Summary
Esofagus rekonstruktion är ett utmanande förfarande, och utveckling av en vävnad-konstruerad matstrupe som möjliggör regenerering av matstrupslemhinnan och muskler och som kan implanteras som ett artificiellt transplantat är nödvändigt. Här presenterar vi vårt protokoll för att generera en konstgjord matstrupe, inklusive byggnadsställningstillverkning, bioreaktorodling och olika kirurgiska tekniker.
Abstract
Användningen av biokompatibla material för omkrets esofagial rekonstruktion är en tekniskt utmanande uppgift hos råttor och kräver en optimal implantatteknik med näringsstöd. Nyligen har det gjorts många försök till esofagusvävnad teknik, men framgången har begränsats på grund av svårigheter i tidig epitet i den speciella miljön av peristaltik. Här utvecklade vi en konstgjord matstrupe som kan förbättra regenereringen av matstrupsslemhinnan och muskellagren genom en tuschig tubulär byggnadsställning, en mesenchymal stamcellsbaserat bioreaktorsystem och en bypassmatningsteknik med modifierad gastrostomi. Byggnadsställningen är tillverkad av polyuretan (PU) nanofibrer i en cylindrisk form med en tredimensionell (3D) tryckt polykaprolactonsträng lindad runt ytterväggen. Före transplantationen sådds mesenchymala stamceller till byggnadsställningens lumen och bioreaktorodling utfördes för att förbättra cellulär reaktivitet. Vi förbättrade transplantat överlevnad genom att tillämpa kirurgisk anastomos och täcker implanterade protes med en sköldkörtelflik, följt av tillfällig nonoral gastrostomy utfodring. Dessa ympkvistar kunde sammanfatta resultaten av inledande epitelisering och muskelregenerering runt de implanterade platserna, vilket framgår av histologisk analys. Dessutom observerades ökad elastinfibrer och karkulakulärisering i transplantatets periferi. Därför presenterar denna modell en potentiell ny teknik för omkrets esofagerad rekonstruktion.
Introduction
Behandling av matstrupssjukdomar, såsom medfödda missbildningar och matstrupscancer, kan leda till strukturell segmentförlust av matstrupen. I de flesta fall, autolog ersättning transplantat, såsom gastric pull-up ledningar eller kolon interpositions, har utförts1,2. Emellertid, dessa esofagus ersättare har en mängd olika kirurgiska komplikationer och återanvändning risker3. Således kan användningen av vävnadskonstruerade esofagsställningar härma den inhemska matstrupen vara en lovande alternativ strategi för att i slutändan regenerera förlorade vävnader4,5,6.
Även om en vävnadskonstruerad matstrupe potentiellt erbjuder ett alternativ till de nuvarande behandlingarna av matstrupsdefekter, finns det betydande hinder för dess in vivo-applicering. Postoperativa anastomotic läckage och nekros av implanterade esofagus byggnadsställning oundvikligen leda till en dödlig infektion i det omgivande aseptiska utrymmet, såsom mediastinum7. Därför är det oerhört viktigt att förhindra mat eller salivkontaminering i såret och nasogastriskröret. Gastrostomy eller intravenös näring bör övervägas tills primära sårläkning är klar. Hittills har esofagus vävnad smittforskning utförts i stora djurmodeller eftersom stora djur kan matas endast genom intravenös hyperalimentation för 2-4 veckor efter implantation avbyggnadsställning8. En sådan ickeoral utfodring modell har dock inte fastställts för tidig överlevnad efter matstrupstransplantation hos små djur. Detta beror på att djuren var extremt aktiva och okontrollerbara, så att de inte kunde hålla matningsröret i magen under en längre tid. Av denna anledning har det förekommit få fall av framgångsrik matstrupstransplantation hos små djur.
