인간 장 유기체에서 지질 방울 형성의 특성화 및 정량화를 위한 형광 기반 분석
Summary
이 프로토콜은 지방산으로 자극시 인간의 장 유기 체에서 지질 방울 (LD) 형성의 특성에 대한 분석서를 설명합니다. 우리는 이 분석제가 LD 형성의 정량화를 위해 어떻게 이용되는지, 그리고 어떻게 LD 대형에 영향을 미치는 약에 대한 높은 처리량 검열을 위해 사용될 수 있는지 토론합니다.
Abstract
식이 지질은 장 상피에 의해 자유 지방산 (FA)으로 채택됩니다. 이 FA는 세포내 트리글리세라이드(TG) 분자로 전환되며, 림프로 운반하기 위해 chylomicrons로 포장되기 전에 또는 세포내 저장을 위해 세포내 지질 방울(LDs)으로 운반됩니다. LDs의 형성을 위한 결정적인 단계는 TG 합성의 마지막 단계에서 디아실리세롤 아실트랜스퍼라제(DGAT)의 촉매 활성이다. LDs는 독성 지질 종을 버퍼링 하 고 다른 세포 유형에 세포 대사를 조절 하는 것이 중요 하다. 인간의 장 상피는 정기적으로 지질의 높은 농도 직면 하기 때문에, LD 형성항상성을 조절 하는 것이 매우 중요 하다. 여기에서 우리는 인간 장 오르가노이드에서 가장 일반적인 불포화 지방산, 올레산으로 자극시 LD 형성 (LDF)의 특성화 및 정량화에 대한 간단한 분석서를 설명합니다. LDF 분석법은 공초점 현미경, 형광 판 판독기 또는 유세포 측정에 의한 LD의 정량화를 허용하는 LD 특이적 형광 염료 LD540을 기반으로 합니다. LDF 분석실험은 인간 장 상피 세포에서 LD 형성을 특성화하거나 DGAT1 결핍과 같은 LD 대사에 영향을 미치는 인간(유전적) 장애를 연구하는 데 사용될 수 있다. 또한, 이 분석실험은 또한 장 내 또는 다른 유형의 오르가노이드에서 LD 형성의 결함을 복원하는 새로운 치료 화합물을 테스트하기 위해 높은 처리량 파이프 라인에서 사용될 수 있습니다.
Introduction
지질은 인간의 식단의 중요한 구성 요소이며 전신 에너지 저장 및 신진 대사에 중요한 역할을합니다. 섭취 할 때, 식이 지질은 췌장 리파스에 의해 자유 지방산 (FFAs) 및 모노 글리세라이드 (MGs)로 저하됩니다. 이 기질은 그 때 장 상피의 장세포에 의해 채택되고, 여기서 그(것)들은 단글리세라이드 acyltransferases (MGAT) 효소에 의해 diglycerides (DG)에 처음으로 재에스테르화되고 그 후에 diacyglycerol에 의해 트리글리세라이드 (TG)에 아실트랜스퍼라제 1 (DGAT1)1. 마지막으로, 이들 TGs는 세포내 저장을 위한 림프계 또는 세포질 지질 방울(LDs)으로 수출하기 위한 chylomicrons중하나에 통합되어2,3. 다른 장기에 식이 지질을 배포 하는 chylomicrons 필요 하지만, LDs에 세포 내 지방 저장의 중요성은 완전히 명확 하지 않습니다. 그러나, LDs는 식사 후 16 시간까지 순환으로 지질을 천천히 방출하기 때문에 장에서 조절 기능을 수행하는 것으로 나타났습니다4. 더욱이, LDs는지방분해조건5 동안 마우스 지방세포와 같은 독성 지방산 농도로부터 보호하는 것으로 나타났다.
DGAT1 단백질은 내구 성 망막 (ER) 막에 위치하고 장 상피에서 LD 형성에 중요한 역할을한다. DGAT1의 동형접합 돌연변이는 조기 발병 심한 설사 및 구토, 저알부민혈증 및/또는 (치명적인) 단백질 손실 장 부전으로 이어질 수 있으며, 인간의 지질 항상성에서 DGAT1의 중요성을 보여줍니다. 장 상피6,7,8,9,10. 인간에 있는 DGAT1 부족의 발생은 희소하기 때문에, 1 차적인 참을성 있는 파생한 세포에 접근은 부족했습니다. 더욱이, 장 상피 세포의 장기 배양은 정상 생리학을 나타내는 종양 유래 세포주로 오랫동안 제한되어 제한된 연장으로만 제한되어 왔다. 따라서, DGAT1-매개 LD 형성은 주로 섬유아세포 또는 동물 유래 세포주7,10,11,12에서연구되었다. 이와 같이, 최근 DGAT1 결핍 환자 유래 섬유아세포가 올레산(OA)을 사용하여 자극한 후 건강한 대조군 세포에 비해 LDs가 적게 축적되는 것으로 나타났다8.
