD形成对于调节平衡非常重要。在这里，我们描述了一个简单的测定，在人类肠道有机体中最常见的不饱和脂肪酸（油酸）刺激时，对LD形成（LDF）的表征和定量。LDF 测定基于 LD 特异性荧光染料 LD540，它允许通过共聚焦显微镜、荧光板读取器或流式细胞测定对 LD 进行定量。LDF测定可用于表征人类肠道上皮细胞的LD形成，或研究影响LD代谢的人类（遗传）疾病，如DGAT1缺乏症。此外，这种测定也可用于高通量管道，以测试新的治疗化合物，恢复肠道或其他类型的有机体LD形成的缺陷。
Introduction
脂质是人类饮食的重要组成部分，在系统能量储存和代谢中起着重要的作用。摄入时，膳食脂质通过胰腺脂肪酶降解为游离脂肪酸（FFA）和单甘油酯（MGs）。这些基质然后由肠道上皮的肠细胞吸收，它们首先通过单甘油酯丙酸酶（MGAT）酶重新酯化为二甘油酯（DG），然后通过二乙醇对甘油三酯（TG）进行再酯化乙酰转移酶 1 （DGAT1）1.最后，这些TG被集成到用于出口到淋巴系统的奇洛微米或细胞体脂滴（LDs）用于细胞内存储2，3。虽然需要血小微子将膳食脂质分给其他器官，但细胞内脂肪储存在LD中的重要性并不完全清楚。然而，LDs已被证明在肠道中执行调节功能，因为它们在餐4后缓慢释放脂质到循环16小时。此外，LD已被证明可以防止有毒脂肪酸浓度，如在脂肪条件5小鼠脂肪细胞中。
DGAT1蛋白位于内质视网膜（ER）膜上，在肠道上皮的LD形成中起着至关重要的作用。DGAT1 中的同源突变导致早发性严重腹泻和/或呕吐、低白蛋白血症和/或（致命）蛋白质损失的肠病，在脂肪摄入时出现肠道衰竭，说明 DGAT1 在人体脂质平衡中的重要性肠道上皮6，7，8，9，10。由于DGAT1缺乏症很少发生在人类身上，因此很少获得原发性患者衍生的细胞。此外，肠道上皮细胞的长期培养长期仅限于肿瘤衍生的细胞系，这些细胞系只代表正常生理。因此，DGAT1介导LD的形成主要研究在成纤维细胞或动物源细胞系7，10，11，12。因此，最近显示，DGAT1缺乏患者衍生成纤维细胞积累较少的LD与健康控制细胞在刺激后用油酸（OA）8。
以前，建立协议，培养从任何胃肠道器官的上皮干细胞的形式三维（3D）有机体13。这些肠道器官可以长期保存在培养中13，并允许功能研究患者和肠道位置特异性上皮特征14。它们是遗传和表观稳定的，可以储存，允许长期扩张和生物库13。
我们最近证明，LD形成可以很容易地在人体肠道器官在LD形成（LDF）测定6中测量。当暴露于OA16小时，有机体产生LD，以保护细胞免受脂质引起的毒性。当OA浓度过高时，细胞通过卡巴塞介导凋亡6死亡。LDF测定先前证明主要依赖于DGAT1，如从DGAT1突变患者中提取的有机体以及使用DGAT1特异性抑制剂6所指示的。
对于此处详细描述的 LDF 测定，3D 有机体通过肠道活检培养，每周通过中断进入容易形成新有机物的单细胞。为了运行LDF测定，在24孔板的每个孔中镀有7，500个有机物衍生的单细胞。有机体在几天内形成，用1mM OA孵育过夜，并沾染LD540，一种荧光细胞渗透LD特异性染料，便于成像。然后，通过共聚焦显微镜、荧光板读取器或流式细胞仪对 LD 形成进行量化。
通过将此 LD 形成测定扩展至 96 井格式，该测定还可用于 LD 结型的高通量分析，以筛选影响人类肠道器官培养中 LD 形成的新药物，或研究影响 （人类遗传） 疾病LD 代谢。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里，我们提供一个协议，以确定在用油酸孵育时人类肠道器官的LD形成。该方法基于LD特异性荧光染料LD54018，它允许在有机体培养物内对脂液滴的总体积进行表征和定量。建立和维持人类肠道器官培养的程序已于13日前公布，并可提供该协议的视觉指南以及15。
该协议的关键步骤是人体肠道器官的培养，以及OA与BSA的适…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢B.Spee慷慨地提供LD540。这项工作得到了荷兰科学研究组织赠款的支持。VIDI 016.146.353） 到 S.M.
Materials
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-028 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Basement membrane matrix (matrigel) | BD Biosciences | 356231 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | |
| DGAT1 inhibitor (AZD 3988) | Tocris Bioscience | 4837/10 | |
| Fatty acid free BSA | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Formaldehyde | Klinipath | 4078-9001 | |
| Glutamin (GlutaMAX, 100X) | Gibco | 15630-056 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630-080 | |
| laser scanning confocal microscope | Leica | SP8X | |
| LD540 | kindly provided by Dr. B. Spee, Utrecht University | ||
| mEGF | Peprotech | 315-09_500ug | |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-100G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500G | |
| Noggin producing cells (HEK293-mNoggin-Fc cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008-5G | |
| p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | Sigma-Aldrich | S7067-25MG | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| PBS without Ca2+/Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/ml) | Gibco | 15070-063 | |
| R-spondin producing cells (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells) | R&D systems | 3710-001-01 | |
| TC-treated 24 well plates | Greiner-One | 662160 | |
| TC-treated black clear-bottom 96 well plates | Corning Life Sciences | 353219 | |
| TGFb type I receptor inhibitor (A83-01) | Tocris Bioscience | 2939/10 | |
| Trypsin (TrypLE Express) | Life Technologies | 12604021 | |
| WNT-3A producing cells (L-Wnt-3A cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor) | Abcam | ab120129-10 |
References
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