Un test basé sur la fluorescence pour la caractérisation et la quantification de la formation de gouttelettes lipidiques chez les organoïdes intestinaux humains
Summary
Ce protocole décrit un test pour la caractérisation de la formation de gouttelettes lipidiques (LD) dans les organoïdes intestinaux humains lors de la stimulation avec des acides gras. Nous discutons de la façon dont cet analyse est utilisé pour la quantification de la formation de LD, et comment il peut être utilisé pour le dépistage à haut débit pour les médicaments qui affectent la formation de LD.
Abstract
Les lipides alimentaires sont pris comme acides gras libres (AF) par l’épithélium intestinal. Ces FUR sont intracellulairement convertis en molécules de triglycérides (TG), avant d’être emballés dans des chylomicrons pour le transport vers la lymphe ou en gouttelettes lipidiques cytosoliques (LD) pour le stockage intracellulaire. Une étape cruciale pour la formation des LDest l’activité catalytique des acyltransferases de diacylglycérol (DGAT) dans l’étape finale de la synthèse de TG. Les LD sont importants pour amortir les espèces lipidiques toxiques et réguler le métabolisme cellulaire dans différents types de cellules. Puisque l’épithélium intestinal humain est régulièrement confronté à des concentrations élevées de lipides, la formation de LD est d’une grande importance pour réguler l’homéostasie. Ici nous décrivons un test simple pour la caractérisation et la quantification de la formation de LD (LDF) sur la stimulation avec l’acide gras insaturé le plus commun, l’acide oliétique, dans les organoïdes intestinaux humains. L’analyse LDF est basée sur le colorant fluorescent LD540 spécifique à LD, qui permet la quantification des LD par microscopie confocale, lecteur de plaque fluorescente, ou cytométrie de flux. L’analyse de LDF peut être employée pour caractériser la formation de LD dans les cellules épithéliales intestinales humaines, ou pour étudier les désordres humains (génétiques) qui affectent le métabolisme de LD, tels que l’insuffisance de DGAT1. En outre, cet essai peut également être employé dans un pipeline à haut débit pour tester de nouveaux composés thérapeutiques, qui restaurent des défauts dans la formation de LD dans l’intestin ou d’autres types d’organoïdes.
Introduction
Les lipides sont un élément crucial de l’alimentation humaine et jouent un rôle important dans le stockage et le métabolisme de l’énergie systémique. Lorsqu’ils sont ingérés, les lipides alimentaires sont dégradés en acides gras libres (AFF) et en monoglycérides (GM) par des lipases pancréatiques. Ces substrats sont ensuite repris par les entéroocytes de l’épithélium intestinal, où ils sont d’abord réestérifiés aux diglycérorides (DG) par des enzymes d’acyltransferases monoglycérides (MGAT) et par la suite aux triglycérides (TG) par le diacylglycérol par le diacylglycérol acyltransferase 1 (DGAT1)1. Enfin, ces TG sont intégrés soit dans les chylomicrons pour l’exportation vers le système lymphatique ou les gouttelettes lipidiques cytosoliques (LD) pour le stockage intracellulaire2,3. Bien que les chylomicrons soient nécessaires pour distribuer les lipides diététiques à d’autres organes, l’importance du stockage intracellulaire de graisse dans des LDs n’est pas complètement claire. Cependant, LDs ont été montrés pour effectuer une fonction de régulation dans l’intestin, car ils libèrent lentement des lipides dans la circulation jusqu’à 16 h après un repas4. En outre, lDs ont été montrés pour se protéger contre les concentrations toxiques d’acide gras, telles que dans les adipocytes de souris pendant des conditions lipolytiques5.
La protéine DGAT1 est située sur la membrane du réticulum endoplasmique (ER) et joue un rôle crucial dans la formation de LD dans l’épithélium intestinal. Les mutations homozygous dans DGAT1 mènent à la diarrhée grave tôt-début et/ou au vomissement, à l’hypoalbuminemia, et/ou (fatal) entéropathie protéine-perdante avec l’échec intestinal sur la prise de graisse, illustrant l’importance de DGAT1 dans l’homéostasie de lipide de l’humain épithélium intestinal6,7,8,9,10. Puisque l’occurrence de DGAT1-deficiency chez l’homme est rare, l’accès aux cellules patient-dérivées primaires a été rare. En outre, la culture à long terme des cellules épithéliales intestinales a longtemps été limitée aux lignées cellulaires dérivées de tumeurs qui ne représentent la physiologie normale que dans une extension limitée. Par conséquent, la formation de LD DGAT1-négociée a été principalement étudiée dans les fibroblastes ou les lignées cellulaires d’origine animale7,10,11,12. En tant que tel, il a été récemment démontré que les fibroblastes d’origine patiente DGAT1 accumulent moins de LD que les cellules témoins saines après stimulation avec de l’acide oleique (OA)8.