Med tanke på omständigheterna kring esofagusvävnad svimering, konstruerade vi en två lager rörformig byggnadsställning bestående av elektrospunnerade nanofibrer (inre lager; Bild 1A)och en 3D-tryckt sträng (yttre skikt; Figur 1B) inklusive en modifierad gastrostomiteknik. Den inre nanofibern är tillverkad av PU, en icke-nedbrytbar polymer, och förhindrar läckage av mat och saliv. De externa 3D-tryckta strängarna är tillverkade av biologiskt nedbrytbar polykaprolak (PCL), som kan ge mekanisk flexibilitet och anpassa sig till peristaltisk rörelse. Mänskliga fett-härledda mesenchymal stamceller (hAD-MSCs) var seedade på det inre lagret av byggnadsställningen för att främja re-epithelization. Nanofiberstrukturen kan underlätta inledande slemhinnans regenerering genom att tillhandahålla en strukturell extracellulär matris (ECM) miljö för cellmigrering.
Vi har också ökat överlevnaden och bioaktiviteten hos de vaccinerade cellerna genom bioreaktorodling. Den implanterade byggnadsställningen var täckt med en sköldkörtelflik för att möjliggöra en stabilare regenerering av matstrupsslemhinnan och muskelskiktet. I denna rapport beskriver vi protokoll för esofagusvävnadsteknik, inklusive byggnadsställningstillverkning, mesenchymal stamcellsbaserad bioreaktorodling, en bypassmatningsteknik med modifierad gastrostomi och en modifierad kirurgisk anastomos teknik för circumferential esofagrekonstruktion i en råtta modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som beskrivs här har godkänts av institutional animal care and use committee (IACUC nr 17-0164-S1A0) vid Seoul National University Hospital.
1. Byggnadsställning Tillverkning
OBS: Tvåskiktade esofagusbyggnadsställningar tillverkas genom att kombinera elektrospinning och 3D-utskrift. Det inre membranet i rörformiga byggnadsställningen tillverkades av elektrospinning polyuretan (PU) med roterande rostfria mandreller som samlare9.
- För beredning av rörformiga PU nanofibrer, förbereda en 20% (w / v) lösning av PU polymer genom omrörning i N,N-dimetylformamid (DMF) för 8 h vid rumstemperatur.
- Placera PU-lösningen på sprutan med en trubbig metallnål (22 G) och elektrospin på roterande rostfria mandreller (diameter = 2 mm) på ett avstånd av 30 cm mellan nålspetsen och den roterande uppsamlaren.
OBS: Strömförsörjningen är inställd på en högspänningsdirektström på 15 kV-potential. Lösningens matningshastighet fixeras vid 0,5 ml/h med hjälp av en sprutpump. - Gör ett rörformigt nanofiberlager på ytan av mandrelen som roterar på 3,14 m/s.
- Torka PU-nanofibern i en vakuumugn vid 40 °C över natten för att helt ta bort restlösningsmedel.
OBS: Den 3D-tryckta ytterväggen i matstrupsbyggnadsställningen är förberedd med hjälp av ett snabbt prototypsystem. 3D-utskriftsutrustningen består av en dispenser, munstycke, kompressions-/värmeregulator, 3-axlig konverteringsfas och mjukvarusystem. - PCL-pellets löses upp vid 100 °C i en värmecylinder och trycks sedan på nanofibrernas yta vid högt tryck (7 bar) under kontroll av ett bioplottingssystem. Munstyckets storlek är 300 μm och strandavståndet är 700 μm.
- Efter att ha tagit bort den tvålagerade byggnadsställningen från mandrelen, steriliseras genom blötläggning i 70% etanol under ultraviolett ljus.
OBS: Mer detaljerade egenskaper hos byggnadsställningen har rapporterats i tidigare studier10.
2. Cellseedning på transplantat och bioreaktorodling
OBS: Mänskliga fett-härledda mesenchymal stamceller (hMSCs) som köpts från ett företag användes utan ändringar.
- Före celltransplantation, sterilisera den 3D-tryckta matstrupsställningen för 1 h under ultraviolett ljus, blötden i 10 min med etanol och tvätta den 3x med fosfatbuffbuffrad koks (PBS).
- Kultur och expandera hMSCs i tillväxtmedium (basalmedium/tillväxttillägg). Tvåskiktade rörformiga byggnadsställningar överfördes till nonadherent 24 brunnvävnadkulturplåtar.
- För att fästa cellerna på byggnadsställningens inre yta, tillsätt försiktigt hMSC-fjädringen med en densitet av 1 x 106 celler/ml i källarenmembranmatris som innehåller tillväxtmediet.
