Summary
La reconstruction oesophagienne est une procédure difficile, et le développement d’un oesophage tissulaire qui permet la régénération de la muqueuse et du muscle oesophagiens et qui peut être implanté comme une greffe artificielle est nécessaire. Ici, nous présentons notre protocole pour générer un oesophage artificiel, y compris la fabrication d’échafaudages, la culture de bioréacteurs, et diverses techniques chirurgicales.
Abstract
L’utilisation de matériaux biocompatibles pour la reconstruction oesophagienne circonférence est une tâche techniquement difficile chez les rats et nécessite une technique d’implant optimale avec un soutien nutritionnel. Récemment, il y a eu beaucoup de tentatives à l’ingénierie oesophagielle de tissu, mais le taux de succès a été limité en raison de la difficulté dans l’épithélisation tôt dans l’environnement spécial du péristaltisme. Ici, nous avons développé un oesophage artificiel qui peut améliorer la régénération de la muqueuse oesophagienne et des couches musculaires à travers un échafaudage tubulaire à deux couches, un système de bioréacteur à base de cellules souches mésenchymales, et une technique d’alimentation de dérivation avec modifié Gastrostomy. L’échafaudage est fait de nanofibres de polyuréthane (PU) en forme cylindrique avec un brin de polycaprolactone imprimé en trois dimensions (3D) enroulé autour de la paroi extérieure. Avant la transplantation, les cellules souches mésenchymales d’origine humaine ont été ensemiées dans le lumen de l’échafaudage, et la culture de bioréacteur a été exécutée pour augmenter la réactivité cellulaire. Nous avons amélioré le taux de survie de greffe en appliquant l’anastomose chirurgicale et couvrant la prothèse implantée avec un aileron de glande thyroïde, suivi de l’alimentation nonorale temporaire de gastrostomy. Ces greffes ont pu récapituler les résultats de l’épithélialization initial et de la régénération de muscle autour des emplacements implantés, comme démontré par l’analyse histologique. En outre, des fibres d’élastine accrues et la néovascularisation ont été observées dans la périphérie de la greffe. Par conséquent, ce modèle présente une nouvelle technique potentielle pour la reconstruction oesophagielle cirférent.
Introduction
Le traitement des désordres oesophagiens, tels que les malformations congénitales et les carcinomes oesophagiens, peut mener à la perte structurale de segment de l’oesophage. Dans la plupart des cas, des greffes de remplacement autologues, telles que des conduits gastriques ou des interpositions du côlon, ont été effectuées1,2. Cependant, ces remplacements oesophagiens ont une variété de complications chirurgicales et de risques de réopération3. Ainsi, l’utilisation d’échafaudages d’œsophage tissulaires imitant l’œsophage indigène peut être une stratégie alternative prometteuse pour finalement régénérer les tissus perdus4,5,6.
Bien qu’un oesophage tissulaire offre potentiellement une alternative aux traitements actuels des défauts oesophagiens, il existe des barrières importantes pour son application in vivo. La fuite anastomotique postopératoire et la nécrose de l’échafaudage oesophagique implanté mènent inévitablement à une infection mortelle de l’espace aseptique environnant, tel que le mediastinum7. Par conséquent, il est extrêmement important de prévenir la contamination des aliments ou de la salive dans la plaie et le tube nasogastrique. La gastrostomie ou la nutrition intraveineuse devrait être envisagée jusqu’à ce que la cicatrisation primaire des plaies soit terminée. À ce jour, l’ingénierie des tissus oesophagiens a été réalisée dans de grands modèles animaux parce que les grands animaux ne peuvent être nourris que par hyperalimentation intraveineuse pendant 2-4 semaines après l’implantation de l’échafaudage8. Cependant, un tel modèle d’alimentation non orale n’a pas été établi pour la survie tôt après la transplantation oesophagienne chez de petits animaux. C’est parce que les animaux étaient extrêmement actifs et incontrôlables, de sorte qu’ils ne pouvaient pas garder le tube d’alimentation dans leur estomac pendant une longue période de temps. Pour cette raison, il y a eu peu de cas de transplantation oesophagique réussie chez de petits animaux.