이전에는 3차원(3D)오르가노이드(13)의형태로 임의의 위장관 기관으로부터 상피 줄기 세포를 배양하는 프로토콜이 확립되었다. 이러한 장내 오르가노이드는13시간동안 배양물에서 유지될 수 있으며, 환자 및 장위치특이적 상피특성(14)의 기능적 연구를 가능하게 한다. 그(것)들은 유전으로 그리고 현상전적으로 안정하고 저장될 수 있고, 장기 확장 및 biobanking13를허용하.
우리는 최근에 LD 대형이 LD 형성 (LDF) 분석실험에서 인간 장 오르가노이드에서쉽게 측정될 수 있다는 것을 입증했습니다. 16 시간 동안 OA에 노출되면, 오르가노이드는 지질 유발 독성으로부터 세포를 보호하기 위해 LDs를 생성합니다. OA 농도가 너무 높으면 카스파제 매개 세포사멸6에의해 세포가 죽습니다. LDF 분석결과는 이전에 DGAT1 돌연변이 환자로부터 유래된 오르가노이드및 DGAT1 특이적억제제6의사용에 의해 지시된 바와 같이 DGAT1에 크게 의존하는 것으로 나타났다.
여기에서 자세히 기술된 LDF 분석의 경우, 3D 오르가노이드는 장 생검에서 배양되며 새로운 오르가노이드를 쉽게 형성하는 단일 세포로의 중단에 의해 매주 통과됩니다. LDF 분석을 실행하기 위해, ~7,500 개의 오르가노이드 유래 단일 세포는 24 웰 플레이트의 각각의 웰에서 도금된다. 오르가노이드는 며칠에 걸쳐 형성되고, 1 mM OA로 밤새 배양되고, 화상 진찰을 용이하게 하는 형광 세포 투과성 LD 특이적 염료인 LD540으로 염색됩니다. LD 형성은 공초점 현미경 검사법, 형광 판 리더, 또는 유세포 측정에 의해 정량화됩니다.
이 LD 형성 분석을 96 웰 형식으로 스케일링함으로써, 분석은 또한 인간의 장 유기 체 형 에서 LD 형성에 영향을 미치는 새로운 약물을 선별하는 LD 형성의 높은 처리량 분석에 사용할 수 있습니다, 또는 연구 (인간 유전) 장애에 영향을 미치는 LD 신진 대사.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서, 우리는 올레산으로 배양시 인간 장 오르가노이드에서 LD 형성을 결정하는 프로토콜을 제공한다. 이 방법은 LD 특이적 형광 염료 LD54018을기반으로 하며, 이는 오르가노이드 배양 내의 지질 방울의 총 부피의 특성화 및 정량화를 가능하게 한다. 인간의 장 내 오르가노이드 문화를 확립하고 유지하는 절차는13이전에 발표되었으며,이 프로토콜의 시각적 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LD540을 아낌없이 제공해 주신 B. Spee에게 감사드립니다. 이 작품은 과학 연구 보조금에 대한 네덜란드 조직에 의해 지원되었다 (NWO-ZonMW; VIDI 016.146.353) – S.M.
Materials
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-028 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Basement membrane matrix (matrigel) | BD Biosciences | 356231 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | |
| DGAT1 inhibitor (AZD 3988) | Tocris Bioscience | 4837/10 | |
| Fatty acid free BSA | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Formaldehyde | Klinipath | 4078-9001 | |
| Glutamin (GlutaMAX, 100X) | Gibco | 15630-056 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630-080 | |
| laser scanning confocal microscope | Leica | SP8X | |
| LD540 | kindly provided by Dr. B. Spee, Utrecht University | ||
| mEGF | Peprotech | 315-09_500ug | |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-100G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500G | |
| Noggin producing cells (HEK293-mNoggin-Fc cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008-5G | |
| p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | Sigma-Aldrich | S7067-25MG | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| PBS without Ca2+/Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/ml) | Gibco | 15070-063 | |
| R-spondin producing cells (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells) | R&D systems | 3710-001-01 | |
| TC-treated 24 well plates | Greiner-One | 662160 | |
| TC-treated black clear-bottom 96 well plates | Corning Life Sciences | 353219 | |
| TGFb type I receptor inhibitor (A83-01) | Tocris Bioscience | 2939/10 | |
| Trypsin (TrypLE Express) | Life Technologies | 12604021 | |
| WNT-3A producing cells (L-Wnt-3A cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor) | Abcam | ab120129-10 |
References
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