Isolement des fibroblastes dermiques humains adultes de la peau abdominale et génération de cellules souches pluripotentes induites à l'aide d'une méthode de non-intégration

Summary

La reprogrammation cellulaire nécessite l’introduction de gènes clés, qui régulent et maintiennent l’état cellulaire pluripotent. Le protocole décrit permet la formation de colonies de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) à partir de fibroblastes dermiques humains sans méthodes virales/intégratrices, mais en utilisant des ARN non modifiés (NM-ARN) combinés à des facteurs d’évasion immunitaire réduisant les mécanismes de défense cellulaire.

Abstract

Les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) pourraient être considérées, à ce jour, comme une source prometteuse de cellules pluripotentes pour la prise en charge de maladies actuellement incurables, pour la reconstitution et la régénération des tissus blessés et pour le développement de nouveaux médicaments. Malgré tous les avantages liés à l’utilisation des iPSC, tels que le faible risque de rejet, les questions éthiques moins, et la possibilité de les obtenir à la fois des patients jeunes et âgés sans aucune différence dans leur potentiel de reprogrammation, les problèmes à surmonter sont encore nombreux. En fait, la reprogrammation cellulaire menée avec des virus viraux et intégrant peut causer des infections et l’introduction de gènes requis peut induire une instabilité génomique de la cellule receveuse, altérant leur utilisation en clinique. En particulier, l’utilisation du gène c-Myc, bien connu dans plusieurs études pour son activité induisant la mutation, est très préoccupante. Les fibroblastes sont apparus comme la population cellulaire appropriée pour la reprogrammation cellulaire car ils sont faciles à isoler et à la culture et sont récoltés par une biopsie de poinçon de peau mini-invasive. Le protocole décrit ici fournit une description détaillée étape par étape de l’ensemble de la procédure, du traitement de l’échantillon pour obtenir les cultures cellulaires, le choix des réactifs et des fournitures, le nettoyage et la préparation, à la reprogrammation cellulaire au moyen d’une kit de reprogrammation non modifié des ARN (NM-ARN). Le kit de reprogrammation choisi permet une reprogrammation efficace du fibroblaste dermique humain aux iPSC et les petites colonies peuvent être vus dès 24 h après la première transfection, même avec des modifications en ce qui concerne la feuille de données standard. La procédure de reprogrammation utilisée dans ce protocole offre l’avantage d’une reprogrammation sûre, sans risque d’infections causées par des méthodes virales vectorielles, réduit les mécanismes de défense cellulaire, et permet la génération d’iPSC sans xéno, tous les caractéristiques critiques qui sont obligatoires pour d’autres applications cliniques.

Introduction

La reprogrammation cellulaire représente une nouvelle technologie pour transformer chaque cellule somatique du corps en une cellule souche pluripotente, connue sous le nom d’iPSC¹. La possibilité de reprogrammer une cellule somatique adulte à un état pluripotent et indifférencié a dépassé les limites imposées par la faible disponibilité et les questions éthiques liées à l’utilisation de cellules pluripotentes, auparavant uniquement dérivées d’embryons humains (cellules souches embryonnaires ou ESC)^2,3,4. En 2006, Kazutoshi Takahashi et Shinya Yamanaka ont mené une étude pionnière réalisant la première conversion de cellules somatiques adultes de la peau en cellules pluripotentes en ajoutant artificiellement quatre gènes spécifiques (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc)⁵. Un an plus tard, les travaux menés dans le laboratoire de Thomson ont mené à la reprogrammation réussie des cellules somatiques en iPSCs par transduction d’une combinaison différente de quatre gènes (Oct4, Sox2, Nanog, Lin28)⁶.

IPSCs offrent un certain nombre d’occasions aux scientifiques et aux chercheurs de différents domaines, tels que la médecine régénérative et la pharmacologie, étant une excellente plate-forme pour étudier et traiter différentes maladies avec un reflet génotypique des caractéristiques du patient dont ils sont dérivés. L’utilisation d’iPSC offre plusieurs avantages, y compris: le risque réduit de réponse immunitaire due à une origine complètement autologue des cellules; la possibilité de créer une bibliothèque cellulaire, un outil important pour prédire la réponse aux nouveaux médicaments et à leurs effets secondaires, car ils sont en mesure de se renouveler continuellement et de générer différents types de cellules; et la chance de développer une approche personnalisée pour l’administration de médicaments^7,8,9.