- Deponera ridenmembranmatrisfjädring på den inre ytan av den tvålagerade rörformiga byggnadsställningen.
- Fäst den hMSC-seedade rörformiga byggnadsställningen till akrylhållaren i bioreaktorns kulturkammare med hjälp av ett pulsatile flow bioreaktorsystem.
OBS: Det specialdesignade bioreaktorsystemet består av en pump, bubbelfälla, flödeskammare, tryckmätare, kontrollerbar ventil och medelhög behållare. Vid applicering av skjuvningstress i kulturkammaren, låt vilotiden på 1-2 min11. - Tillsätt tillväxtmedium till kulturkammaren och applicera 0,1 dyne/cm2 flödesinducerad skjuvningsstress under en fuktad atmosfär som innehåller 5% CO210.
OBS: Värdet av flödesinducerad skjuvningsstress beräknades genom att simulera peristaltiken i matstrupsvävnaden som härrör från människokroppen från tidigare studier10. - Bestäm cellsvaren på de tvåskiktade rörformiga byggnadsställningarna utan bioreaktorodling efter 5 dagar med hjälp av en LIVE/DEAD-analyskit enligt tillverkarens anvisningar. Få bilder via konfokal mikroskopi med Z-stackverktyget.
- På den tredje dagen, observera ytan morfologi av hMSC-seedade rörformiga byggnadsställning genom en scanning elektronmikroskop (SEM).
- Fixa byggnadsställningen som inkuberats med hMSC med 2,5% glutaraldehyd och OsO4 för 24 h och uttorkad med etanol.
- Täck de fasta hMSCs med platina med hjälp av en sputter coater under argon atmosfäriska förhållanden och få SEM bilder med en accelererande spänning på 25 kV.
3. Kirurgisk förberedelse för djurkirurgi
OBS: Kirurgiska preparat appliceras före både gastrostomi och matstrupstransplantation.
- Ställ in de sterila kirurgiska instrumenten: Scalpel blade, Weitlaner upprullningsdon, mikronålhållare, mikrosuturer, mikrovävnadspincett, mikrosaxar, Mayo-Hegar nålhållare, arbetssax, irissax, dressingpinar, vävnadspinpar, splinterpinrar, irispincett, 5 ml spruta (21 G nål), 10 ml spruta (22 G nål), 9-0 polyamidsutur, 4-0 polyglactin sutur.
- Bedövningsmedel djuret med en intramuskulär injektion av kakeltamin/zolazepam (50 mg/g dos) och 2% xylosinhydroklorid (2 mg/kg dos).
OBS: Vuxna Sprague-Dawley (SD) råttor som väger 398-420 g användes för esofagus transplantation. - Innan du överför till den kirurgiska draperingen, kontrollera lämpligt bedövningsmedel tillstånd av djuret genom att nypa svansen med pincett.
- Placera djuret i en ryggplats på den sterila draperioch använd klippning för att ta bort håret från halsen (för esofagus transplantation) eller buken (för gastrostomi). Skrubba sedan operationsstället med betadin och 70% etanol.
- Före snittet injicerar subkutant en smärtstillande sådan som buprenorfin (0,05-0,1 mg/kg) för smärtlindring.
4. Gastrostomy Kirurgi Med hjälp av ett T-rör hos råttor
OBS: En modifierad gastrostomi utfördes i alla försöksdjur för att möjliggöra tillfällig bypass nonoral rörmatning (n = 5).
- Ha råttor snabbt dagen före operationen. Förbered operation som i avsnitt 3.
- Exponera magen genom ett mittlinjesnitt av huden och magmusklerna hos de sepadiserade råttorna.
- Skapa en 3 mm öppning i den främre magväggen med ett skalpellblad.
- Sätt i spetsen på silikonT-röret i defekten platsen för att fixa den på magen väggen.
- Sutur ordentligt så att T-röret inte lossnar från magväggen.
- Ta ut den distala änden av den implanterade T-röret genom den subkutana tunneln i nacken.
- För in heparinlocket till t-rörets ände för att förhindra att maginnehållet flyter bakåt.
OBS: Använd en angiocatheter för att ansluta änden av T-röret med heparinlocket. - Sutur alla lager av bukväggen och huden med 4-0 polyglactin suturer.
