Флуоресценция основе анализа для характеристики и количественной оценки образования липидных капель в кишечных органоидов человека
Summary
Этот протокол описывает анализ для характеристики липидных капель (LD) формирования в человеческих кишечных органоидов при стимуляции жирными кислотами. Мы обсуждаем, как этот анализ используется для количественной оценки образования ЛД, и как он может быть использован для высокой пропускной связи скрининга на наркотики, которые влияют на образование ЛД.
Abstract
Диетические липиды принимаются в качестве свободных жирных кислот (ФА) кишечным эпителием. Эти FAs внутриклеточные преобразуются в молекулы триглицеридов (TG), прежде чем они упакованы в chylomicrons для транспортировки в лимфу или в цитосолитовые липидные капли (ЛД) для внутриклеточного хранения. Решающим шагом для формирования ЛД является каталитическая активность диацилглицерола ацилтрансферазы (DGAT) в заключительном этапе синтеза TG. LDs важны для буфера токсичных видов липидов и регулировать клеточный метаболизм в различных типах клеток. Так как человеческий кишечный эпителий регулярно сталкивается с высокой концентрацией липидов, образование ЛД имеет большое значение для регулирования гомеостаза. Здесь мы описываем простой анализ для характеристики и количественной оценки образования ЛД (ЛДФ) при стимуляции с наиболее распространенными ненасыщенными жирными кислотами, олеиновой кислотой, в кишечных органоидах человека. Анализ LDF основан на LD-специфическом флуоресцентном красителе LD540, который позволяет количественно оценивать LDs конфокальной микроскопией, флуоресцентным считыванием пластин, или цитометрией потока. Анализ LDF может быть использован для характеристики образования ЛД в кишечных эпителиальных клетках человека, или для изучения человеческих (генетических) расстройств, которые влияют на метаболизм ЛД, таких как дефицит DGAT1. Кроме того, этот анализ может также быть использован в высокой пропускной связи для тестирования новых терапевтических соединений, которые восстанавливают дефекты в образовании ЛД в кишечнике или других типах органоидов.
Introduction
Липиды являются важнейшим компонентом рациона человека и играют важную роль в системном хранении энергии и обмене веществ. При попавании, диетические липиды деградируют в свободные жирные кислоты (FFAs) и моноглицериды (MGs) поджелудочной липасы. Эти субстраты затем принимаются энтероцитов кишечного эпителия, где они впервые повторно эстерикрины диглицеридов (DG) моноглицерид acyltransferases (MGAT) ферментов, а затем триглицеридов (TG) по диацилглицерола ацилтрансфераза 1 (DGAT1)1. Наконец, эти TGs интегрированы в либо хиломикроны для экспорта в лимфодренаж или цитосолико липидных капель (LDs) для внутриклеточного хранения2,3. Хотя хиломикроны необходимы для распространения диетических липидов в другие органы, важность внутриклеточного хранения жира в ЛД не совсем ясно. Тем не менее, LDs было показано, чтобы выполнять регулятивные функции в кишечнике, так как они медленно высвобождают липиды в циркуляцию до 16 ч после еды4. Кроме того, Было показано, что ЛД защищают от токсичных концентраций жирных кислот, таких как адипоциты мыши во время липолицовых состояний5.
Белок DGAT1 расположен на эндоплазмической мембране ретикулума (ER) и играет решающую роль в формировании ЛД в эпителии кишечника. Гомозиготные мутации в DGAT1 приводят к раннему началу тяжелой диареи и/или рвоты, гипоальбуминемии и/или (смертельной) белково-терпящей энтеропатии с кишечной недостаточностью при жировом наедевидеи, иллюстрируя важность DGAT1 в липидном гомеостазах человека кишечный эпителий6,7,8,9,10. Поскольку возникновение дефицита DGAT1 у людей встречается редко, доступ к первичным клеткам, полученным пациентом, был скудным. Кроме того, долгосрочная культура кишечных эпителиальных клеток уже давно ограничивается опухолевыми клеточными линиями, которые представляют нормальную физиологию только в ограниченном плане. Таким образом, DGAT1-опосредованного образования ЛД в основном были изучены в фибробластов или животных полученных клеточных линий7,10,11,12. Таким образом, недавно было показано, что DGAT1-дефицитных пациента полученных фибробластов накапливаются меньше LDs по сравнению со здоровыми контрольными клетками после стимуляции с олеиновой кислотой (ОА)8.
Ранее были установлены протоколы для культуры эпителиальных стволовых клеток из любого желудочно-кишечного органа в виде трехмерных (3D) органоидов13. Эти кишечные органоиды могут храниться в культуре в течение длительного периода времени13, и позволяют функциональное исследование пациента и кишечного расположения конкретных эпителиальных характеристик14. Они генетически и фенотипически стабильны и могут храниться, что позволяет долгосрочное расширение и биобанкинг13.
Недавно мы показали, что образование ЛД может быть легко измерено в кишечных органоидов человека в формировании ЛД (LDF) анализ6. При воздействии ОА в течение 16 ч органоиды генерируют ЛД для защиты клеток от липидной токсичности. Когда концентрации ОА слишком высоки, клетки умирают от каспасопо-опосредованного апоптоза6. Ранее было показано, что ассси LDF в значительной степени зависит от DGAT1, о чем свидетельствуют органоиды, полученные от пациентов DGAT1-мутантов и использование ингибиторов DGAT1-специфических6.