Compte tenu des circonstances de l’ingénierie des tissus oesophagiens, nous avons conçu un échafaudage tubulaire à deux couches composé de nanofibres électrospun (couche intérieure; Figure 1A) et un brin imprimé en 3D (couche extérieure; Figure 1B) incluant une technique de gastrostomie modifiée. La nanofibre interne est faite de PU, un polymère non dégradable, et empêche les fuites de nourriture et de salive. Les brins imprimés 3D externes sont faits de polycaprolactone biodégradable (PCL), qui peut fournir une flexibilité mécanique et s’adapter au mouvement péristaltique. Des cellules souches mésenchymales dérivées de l’adipose humaine (HAD-MSCs) ont été ensemiées sur la couche interne de l’échafaudage pour favoriser la réépithhéliarisation. La structure nanofibre peut faciliter la régénération muqueuse initiale en fournissant un environnement structurel de matrice extracellulaire (ECM) pour la migration cellulaire.
Nous avons également augmenté le taux de survie et la bioactivité des cellules inoculées grâce à la culture de bioréacteurs. L’échafaudage implanté a été recouvert d’un rabat de glande thyroïde pour permettre une régénération plus stable de la muqueuse oesophagienne et de la couche musculaire. Dans ce rapport, nous décrivons des protocoles pour des techniques d’ingénierie de tissu oesophagées, y compris la fabrication d’échafaudages, la culture de bioréacteur sénchymal à base de cellules souches, une technique d’alimentation de dérivation avec gastrostomy modifié, et une chirurgie modifiée technique d’anastomosis pour la reconstruction oesophagienne circonféide dans un modèle de rat.
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Protocol
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC no 17-0164-S1A0) de l’Hôpital universitaire national de Séoul.
1. Fabrication d’échafaudages
REMARQUE : Les échafaudages oesophagiens à deux couches sont fabriqués en combinant l’électrospinning et l’impression 3D. La membrane interne de l’échafaudage tubulaire a été fabriquée par le polyuréthane électrospinning (PU) avec des mandrels en acier inoxydable rotatifs comme les collecteurs9.
- Pour la préparation des nanofibres tubulaires PU, préparer une solution de 20% (w/v) de polymère PU en remuant dans N,N-dimethylformamide (DMF) pendant 8 h à température ambiante.
- Placez la solution PU sur la seringue à l’aide d’une aiguille métallique émoussée (22 g) et électrospinez sur des mandrels en acier inoxydable rotatifs (diamètre de 2 mm) à une distance de 30 cm entre l’extrémité de l’aiguille et le collecteur rotatif.
REMARQUE : L’alimentation est réglé sur un courant direct à haute tension d’un potentiel de 15 kV. Le taux d’alimentation de la solution est fixé à 0,5 ml/h à l’aide d’une pompe à seringues. - Faire une couche tubulaire de nanofibre sur la surface du mandrel tournant à 3.14 m/s.
- Séchez la nanofibre PU dans un four à vide à 40 oC pendant la nuit pour enlever complètement le solvant résiduel.
REMARQUE : La paroi extérieure imprimée en 3D de l’échafaudage oesophagine est préparée à l’aide d’un système de prototypage rapide. L’équipement d’impression 3D se compose d’un distributeur, d’une buse, d’un contrôleur de compression/chaleur, d’un stade de conversion à 3 axes et d’un système logiciel. - Les granulés de PCL sont dissous à 100 oC dans un cylindre de chauffage, puis imprimés à la surface des nanofibres à haute pression (7 barres) sous le contrôle d’un système de bioplotting. La taille de la buse est de 300 m et la distance du brin est de 700 m.
- Après avoir retiré l’échafaudage à deux couches du mandrel, stériliser en trempant dans 70% d’éthanol sous la lumière ultraviolette.
REMARQUE : Des caractéristiques plus détaillées de l’échafaudage ont été rapportées dans des études antérieures10.
2. Ensemencement cellulaire sur les greffes et la culture de bioréacteurs
REMARQUE : Les cellules souches mésenchymales dérivées de l’adipose humaine (HMSCs) achetées à une entreprise ont été utilisées sans modification.
- Avant la transplantation cellulaire, stériliser l’échafaudage de l’œsophage imprimé en 3D pendant 1 h sous la lumière ultraviolette, mouiller pendant 10 min avec de l’éthanol, et le laver 3x avec du phosphate tamponné saline (PBS).
- Culture et d’élargir les hMSCs dans le milieu de croissance (supplément de moyenne/croissance de base). Des échafaudages tubulaires à deux couches ont été transférés dans 24 plaques de culture de tissu de puits non adhérentes.
- Pour attacher les cellules à la surface intérieure de l’échafaudage, ajouter délicatement la suspension hMSC à une densité de 1 x 106 cellules/mL dans la matrice de membrane du sous-sol contenant le milieu de croissance.