- Håll alla experimentella råttor åtskilda i en metabolisk bur efter gastrostomi har slutförts.
5. Esofagus transplantation
OBS: Matstrupen transplantation av två lager rörformiga byggnadsställning utförs 1 vecka efter gastrostomy (n = 5). Före transplantationen inokuleras hMSCs (celldensitet: 1 x 106 celler/ml i källarens membranmatris) i innerväggen på varje byggnadsställning och inkubera i 3 dagar i bioreaktorsystemet. Det kirurgiska ingreppet är följande.
- Ta bort nackhåret på modelldjuren och utför standarddrapering av operationsstället för aseptisk kirurgi.
OBS: Skapa ett stort rakningsområde rekommenderas för att upprätthålla asceptic kirurgi på djuret. - Efter främre mediansnitt i nacken, separera remmusklerna och exponera luftstrupens struktur.
- Trubbigt dissekera vagus nerv från matstrupen innan skändning segmentet, annars djurets andning äventyras.
- Under förstoring, isolera den vänstra sidan av matstrupen från luftstrupen och försiktigt separera den övre delen från sköldkörteln.
- Skapa en 5 mm lång full omkrets defekt som innehåller alla lager av matstrupen med kirurgisk sax.
OBS: Innan esofagus transplantation, skär de beredda byggnadsställningar med kirurgisk sax för att matcha längden på transplantationsplatsen. - Under ett mikroskop, utför mikroanastomos i båda ändar av den distala matstrupsdefekten med hjälp av en 9-0 suturtråd. Placera den första suturen mellan den högra inferoposteriormarginalen i den övre matstrupskvarlevan och byggnadsställningen. Fortsätt suturera från höger till vänster mellan den övre matstrupskvarlevan och byggnadsställningen. Anastomose byggnadsställningen på samma sätt som den övre marginalen av den nedre matstrupskvarlevan.
OBS: Utför mikrovaskulär anastomos som används vid klinisk kirurgi för esofagustransplantation. Arbeta med ett mikroskop för exakt, vattentät suturering av implantatstället. - Efteråt, lägg den omgivande sköldkörteln lock över transplanterade platsen för att säkerställa stabilt underhåll av och vaskulär leverans till transplantat.
- Efter transplantation, sy subkutan muskel och hudvävnad med en 4-0 vicryl sutur.
- Håll alla experimentella råttor individuellt i metaboliska burar.
6. Postoperativa förfaranden
OBS: Postoperativa förfaranden utförs efter både gastrostomi och matstrupstransplantation.
- Efter stängning av buksåret, sätta råttorna i enskilda metaboliska burar och placera burarna på infraröduppvärmning enheter för att förhindra hypotermi.
- Övervaka djuren tills de uppnår och upprätthåller sternalrecumbency (dvs. ligger upprätt på bröstet).
- För att minimera inflammation vid operationsstället, administrera antibiotika gentamicin (20 mg/kg) dagligen till råttorna.
- Börja oral vätska utfodring på den tredje postoperativa dagen fram till slutpunkten för studien. Leverera hela näringsformeln (20,6 g/100 ml [g%] kolhydrater, 3,8 g% protein, 0,2 g% fett) genom heparinlocket 3x per dag som börjar dagen efter operationen.
- Kontrollera djurens utseende och kroppsvikt dagligen. Kontrollera att hantera beteende, såsom självskadebeteende webbplats eller motstånd mot röret intag, samt olika kirurgiska komplikationer. När råttmodellernas kroppsvikt minskar snabbt med 20 % eller mer, utför dödshjälp genom CO 2-inandning.
7. Histologi och immunohistokemi
OBS: För histologisk analys, alla matstrupen vävnad av avlivade djur extraheras med kirurgisk sax. Hematoxylin och eosin färgning och Massons trichrome färgning utfördes med hjälp av standard histologiska tekniker. Immunohistochemistry utfördes enligt följande protokoll.
- Fixa hela matstrupen som innehåller de transplanterade platserna i 4% paraformaldehyd. Skapa ett paraffinblock och skär 4 μm tjocka sektioner.