Для анализа LDF, подробно описанного здесь, 3D органоиды культивируются из кишечной биопсии и проходят еженедельно путем нарушения в одиночных клетках, которые легко образуют новые органоиды. Для выполнения dF-ассссса, 7500 одиночных клеток, полученных от органоидов, покрываются в каждом колодце 24-колодца пластины. Органоиды образуются в течение нескольких дней, инкубируется на ночь с 1 мМ ОА и окрашенных LD540, флуоресцентные клетки проницаемой LD-специфический краситель, который облегчает визуализацию. Формирование ЛД затем количественно конфокальной микроскопии, флуоресцентные пластины читателя, или поток цитометрии.
Путем масштабировать это испытание образования LD к формату 96-наилучшим образом, анализ можно также использовать для высокопроемного анализа образования LD для того чтобы экранировать для новых снадобиь которые влияют на образование LD в людских кишечных органоидных культурах, или изучить (людской генетические) разлады которые влияют на Метаболизм ЛД.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы предоставляем протокол для определения образования ЛД в кишечных органоидах человека при инкубации олеиновой кислотой. Этот метод основан на LD-специфическом флуоресцентном красителе LD54018, который позволяет охарактеризовать и количественно определить общий объ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим B. Spee за щедрое предоставление LD540. Эта работа была поддержана Нидерландской организацией по научным исследованиям гранта (НВО-ЗонМ; VIDI 016.146.353) до S.M.
Materials
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-028 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Basement membrane matrix (matrigel) | BD Biosciences | 356231 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | |
| DGAT1 inhibitor (AZD 3988) | Tocris Bioscience | 4837/10 | |
| Fatty acid free BSA | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Formaldehyde | Klinipath | 4078-9001 | |
| Glutamin (GlutaMAX, 100X) | Gibco | 15630-056 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630-080 | |
| laser scanning confocal microscope | Leica | SP8X | |
| LD540 | kindly provided by Dr. B. Spee, Utrecht University | ||
| mEGF | Peprotech | 315-09_500ug | |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-100G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500G | |
| Noggin producing cells (HEK293-mNoggin-Fc cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008-5G | |
| p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | Sigma-Aldrich | S7067-25MG | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| PBS without Ca2+/Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/ml) | Gibco | 15070-063 | |
| R-spondin producing cells (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells) | R&D systems | 3710-001-01 | |
| TC-treated 24 well plates | Greiner-One | 662160 | |
| TC-treated black clear-bottom 96 well plates | Corning Life Sciences | 353219 | |
| TGFb type I receptor inhibitor (A83-01) | Tocris Bioscience | 2939/10 | |
| Trypsin (TrypLE Express) | Life Technologies | 12604021 | |
| WNT-3A producing cells (L-Wnt-3A cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor) | Abcam | ab120129-10 |
References
- Yen, C. L. E., Nelson, D. W., Yen, M. I. Intestinal triacylglycerol synthesis in fat absorption and systemic energy metabolism. Journal of Lipid Research. 56 (3), 489-501 (2015).
- Yen, C. L. E., Stone, S. J., Koliwad, S., Harris, C., Farese, R. V. Thematic review series: glycerolipids. DGAT enzymes and triacylglycerol biosynthesis. Journal of Lipid Research. 49 (11), 2283-2301 (2008).
- D’Aquila, T., Hung, Y. H., Carreiro, A., Buhman, K. K. Recent discoveries on absorption of dietary fat: Presence, synthesis, and metabolism of cytoplasmic lipid droplets within enterocytes. Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (8 Pt A), 730-747 (2016).
- Chavez-Jauregui, R. N., Mattes, R. D., Parks, E. J. Dynamics of fat absorption and effect of sham feeding on postprandial lipema. Gastroenterology. 139 (5), 1538-1548 (2010).
- Chitraju, C., et al. Triglyceride Synthesis by DGAT1 Protects Adipocytes from Lipid-Induced ER Stress during Lipolysis. Cell Metabolism. 26 (2), 407-418 (2017).
- van Rijn, J. M., et al. Intestinal failure and aberrant lipid metabolism in patients with DGAT1 deficiency. Gastroenterology. 1, 130-143 (2018).
- Haas, J. T., et al. DGAT1 mutation is linked to a congenital diarrheal disorder. Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4680-4684 (2012).
- Gluchowski, N. L., et al. Identification and characterization of a novel DGAT1 missense mutation associated with congenital diarrhea. Journal of Lipid Research. 58 (6), 1230-1237 (2017).
- Ratchford, T. L., Kirby, A. J., Pinz, H., Patel, D. R. Congenital Diarrhea From DGAT1 Mutation Leading to Electrolyte Derangements, Protein-losing Enteropathy, and Rickets. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 66 (3), e82-e83 (2018).
- Stephen, J., et al. Congenital protein losing enteropathy: an inborn error of lipid metabolism due to DGAT1 mutations. European Journal of Human Genetics. 24 (9), 1268-1273 (2016).
- Schlegel, C., et al. Reversible deficits in apical transporter trafficking associated with deficiency in diacylglycerol acyltransferase. Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (11), 879-892 (2018).
- Wilfling, F., et al. Triacylglycerol synthesis enzymes mediate lipid droplet growth by relocalizing from the ER to lipid droplets. Developmental Cell. 24 (4), 384-399 (2013).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Middendorp, S., et al. Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function. Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. Journal of Visualized Experiments. (120), e55159 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Spandl, J., White, D. J., Peychl, J., Thiele, C. Live cell multicolor imaging of lipid droplets with a new dye, LD540. Traffic. 10 (11), 1579-1584 (2009).
- Hung, Y. H., Carreiro, A. L., Buhman, K. K. Dgat1 and Dgat2 regulate enterocyte triacylglycerol distribution and alter proteins associated with cytoplasmic lipid droplets in response to dietary fat. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (6), 600-614 (2017).