- Déposez uniformément la suspension de la matrice membranaire du sous-sol sur la surface intérieure de l’échafaudage tubulaire à deux couches.
- Fixez fermement l’échafaudage tubulaire ensemencé de hMSC au support acrylique dans la chambre de culture du bioréacteur à l’aide d’un système de bioréacteur à débit pulsatile.
REMARQUE : Le système de bioréacteur conçu sur mesure se compose d’une pompe, d’un piège à bulles, d’une chambre d’écoulement, d’une jauge de pression, d’une soupape contrôlable et d’un réservoir moyen. Lorsque vous appliquez le stress de cisaillement dans la chambre de culture, prévoir un temps de repos de 1-2 min11. - Ajouter le milieu de croissance à la chambre de culture et appliquer 0,1 dyne/cm2 stress de cisaillement induit par le flux sous une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO210.
REMARQUE : La valeur du stress de cisaillement induit par le flux a été calculée en simulant le péristaltisme du tissu oesophagien dérivé du corps humain des études précédentes10. - Déterminer les réponses cellulaires sur les surfaces intérieures des échafaudages tubulaires à deux couches sans culture de bioréacteur après 5 jours à l’aide d’un kit d’analyse de viabilité LIVE/DEAD selon les instructions du fabricant. Obtenir des images par microscopie confocale à l’aide de l’outil Z-stack.
- Le troisième jour, observez la morphologie de surface de l’échafaudage tubulaire ensemié par le hMSC à l’aumicro à balayage (SEM).
- Fixer l’échafaudage qui a été incubé avec hMSC avec 2,5% de glutaraldéhyde et OsO4 pendant 24 h et déshydrater avec de l’éthanol.
- Enrober les HMSC fixes de platine à l’aide d’un enduit de creusdans dans des conditions atmosphériques d’argon et obtenir des images SEM à une tension d’accélération de 25 kV.
3. Préparation chirurgicale pour la chirurgie animale
REMARQUE : Les préparations chirurgicales sont appliquées avant la gastrostomy et la transplantation oesophagielle.
- Configurez les instruments chirurgicaux stériles : lame de scalpel, rétracteur de Weitlaner, support de microaiguille, forceps de microsuture, forceps de microtissue, microscissors, support d’aiguille de Mayo-Hegar, ciseaux d’opération, ciseaux d’iris, forceps d’habillage, forceps de tissu, forceps d’éclat, forceps d’iris, seringue de 5 ml (21 G d’aiguille), seringue de 10 ml (22 G aiguille), 9-0 suture polyamide, 4-0 suture de polyglactin.
- Anesthésiez l’animal par injection intramusculaire de tiletamine/zolazepam (50 mg/g de dose) et 2 % d’hydrochlorure de xylazine (2 mg/kg de dose).
REMARQUE : Des rats adultes de Sprague-Dawley (SD) pesant 398-420 g ont été employés pour la transplantation oesophagielle. - Avant de transférer sur le drapé chirurgical, vérifiez l’état anesthésique approprié de l’animal en pinçant la queue avec les forceps.
- Placez l’animal en position de supine sur le drapé stérile et utilisez des tondeuses pour enlever les poils du cou (pour la transplantation oesophagielle) ou de l’abdomen (pour la gastrostomie). Ensuite, frottez le site chirurgical avec de la bêtadine et 70% de l’éthanol.
- Avant l’incision, injectez sous-cutanée un analgésique comme la buprénorphine (0,05-0,1 mg/kg) pour soulager la douleur.
4. Chirurgie gastrostomy utilisant un T-tube chez les rats
REMARQUE : Une gastrostomie modifiée a été effectuée chez tous les animaux expérimentaux afin de permettre l’alimentation temporaire par voie de contournement non orale (n - 5).
- Avoir des rats vite la veille de la chirurgie. Préparer la chirurgie comme dans la section 3.
- Exposer l’estomac par une incision médiane de la peau et les muscles abdominaux des rats anesthésiés.
- Créer un orifice de 3 mm dans la paroi gastrique antérieure avec une lame de scalpel.
- Insérez la pointe du tube T en silicone dans le site du défaut pour le fixer à la paroi de l’estomac.
- Suture correctement de sorte que le tube T ne se détache pas de la paroi gastrique.
- Sortez l’extrémité distale du tube T implanté par le tunnel sous-cutané à l’arrière du cou.
- Insérez le bouchon d’héparine à l’extrémité du tube T pour empêcher le contenu de l’estomac de couler vers l’arrière.