- Deparaffinize vävnadsektionerna och torka ut dem i en etanolserie. Sänk ner vävnadsrutschbanorna i citratbuffert och värm i 10 min i mikrovågsugnen. Kyl cellerna med kall PBS i 20 min. Sänk i 3% väteperoxid i 6 min, och tvätta med PBS i 10 min.
- Inkubera i 3% bovinserumalbumin (BSA) för 1 h vid rumstemperatur för att blockera ospecifika reaktioner av vävnadssektioner.
- Tvätta 3x med PBS i 5 min. Inkubera med primära antikroppar mot Desmin (utspädd till 1:200), keratin 13 (utspädd till 1:100) och von Willebrand Factor (vWF; utspädd till 1:100) över natten vid 4 °C.
- Tvätta 3x med PBS i 15 min. Inkubera med lämplig sekundär antikropp vid en koncentration av 1:500 för Desmin och Keratin 13 i rumstemperatur. Tvätta sedan rutschkanorna två gånger med PBS i 10 min.
OBS: Vävnadssektioner för vWF inkuberades med hjälp av ett pepparrotsperoxidaskonjugatkit (se Materialbord)och visualiserades sedan med 3,3'-diaminobenzidine (DAB). - Montera med hjälp av ett glastäcke och 4',6-diamidino-2-fenolindol (DAPI) som innehåller monteringsmedium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bild 1 visar ett schemadiagram över tillverkningsprocessen för PU-PCL tvåskiktad rörformig byggnadsställning. PU-lösningen var elektrospunnen från en 18 G nål för att göra en cylindrisk inre struktur med en tjocklek på 200 μm. Sedan trycktes det smälta PCL på den yttre väggen i PU-nanofiber med jämna mellanrum. Ytan morfologi av de inre och yttre väggarna i den färdiga rörformiga byggnadsställningen kan ses i scanning elektronmikroskopi bilder.
Figur 2 visar processen att sätta in ett gastrostomyrör i en råtta för extern näringstillförsel(figur 2A). Det T-formade silikonröret sattes in i magväggen och sutured(figur 2B). Röret flyttades sedan genom den subkutana tunneln till baksidan av halsen och i samband med en heparin mössa(Figur 2C). Röret underlättar injektion av flytande mat. Det förbjuder också det omvända flödet av maginnehållet genom rören.
Figur 3 visar processen med cellinokulering på byggnadsställningens inre vägg, bioreaktorodling och esofagustransplantation. Den hMSC-inbäddade källaren membran matris applicerades jämnt på den inre väggen av byggnadsställningen via injektion(Figur 3A). SEM-bilden visar morfologi av den cellanslutna inre ytan. Levande / död färgning för att analysera celllivskraft på två lager rörformiga byggnadsställning (luminal yta) visade att de flesta celler var livskraftiga, och de sprider sig väl på nanofiber strukturen i 5 dagar. Byggnadsställningen som inokulerades med cellerna var fast satt på bioreaktorn, och skjuvstressen applicerades av pumpen(figur 3B). De hMSC-seedade rörformiga byggnadsställningar, inklusive bioreaktorodling, transplanterades till råttor med full cirtopesiska matstrupsdefekter via mikrosuturtekniker. Transplantatet var täckt med en sköldkörtelflik för stabil fixering och vaskulär tillförsel av den implanterade platsen(figur 3C). Vikten förändring av råttorna efter transplantation observerades fram till slutet av experimentet. Esofagus transplanterade råttor kvar på 340 g fram till den 9: e dagen, men sedan snabbt minskat i vikt på grund av olika orsaker (Figur 3D). Som ett resultat dog de flesta djur inom 15 dagar.
Figur 4 visar esofagusregenerering efter transplantatimplantation. Även om de flesta råttor utvecklat neoesophageal obstruktion orsakas av hårbollar, det fanns inga grova bevis för perforering, anastomos läckage med fistel, seromackumulering, abscess bildning, eller omgivande mjuk-vävnad nekros i någon experimentell råtta. Re-epitelialisering av transplantationsstället bekräftades av immunofluorescensfärgning för keratin 13. Morfologi av kollagenskiktet och elastinfibrerna bekräftades tydligt på regenereringsplatsen. Förekomsten av riklige elastin- och kollagenfibrer kan bidra till bättre mekaniska egenskaper. Regenerering av matstrupsmuskelskiktet ställdes ut av desmin immunohistochemistry, och riklig karvaskulärisering observerades på denna webbplats.