Auparavant, des protocoles ont été établis pour la culture des cellules souches épithéliales de tout organe gastro-intestinal sous la forme d’organoïdes tridimensionnels (3D)13. Ces organoïdes intestinaux peuvent être maintenus en culture pendant une longue période de temps13, et permettent l’étude fonctionnelle des caractéristiques épithéliales spécifiques au patient et à l’intestin14. Ils sont génétiquement et phénotypiquement stables et peuvent être stockés, permettant l’expansion à long terme et la biobanque13.
Nous avons récemment démontré que la formation de LD peut être facilement mesurée dans les organoïdes intestinaux humains dans une formation de LD (LDF) analyse6. Lorsqu’ils sont exposés à l’arthrose pendant 16 h, les organoïdes génèrent des LD pour protéger les cellules contre la toxicité induite par les lipides. Lorsque les concentrations d’arthrose sont trop élevées, les cellules meurent par apoptose à médiation caspase6. L’assay de LDF a été précédemment montré pour être en grande partie dépendant de DGAT1 comme indiqué par des organoïdes dérivés des patients DGAT1-mutants et par l’utilisation des inhibiteurs DGAT1-spécifiques6.
Pour l’analyse LDF décrite en détail ici, les organoïdes 3D sont cultivés à partir de biopsies intestinales et sont passés chaque semaine par perturbation en cellules individuelles qui forment facilement de nouveaux organoïdes. Pour l’exécution de l’assidu, 7 500 cellules uniques d’origine organoïde sont plaquées dans chaque puits d’une plaque de 24 puits. Les organoïdes sont formés sur plusieurs jours, incubés pendant la nuit avec 1 mM d’arthrose et tachés de LD540, un colorant fluorescent perméable lD-spécifique qui facilite l’imagerie. La formation LD est ensuite quantifiée par microscopie confocale, lecteur de plaque fluorescente, ou cytométrie de flux.
En évoluant cette analyse de formation de LD à un format de 96 puits, l’analyse peut également être employée pour l’analyse à haut débit de la formation de LD pour dépister de nouveaux drogues qui affectent la formation de LD dans les cultures d’organoïdes intestinaux humains, ou pour étudier les désordres (génétiques humains) qui affectent Métabolisme LD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous fournissons un protocole pour déterminer la formation de LD dans les organoïdes intestinaux humains lors de l’incubation avec l’acide oleique. Cette méthode est basée sur le colorant fluorescent LD54018, qui permet de caractériser et de quantifier le volume total de gouttelettes lipidiques dans une culture organoïde. Les procédures d’établissement et de maintien des cultures d’organoïdes intestinaux humains ont été publiées avant13, et un guide visuel …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions B. Spee d’avoir généreusement fourni LD540. Ce travail a été soutenu par une subvention de l’Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO-ZonMW; VIDI 016.146.353) à S.M.
Materials
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-028 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Basement membrane matrix (matrigel) | BD Biosciences | 356231 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | |
| DGAT1 inhibitor (AZD 3988) | Tocris Bioscience | 4837/10 | |
| Fatty acid free BSA | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Formaldehyde | Klinipath | 4078-9001 | |
| Glutamin (GlutaMAX, 100X) | Gibco | 15630-056 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630-080 | |
| laser scanning confocal microscope | Leica | SP8X | |
| LD540 | kindly provided by Dr. B. Spee, Utrecht University | ||
| mEGF | Peprotech | 315-09_500ug | |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-100G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500G | |
| Noggin producing cells (HEK293-mNoggin-Fc cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008-5G | |
| p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | Sigma-Aldrich | S7067-25MG | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| PBS without Ca2+/Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/ml) | Gibco | 15070-063 | |
| R-spondin producing cells (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells) | R&D systems | 3710-001-01 | |
| TC-treated 24 well plates | Greiner-One | 662160 | |
| TC-treated black clear-bottom 96 well plates | Corning Life Sciences | 353219 | |
| TGFb type I receptor inhibitor (A83-01) | Tocris Bioscience | 2939/10 | |
| Trypsin (TrypLE Express) | Life Technologies | 12604021 | |
| WNT-3A producing cells (L-Wnt-3A cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor) | Abcam | ab120129-10 |
References
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