REMARQUE : Utilisez un angiocatheter pour relier l’extrémité du tube T avec le bouchon d’héparine. - Suturer toutes les couches de la paroi abdominale et de la peau à l’aide de 4-0 sutures en polyglactatine.
- Gardez tous les rats expérimentaux séparés dans une cage métabolique après la gastrostomie a été terminée.
5. Transplantation oesophagée
REMARQUE : La transplantation oesophagielle de l’échafaudage tubulaire à deux couches est effectuée 1 semaine après la gastrostomie (n ' 5). Avant la transplantation, inoculez les HMSC (densité cellulaire : 1 x 106 cellules/mL dans la matrice de membrane du sous-sol) dans la paroi interne de chaque échafaudage et incubez pendant 3 jours dans le système de bioréacteur. L’intervention chirurgicale est la suivante.
- Enlever les poils du cou des animaux modèles et effectuer le drapage standard du site chirurgical pour la chirurgie aseptique.
REMARQUE : Il est recommandé de créer une grande aire de rasage pour maintenir la chirurgie asceptic sur l’animal. - Après l’incision médiane antérieure du cou, séparez les muscles de courroie et exposez la structure tracheoesophageal.
- Disséquer carrément le nerf vague de l’œsophage avant de réséquer le segment, sinon la respiration de l’animal est compromise.
- Sous grossissement, isoler le côté gauche de l’œsophage de la trachée et séparer soigneusement la partie supérieure de la glande thyroïde.
- Créer un défaut circoncire complet de 5 mm de long contenant toutes les couches de l’œsophage à l’aide de ciseaux chirurgicaux.
REMARQUE : Avant la transplantation oesophagielle, coupez les échafaudages préparés à l’aide de ciseaux chirurgicaux pour correspondre à la longueur du site de transplantation. - Sous un microscope, effectuer la microanastomose aux deux extrémités du défaut oesophagique distal à l’aide d’un fil de suture 9-0. Placez la première suture entre la marge inferopostérieure droite du reste et de l’échafaudage de l’œsophage supérieur. Continuer à suturer de droite à gauche entre le reste de l’œsophage supérieur et l’échafaudage. Anastomose l’échafaudage de la même manière que la marge supérieure du reste inférieur de l’œsophage.
REMARQUE : Exécutez l’anastomose microvasculaire comme utilisé dans la chirurgie clinique pour la transplantation oesophagienne. Travaillez avec un microscope pour une suture précise et étanche du site de l’implant. - Ensuite, aplatissez le rabat environnant de glande thyroïde au-dessus du site transplanté pour assurer le maintien stable et l’approvisionnement vasculaire aux greffes.
- Après la transplantation, coudre le muscle sous-cutané et le tissu cutané avec une suture vicryl 4-0.
- Gardez tous les rats expérimentaux individuellement dans des cages métaboliques.
6. Procédures postopératoires
REMARQUE : Les procédures postopératoires sont exécutées après la gastrostomy et la transplantation oesophagielle.
- Après la fermeture de la plaie abdominale, mettre les rats dans des cages métaboliques individuelles et placer les cages sur des dispositifs de réchauffement infrarouge pour prévenir l’hypothermie.
- Surveillez les animaux jusqu’à ce qu’ils atteignent et maintiennent la charge sternale (c.-à-d., couché droit sur la poitrine).
- Pour minimiser l’inflammation au site chirurgical, administrer la gentamicine antibiotique (20 mg/kg) quotidiennement aux rats.
- Commencer l’alimentation liquide orale le troisième jour postopératoire jusqu’au point final de l’étude. Fournir l’ensemble de la formule nutritionnelle (20,6 g/100 ml [g%] de glucides, 3,8 g% de protéines, 0,2 g% de matières grasses) à travers le bouchon d’héparine 3x par jour à partir du lendemain de la chirurgie.
- Vérifiez l’apparence et le poids des animaux tous les jours. Vérifier pour gérer le comportement, comme l’automutilation site d’incision ou de résistance à la prise de tube, ainsi que diverses complications chirurgicales. Lorsque le poids corporel des modèles de rats diminue rapidement de 20 % ou plus, effectuez l’euthanasie par inhalation de CO2.
7. Histologie et immunohistochimie
REMARQUE : Pour l’analyse histologique, tout le tissu oesophagique des animaux euthanasiés est extrait à l’aide de ciseaux chirurgicaux. La coloration de l’hématoxylin et de l’éosine et la coloration trichrome de Masson ont été exécutées en utilisant des techniques histologiques standard. L’immunohistochimie a été exécutée selon le protocole suivant.