Figur 1: Schematisk illustration av den process som används för att tillverka 2-skiktade rörformiga byggnadsställningar. Efter att ha fabricerat det inre membranet med elektrospinning med PU (A),förstärktes den strukturella styrkan hos rörformiga byggnadsställningen genom att tillsätta strängar till membranets yttre yta med hjälp av ett 3D-utskriftssystem utan lösningsmedel (B). SEM-bilden visar morfologi av de inre och yttre skikten i den 2-skiktade rörformiga byggnadsställningen. (Förkortningar: PU = polyuretan). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Gastrostomy. (A)Ett schemadiagram som visar gastrostomy tekniker genom T-röret insättning i magväggen. (B)Ett punkteringshål är tillverkat mitt i förmagsäcken och T-rörspetsen sätts in i förmagen. (C)Inloppsdelen av T-röret ligger med heparinlocket mitt i ockiputen. Figuren nedan presenterar en T-tube gastrostomy apparat med olika komponenter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Esofagus transplantation. (A)HMSCs inkapslade i källaren membran matris var seedade på de inre skikten av två lager rörformiga byggnadsställning. SEM-bilden visar morfologi av hMSCs på den inre väggen. Livskraften hos de vaccinerade cellerna bekräftades också av levande död färgning (gröna = levande celler). De hMSC-seedade byggnadsställningar inkuberades omedelbart i ett bioreaktorsystem (B), och sedan implanterades den vävnadskonstruerade matstrupen i livmoderhalsen (C). Den implanterade platsen var täckt med en sköldkörtelflik för stabil esofagusrekonstruktion (pilar). (D)Viktminskningsstudier efter esofagustransplantation. Viktminskning fastställdes som absolut förändring från den ursprungliga vikten av råttorna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Hela histologi av rekonstruerade matstrupen 2 veckor efter ortopediska byggnadsställning implantation. Massons trichrome färgning visar kollagen nedfall runt implanterade platser. Regenerering av matstrupsmuskeln och slemhinnorna bekräftades av desmin (grön) och keratin 13 (röd) immunfärgning, respektive. Dessutom observerades neovascularization (pilar) tydligt runt det regenererade slemhinnan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Befintliga djurstudier på konstgjord matstrupe begränsas fortfarande av flera kritiska faktorer. Den idealiska konstgjorda matstrupsställningen ska vara biokompatibel och ha utmärkta fysiska egenskaper. Det bör kunna regenerera slemhinnan epitel i början av postoperativa perioden för att förhindra anastomotiskt läckage. Regenerering av de inre cirkulära och yttre längsgående muskellagren är också viktigt för funktionell peristaltik12,13.
Matstrupens mekaniska egenskaper är viktiga eftersom matstrupen kollapsar under andning och öppnas under sväljningen, med konstant exponering för maximal sträckning med ett rekylfenomen14. Den implanterade byggnadsställningen måste också ha dessa mekaniska egenskaper. Den implanterade matstrupens viskoelasticitet bör vara tillräcklig för upprepad rampavslappning av peristalticrörelsen genom matstrupen. Byggnadsställningar som är för svaga kan brista eller läcka och orsaka svåra förhållanden (t.ex. mediastinit) i mottagaren. Däremot kan en byggnadsställning som är för stel bula i matstrupen lumen och förhindra mat passage. Elektrovävda nanofibrer har mycket gynnsamma fysiska egenskaper för esofagusrekonstruktion. ECM: s topografiska natur ger en miljö gynnsam för migration och differentiering av epitelceller i esofagusskikt15. Den har också en nanopore struktur som förhindrar läckage av saliv och olika patogener16. Byggnadsställningar av elektrovävda nanofibrer har dock begränsad användning på grund av deras mjuka mekaniska egenskaper. För att lösa detta problem förbättrade vi deras mekaniska styrka med hjälp av 3D-utskriftsteknik. Den 3D-tryckta strängen på nanofiberns yttre lager har en bredd på 780 μm, och den inre porstrukturen är ganska bred. Det ger fysiskt stöd för esofagus interventioner snarare än att styra förnyelse av den omgivande vävnaden.