- Fixer l’œsophage entier contenant les sites transplantés dans 4% de paraformaldéhyde. Créez un bloc de paraffine et coupez des sections de 4 m d’épaisseur.
- Déparaffiniser les sections de tissus et les déshydrater dans une série d’éthanol. Immerger les lames de tissu dans un tampon de citrate et chauffer pendant 10 minutes au micro-ondes. Refroidir les cellules avec du PBS froid pendant 20 min. Immerger dans 3 % de peroxyde d’hydrogène pendant 6 min, et laver avec du PBS pendant 10 min.
- Incuber dans 3% d’albumine de sérum bovin (BSA) pendant 1 h à température ambiante pour bloquer les réactions non spécifiques des sections de tissu.
- Laver 3x avec PBS pendant 5 min. Incuber avec des anticorps primaires contre Desmin (dilué à 1:200), kératine 13 (dilué à 1:100), et von Willebrand Factor (vWF; dilué à 1:100) pendant la nuit à 4 oC.
- Laver 3x avec PBS pendant 15 min. Incuber avec l’anticorps secondaire approprié à une concentration de 1:500 pour Desmin et Kératine 13 à température ambiante. Ensuite, lavez les diapositives deux fois avec DU PBS pendant 10 min.
REMARQUE : Des sections de tissu pour vWF ont été incubées à l’aide d’un kit conjugué au peroxidase de raifort (voir Tableau des matériaux)et ensuite visualisées à l’aide de 3,3'-diaminobenzidine (DAB). - Mont à l’aide d’un couvercle en verre et 4',6-diamidino-2-phénolindole (DAPI) contenant le milieu de montage.
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Representative Results
La figure 1 montre un diagramme schématique du processus de fabrication de l’échafaudage tubulaire à deux couches PU-PCL. La solution PU a été électrospun à partir d’une aiguille de 18 G pour faire une structure interne cylindrique d’une épaisseur de 200 m. Ensuite, le PCL fondu a été imprimé sur la paroi extérieure de la nanofibre PU à intervalles réguliers. La morphologie de surface des parois intérieures et extérieures de l’échafaudage tubulaire terminé peut être vue dans les images de microscopie électronique de balayage.
La figure 2 montre le processus d’insertion d’un tube gastrostomy dans un rat pour l’approvisionnement en nutriments externes (Figure 2A). Le tube de silicone en forme de T a été inséré dans la paroi de l’estomac et suturer (Figure 2B). Le tube a ensuite été déplacé à travers le tunnel sous-cutané à l’arrière du cou et relié à un bouchon d’héparine (Figure 2C). Le tube facilite l’injection d’aliments liquides. Il interdit également l’écoulement inverse du contenu gastrique à travers les tubes.
La figure 3 montre le processus d’inoculation cellulaire sur la paroi interne de l’échafaudage, la culture de bioréacteurs et la transplantation oesophagée. La matrice de membrane de sous-sol intégrée au hMSC a été appliquée uniformément sur la paroi intérieure de l’échafaudage par injection (Figure 3A). L’image SEM montre la morphologie de la surface intérieure attachée à la cellule. La coloration vivante/morte pour analyser la viabilité des cellules sur l’échafaudage tubulaire à deux couches (surface luminale) a indiqué que la plupart des cellules étaient viables, et qu’elles se propagent bien sur la structure nanofibre en 5 jours. L’échafaudage inoculé avec les cellules a été fixé au bioréacteur, et le stress de cisaillement a été appliqué par la pompe (Figure 3B). Les échafaudages tubulaires ensedus de hMSC, y compris la culture de bioréacteur, ont été transplantés chez des rats présentant des défauts oesophagiens circonférences complets par l’intermédiaire de techniques de microsuture. La greffe a été recouverte d’un rabat de glande thyroïde pour une fixation stable et l’approvisionnement vasculaire du site implanté (figure 3C). Le changement de poids des rats après la transplantation a été observé jusqu’à la fin de l’expérience. Les rats transplantés à l’œsophage sont demeurés à 340 g jusqu’au 9e jour, mais ont ensuite rapidement diminué de poids en raison de diverses causes (figure 3D). En conséquence, la plupart des animaux sont morts dans les 15 jours.