I denna studie var cirkumferential esofagusdefekter helt läkti bioreaktorn odlade ympkvistar i upp till 2 veckor, men alla experimentella råttor dog inom 15 dagar efter operationen. De flesta dödsfall orsakades av bukhinnan och undernäring som orsakas av mat och saliv läckor proximala till anastomos webbplats. Alla djur konsumeras fritt en flytande kost i upp till en vecka, men som såret läkning fortskridade, oavsiktlig mekanisk obstruktion inträffade i rekonstruerade matstrupen på grund av hårboll svälja. Detta fenomen har visat sig orsaka fullständig matsmältningsstörning inom de implanterade icke-dynamiska byggnadsställningar. Det finns flera alternativ för att övervinna dessa tekniska frågor. Först, utvecklingen av en mycket elastisk matstrupsimplantat som kan efterlikna esofagus peristaltik. För det andra djurstudier med hårlösa råttor för att förhindra hårsväljning. För det tredje kan gallstentappliceras samtidigt med byggnadsställningen för att minimera implantatkollaps och anastomosskador. Dessutom är tillämpningen av mikrovaskulär anastomos till esofagus byggnadsställning implantation viktigt att helt förhindra läckage av saliv. Den konventionella suturteknik med hjälp av de nakna ögonen är extremt svårt att göra vattentät i råtta modeller.
En pålitlig vaskulär fordon är viktigt för näringsämnen, tillväxtfaktorer och syretillförsel i ett tidigt skede av förnyelse. Sköldkörteln är kärlvävnad som ligger nära matstrupen. Vi använde sköldkörteln luckan efter indicier esophagectomy på grund av dess enkla tillgänglighet i råttmodellen. Sammanfattningsvis föreslår vi olika prekliniska tekniker för att övervinna svårigheterna med esofagus rekonstruktion i råttmodellen. Denna studie utgör ett bra alternativ för att övervinna begränsningarna i konventionell små djur matstrupstransplantation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Bioreaktorsystemet som utformats för denna studie har kommersialiserats (modellnummer: ACBF-100).
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av Korea Health Technology FoU-projektet genom Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), finansierad av ministeriet för hälsa och välfärd, Sydkorea (bidragsnummer: HI16C0362) och Grundläggande vetenskap forskning Program genom National Research Foundation of Korea (NRF) finansierat av undervisningsministeriet (2017R1C1B2011132). De bioprover och data som används i denna studie tillhandahölls av Biobank i Seoul National University Hospital, en medlem av Korea Biobank Network.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Metabolic cage | TEUNGDO BIO & PLANT | JD-C-66 | |
| Zoletil (50 mg/g dose) | Virbac | 1000000188 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | |
| 2% xylazine hydrochloride (Rumpun) | Byely | Q-0615-035 | |
| 4% paraformaldehyde | BIOSOLUTION | BP031 | |
| 4-0 Vicryl | ETHICON | W9443 | |
| 9-0 Vicryl | ETHICON | W2813 | |
| Antibiotic gentamicin (Septopal). | Septopal | 0409-1207-03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 5470 | |
| Citrate Buffer, ph6.0, 10X | Sigma | C9999 | |
| DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KIT | VECTOR | SK4100 | |
| Desmin | Santa Cruz | sc-23879 | |
| Elastic stain kit | ScyTeK | ETS-1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethanol | Merck | 64-17-5 | |
| Fetal Bovine Serun (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | 354400 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | A-11001 | |
| Heparin cap | Hyupsung Medical | HS-T-05 | |
| hMSC (STEMPRO) / growth medium (MesenPRO RSTM) |
Invitrogen | R7788-110 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated kit (Vectastain) | VECTOR | PK7800 | |
| Hydrogen peroxide | JUNSEI | 7722-84-1 | |
| Keratin13 | Novus | NBP1-97797 | |
| LIVE/DEAD Viability Assay Kit | Molecular Probes | L3224 | |
| Matrigel | Corning | 354262 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Sigma | 227056 | |
| Nonadherent 24-well tissue culture plates. |
Corning | 3738 | |
| OsO4 | Sigma | O5500 | |
| Petri dish | Eppendorf | 3072115 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), 10X | BIOSOLUTION | BP007a | |
| Polycaprolactone (PCL) polymer | Sigma | 440744 | |
| Polyurethane (PU+A2:A24) polymer | Lubrizol | 2363-80AE | |
| Power Supply | NanoNC | HV100 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Rumpun | Bayer | Q-0615-035 | |
| Silicone T-tube | Sewoon Medical | 2206-005 | |
| Terramycin Eye Ointment | Pfizer Pharmaceutical Korea | W01890011 | |
| Tiletamine/Zolazepam (Zoletil) | Virbac Laboratories | Q-0042-058 | |
| Trichrome stain kit | ScyTeK | TRM-1 | |
| von Willebrand Factor (vWF) | Santa Cruz | sc 14014 |
References
- Irino, T., et al. Long-term functional outcomes after replacement of the esophagus with gastric, colonic, or jejunal conduits: a systematic literature review. Diseases of the Esophagus. 30 (12), 1-11 (2017).