La figure 4 montre la régénération oesophagienne après l’implantation de greffe. Bien que la plupart des rats aient développé l’obstruction néoesophageal provoquée par des boules de cheveux, il n’y avait aucune évidence brute de perforation, fuite d’anastomosis avec la fistule, accumulation de séroma, formation d’abcès, ou nécrose molle environnante de tissu mou dans n’importe quel rat expérimental. La réépithélialisation du site de transplantation a été confirmée par la coloration d’immunofluorescence pour la kératine 13. La morphologie de la couche de collagène et des fibres d’élastine a été clairement confirmée au site de régénération. La présence d’élastines abondantes et de fibres de collagène peut contribuer à de meilleures propriétés mécaniques. La régénération de la couche de muscle oesophagique a été montrée par immunohistochemistry dedesmin, et la néovascularisation abondante a été observée à ce site.
Figure 1 : Illustration schématique du procédé utilisé pour fabriquer des échafaudages tubulaires à 2 couches. Après avoir fabriqué la membrane interne en électrospinning à l’aide de PU (A), la résistance structurelle de l’échafaudage tubulaire a été renforcée par l’ajout de brins à la surface extérieure de la membrane à l’aide d’un système d’impression 3D sans solvant (B). L’image SEM montre la morphologie des couches intérieures et externes de l’échafaudage tubulaire à 2 couches. (Abbreviations: PU et polyuréthane). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Gastrostomie. (A) Un diagramme schématique montrant des techniques de gastrostomie par l’insertion de T-tube dans la paroi gastrique. (B) Un trou de perforation est fait au milieu de l’estomac, et la pointe du tube T est insérée dans l’estomac. (C) La partie d’en-train du tube t est située avec le bouchon d’héparine au milieu de l’occiput. La figure ci-dessous présente un appareil gastrostomy de T-tube avec différents composants. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Transplantation oesophagielle. (A) Les HMSC encapsulés dans la matrice de membrane de sous-sol ont été ensepépins sur les couches intérieures de l’échafaudage tubulaire à deux couches. L’image SEM montre la morphologie des HMSC sur la paroi intérieure. La viabilité des cellules inoculées a également été confirmée par des taches vivantes (cellules vertes et vivantes). Les échafaudages ensedus de hMSC ont été immédiatement incubés dans un système de bioréacteur (B), puis les oesophages tissulaires ont été implantés dans l’œsophage cervical (C). Le site implanté a été couvert d’un rabat de glande thyroïde pour la reconstruction oesophagienne stable (flèches). (D) Études de perte de poids après transplantation oesophagée. La perte de poids a été déterminée comme changement absolu par rapport au poids initial des rats. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Histologie entière de l’oesophage reconstruit 2 semaines après l’implantation orthotopic d’échafaudage. La coloration trichrome de Masson montre le dépôt de collagène autour des sites implantés. La régénération du muscle oesophagien et des couches muqueuses a été confirmée par desmin (vert) et kératine 13 (rouge) immunostaining, respectivement. En outre, la néovascularisation (flèches) a été clairement observée autour de la couche muqueuse régénérée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Les études animales existantes sur l’oesophagi artificiel sont encore limitées par plusieurs facteurs critiques. L’échafaudage oesophagique artificiel idéal doit être biocompatible et avoir d’excellentes propriétés physiques. Il devrait pouvoir régénérer l’épithélium muqueux dans la période postopératoire tôt pour empêcher la fuite anastomotique. La régénération des couches musculaires longitudinales circulaires et externes est également importante pour le péristaltisme fonctionnel12,13.
Les caractéristiques mécaniques de l’œsophage sont essentielles parce que l’œsophage s’effondre pendant la respiration et s’ouvre pendant la déglutition, avec une exposition constante à l’étirement maximal avec un phénomène de recul14. L’échafaudage implanté doit également avoir ces caractéristiques mécaniques. La viscoélasticité de l’œsophage implanté devrait être adéquate pour la rampe répétitive-relaxation du mouvement péristaltique par l’oesophage. Les échafaudages trop faibles peuvent se rompre ou fuir et causer des conditions graves (p. ex., médiastinite) chez le receveur. En revanche, un échafaudage trop rigide pourrait gonfler dans le lumen oesophagique et empêcher le passage des aliments. Les nanofibres électrospunont ont des propriétés physiques très favorables pour la reconstruction oesophagine. La nature topographique de l’ECM fournit un environnement favorable à la migration et à la différenciation des cellules épithéliales dans les couches oesophagiennes15. Il a également une structure nanopore qui empêche les fuites de salive et divers agents pathogènes16. Cependant, les échafaudages faits de nanofibres électrospuns ont une utilisation limitée en raison de leurs propriétés mécaniques douces. Pour résoudre ce problème, nous avons amélioré leur résistance mécanique en utilisant la technologie d’impression 3D. Le brin imprimé en 3D sur la couche externe de la nanofibre a une largeur de 780 m, et la structure intérieure des pores est assez large. Il fournit un soutien physique pour les interventions oesophagines plutôt que de guider la régénération du tissu environnant.
Dans cette étude, les défauts oesophagiens circonférences ont été entièrement guéris dans les greffes cultivées de bioréacteur pendant jusqu’à 2 semaines, mais tous les rats expérimentaux sont morts dans les 15 jours après chirurgie. La plupart des décès ont été causés par la péritolite et la malnutrition causées par des fuites de nourriture et de salive proximale au site d’anastomose. Tous les animaux ont librement consommé un régime liquide pendant jusqu’à une semaine, mais pendant que la guérison de blessure a progressé, l’obstruction mécanique involontaire s’est produite dans l’oesophage reconstruit dû à la déglutition de boule de poils. Ce phénomène a été montré pour causer le désordre digestif complet dans les échafaudages non-dynamiques implantés. Il existe plusieurs options pour surmonter ces problèmes techniques. Tout d’abord, le développement d’un implant oesophagien très élastique qui peut imiter le péristaltisme oesophagique. Deuxièmement, les études animales à l’aide de rats glaçants pour empêcher la déglutition des cheveux. Troisièmement, l’endoprothèse biliaire peut être appliquée simultanément avec l’échafaudage pour minimiser l’effondrement de l’implant et les dommages à l’anastomose. En outre, l’application de l’anastomose microvasculaire à l’implantation d’échafaudages oesophagiens est importante pour prévenir complètement la fuite de salive. La technique de suture conventionnelle utilisant les yeux nus est extrêmement difficile à rendre étanche dans les modèles de rat.
Un véhicule vasculaire fiable est essentiel pour les nutriments, les facteurs de croissance et l’approvisionnement en oxygène dans les premiers stades de la régénération. La glande thyroïde est un tissu vasculaire situé près de l’œsophage. Nous avons employé le rabat de glande thyroïde après l’oesophagectomy circonférences en raison de son accessibilité facile dans le modèle de rat. En conclusion, nous proposons diverses techniques précliniques pour surmonter les difficultés de la reconstruction oesophagée dans le modèle de rat. Cette étude présente une bonne alternative pour surmonter les limites de la transplantation conventionnelle de petit animal d’oesophage.
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Disclosures
Le système de bioréacteur conçu pour cette étude a été commercialisé (numéro de modèle : ACBF-100).
Acknowledgments
Cette recherche a été soutenue par le Projet de recherche et développement des technologies de la santé de la Corée par l’intermédiaire du Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), financé par le Ministère de la santé et du bien-être social, République de Corée (numéro de subvention : HI16C0362) et Basic Science Research Programme par l’intermédiaire de la National Research Foundation of Korea (NRF) financé par le Ministère de l’éducation (2017R1C1B2011132). Les biospécimens et les données utilisées dans cette étude ont été fournis par la Biobank of Seoul National University Hospital, membre du Korea Biobank Network.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Metabolic cage | TEUNGDO BIO & PLANT | JD-C-66 | |
| Zoletil (50 mg/g dose) | Virbac | 1000000188 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | |
| 2% xylazine hydrochloride (Rumpun) | Byely | Q-0615-035 | |
| 4% paraformaldehyde | BIOSOLUTION | BP031 | |
| 4-0 Vicryl | ETHICON | W9443 | |
| 9-0 Vicryl | ETHICON | W2813 | |
| Antibiotic gentamicin (Septopal). | Septopal | 0409-1207-03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 5470 | |
| Citrate Buffer, ph6.0, 10X | Sigma | C9999 | |
| DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KIT | VECTOR | SK4100 | |
| Desmin | Santa Cruz | sc-23879 | |
| Elastic stain kit | ScyTeK | ETS-1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethanol | Merck | 64-17-5 | |
| Fetal Bovine Serun (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | 354400 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | A-11001 | |
| Heparin cap | Hyupsung Medical | HS-T-05 | |
| hMSC (STEMPRO) / growth medium (MesenPRO RSTM) |
Invitrogen | R7788-110 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated kit (Vectastain) | VECTOR | PK7800 | |
| Hydrogen peroxide | JUNSEI | 7722-84-1 | |
| Keratin13 | Novus | NBP1-97797 | |
| LIVE/DEAD Viability Assay Kit | Molecular Probes | L3224 | |
| Matrigel | Corning | 354262 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Sigma | 227056 | |
| Nonadherent 24-well tissue culture plates. |
Corning | 3738 | |
| OsO4 | Sigma | O5500 | |
| Petri dish | Eppendorf | 3072115 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), 10X | BIOSOLUTION | BP007a | |
| Polycaprolactone (PCL) polymer | Sigma | 440744 | |
| Polyurethane (PU+A2:A24) polymer | Lubrizol | 2363-80AE | |
| Power Supply | NanoNC | HV100 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Rumpun | Bayer | Q-0615-035 | |
| Silicone T-tube | Sewoon Medical | 2206-005 | |
| Terramycin Eye Ointment | Pfizer Pharmaceutical Korea | W01890011 | |
| Tiletamine/Zolazepam (Zoletil) | Virbac Laboratories | Q-0042-058 | |
| Trichrome stain kit | ScyTeK | TRM-1 | |
| von Willebrand Factor (vWF) | Santa Cruz | sc 14014 |
References
- Irino, T., et al. Long-term functional outcomes after replacement of the esophagus with gastric, colonic, or jejunal conduits: a systematic literature review. Diseases of the Esophagus. 30 (12), 1-11 (2017).