- Flanagan, J. C., et al. Esophagectomy and Gastric Pull-through Procedures: Surgical Techniques, Imaging Features, and Potential Complications. Radiographics. 36 (1), 107-121 (2016).
- Liu, J., Yang, Y., Zheng, C., Dong, R., Zheng, S. Surgical outcomes of different approaches to esophageal replacement in long-gap esophageal atresia: A systematic review. Medicine. (Baltimore). 96 (21), e6942 (2017).
- Luc, G., et al. Decellularized and matured esophageal scaffold for circumferential esophagus replacement: Proof of concept in a pig model. Biomaterials. 175, 1-18 (2018).
- Wang, F., Maeda, Y., Zachar, V., Ansari, T., Emmersen, J. Regeneration of the oesophageal muscle layer from oesophagus acellular matrix scaffold using adipose-derived stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (1), 271-277 (2018).
- La Francesca, S., et al. Long-term regeneration and remodeling of the pig esophagus after circumferential resection using a retrievable synthetic scaffold carrying autologous cells. Scientific Reports. 8 (1), 4123 (2018).
- Ponten, J. E., et al. Early severe mediastinal bleeding after esophagectomy: a potentially lethal complication. Journal of Thoracic Disease. 5 (2), E58-E60 (2013).
- Catry, J., et al. Circumferential Esophageal Replacement by a Tissue-engineered Substitute Using Mesenchymal Stem Cells: An Experimental Study in Mini Pigs. Cell Transplant. 26 (12), 1831-1839 (2017).
- Lee, S. J., et al. Characterization and preparation of bio-tubular scaffolds for fabricating artificial vascular grafts by combining electrospinning and a 3D printing system. Physical Chemistry Chemical Physics. 17 (5), 2996-2999 (2015).
- Kim, I. G., et al. Tissue-Engineered Esophagus via Bioreactor Cultivation for Circumferential Esophageal Reconstruction. Tissue Engineering Part A. , (2019).
- Wu, Y., et al. Combinational effects of mechanical forces and substrate surface characteristics on esophageal epithelial differentiation. Journal of Biomedical Materials Research A. 107, 552-560 (2019).
- Jensen, T., et al. Polyurethane scaffolds seeded with autologous cells can regenerate long esophageal gaps: An esophageal atresia treatment model. Journal of Pediatric Surgery. 3468 (18), 30685-30687 (2018).
- Nakase, Y., et al. Intrathoracic esophageal replacement by in situ tissue-engineered esophagus. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 136 (4), 850-859 (2008).
- Kwiatek, M. A., et al. Mechanical properties of the esophagus in eosinophilic esophagitis. Gastroenterology. 140 (1), 82-90 (2011).
- Anjum, F., et al. Biocomposite nanofiber matrices to support ECM remodeling by human dermal progenitors and enhanced wound closure. Scientific Reports. 7 (1), 10291 (2017).
- Kuppan, P., Sethuraman, S., Krishnan, U. M. PCL and PCL-gelatin nanofibers as esophageal tissue scaffolds: optimization, characterization and cell-matrix interactions. Journal of Biomedical Nanotechnology. 9 (9), 1540-1555 (2013).