- Flanagan, J. C., et al. Esophagectomy and Gastric Pull-through Procedures: Surgical Techniques, Imaging Features, and Potential Complications. Radiographics. 36 (1), 107-121 (2016).
- Liu, J., Yang, Y., Zheng, C., Dong, R., Zheng, S. Surgical outcomes of different approaches to esophageal replacement in long-gap esophageal atresia: A systematic review. Medicine. (Baltimore). 96 (21), e6942 (2017).
- Luc, G., et al. Decellularized and matured esophageal scaffold for circumferential esophagus replacement: Proof of concept in a pig model. Biomaterials. 175, 1-18 (2018).
- Wang, F., Maeda, Y., Zachar, V., Ansari, T., Emmersen, J. Regeneration of the oesophageal muscle layer from oesophagus acellular matrix scaffold using adipose-derived stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (1), 271-277 (2018).
- La Francesca, S., et al. Long-term regeneration and remodeling of the pig esophagus after circumferential resection using a retrievable synthetic scaffold carrying autologous cells. Scientific Reports. 8 (1), 4123 (2018).
- Ponten, J. E., et al. Early severe mediastinal bleeding after esophagectomy: a potentially lethal complication. Journal of Thoracic Disease. 5 (2), E58-E60 (2013).
- Catry, J., et al. Circumferential Esophageal Replacement by a Tissue-engineered Substitute Using Mesenchymal Stem Cells: An Experimental Study in Mini Pigs. Cell Transplant. 26 (12), 1831-1839 (2017).
- Lee, S. J., et al. Characterization and preparation of bio-tubular scaffolds for fabricating artificial vascular grafts by combining electrospinning and a 3D printing system. Physical Chemistry Chemical Physics. 17 (5), 2996-2999 (2015).
- Kim, I. G., et al. Tissue-Engineered Esophagus via Bioreactor Cultivation for Circumferential Esophageal Reconstruction. Tissue Engineering Part A. , (2019).
- Wu, Y., et al. Combinational effects of mechanical forces and substrate surface characteristics on esophageal epithelial differentiation. Journal of Biomedical Materials Research A. 107, 552-560 (2019).
- Jensen, T., et al. Polyurethane scaffolds seeded with autologous cells can regenerate long esophageal gaps: An esophageal atresia treatment model. Journal of Pediatric Surgery. 3468 (18), 30685-30687 (2018).
- Nakase, Y., et al. Intrathoracic esophageal replacement by in situ tissue-engineered esophagus. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 136 (4), 850-859 (2008).
- Kwiatek, M. A., et al. Mechanical properties of the esophagus in eosinophilic esophagitis. Gastroenterology. 140 (1), 82-90 (2011).
- Anjum, F., et al. Biocomposite nanofiber matrices to support ECM remodeling by human dermal progenitors and enhanced wound closure. Scientific Reports. 7 (1), 10291 (2017).
- Kuppan, P., Sethuraman, S., Krishnan, U. M. PCL and PCL-gelatin nanofibers as esophageal tissue scaffolds: optimization, characterization and cell-matrix interactions. Journal of Biomedical Nanotechnology. 9 (9), 1540-1555 (2013).