Diverses techniques sont connues à l’heure actuelle, pour induire l’expression des facteurs de reprogrammation et elles sont incluses dans deux grandes catégories : méthodes non virales et virales vectorielles^10,11,12,13. Les méthodes non virales incluent la transfection d’ARNm, l’infection/transfection de miRNA, PiggyBac, les vecteurs de minicercle et les plasmides épisomiques et exosomes^10,11,12,13. Les méthodes virales comprennent les virus non-intégration, tels que l’adénovirus, le virus Sendai et les protéines, et l’intégration de virus comme le rétrovirus et le lentivirus^10,11,12,13.

Selon plusieurs études, aucune différence significative n’a été remarquée entre ces méthodes en termes d’efficacité de la reprogrammation cellulaire, par conséquent, le choix de la méthode appropriée dépend strictement du type de cellule utilisée et des applications ultérieures des iPSC obtenus^14,15. Toutes les méthodes mentionnées montrent des inconvénients, par exemple, le virus Sendai est efficace sur tous les types de cellules, mais nécessite beaucoup de passages pour obtenir des iPSC; la reprogrammation par épisomes est excellente pour des cellules sanguines mais a besoin de modification des conditions standard de culture pour des fibroblastes ; la méthode PiggyBac pourrait représenter une alternative attrayante, mais les études dans les cellules humaines sont encore limitées et faibles^10,11,12,13. Les exosomes sont des nano-vésicules physiologiquement sécrétées dans tous les fluides corporels par les cellules. Selon des études récentes, ils sont responsables de la communication intercellulaire et peuvent jouer un rôle dans d’importants processus biologiques, tels que la prolifération cellulaire, la migration et la différenciation. Les exosomes peuvent transporter et transférer l’ARNm et le miRNA aux cellules recevables avec un mécanisme complètement naturel, car ils partagent la même composition de la membrane cellulaire¹⁶. Par conséquent, les exosomes sont une technique prometteuse de nouvelle génération pour la reprogrammation, mais leur potentiel pour reprogrammer des cellules somatiques par leur contenu est toujours à l’étude. Les méthodes basées sur les vecteurs viraux utilisent des virus modifiés afin de transmettre des gènes de reprogrammation aux cellules receveuses. Cette technique, malgré la grande efficacité de la reprogrammation, n’est pas considérée comme sûre, car l’intégration du virus dans la cellule peut être responsable de l’infection, des tératomes et de l’instabilité génomique¹⁷.

Le protocole suivant pour générer des colonies iPSC combine le cocktail de reprogrammation de Yamanaka et Thompson et est basé sur l’utilisation d’une méthode exigeant NM-ARN et les facteurs d’évasion immunitaire avec la possibilité de l’exécuter dans des conditions xéno-libres. La raison d’être de cette méthode est de diffuser, au sein de la communauté scientifique, un protocole permettant une reprogrammation rapide, simple et très efficace des fibroblastes humains adultes de la peau abdominale en iPSCs¹⁸.

Les points forts de la méthode proposée sont, en fait, la facilité de rendement et le peu de temps nécessaire pour obtenir des iPSC. En outre, la méthode évite les mécanismes de défense cellulaire et l’utilisation de vecteurs viraux, responsables des questions pertinentes.

En ce qui concerne le protocole standard, les modifications suivantes ont été apportées : (1) Les fibroblastes confluents ont été synchronisés au passage 4 en plaçant dans le sérum de 0,1 % pendant 48 h avant la trypsinisation; (2) La densité cellulaire pour la culture et le volume des réactifs ont été ajustés pour l’utilisation sur une plaque multi-puits de 24 puits au lieu d’une plaque de 6 puits; (3) L’expérience de reprogrammation a été réalisée à l’aide d’un incubateur de CO₂ de 5 % au lieu d’un incubateur avec des conditions atmosphériques (21 % O₂) ou hypoxiques (5 % O₂).

Protocol

Les spécimens de tissus humains ont été prélevés selon la Déclaration d’Helsinki tout en observant les directives de l’hôpital universitaire Federico II. Tous les patients impliqués dans cette étude ont fourni le consentement écrit. 1. Préparation des fournitures et des médias culturels Nettoyez et autoclavez une grande paire de ciseaux chirurgicaux, deux ensembles de forceps fins, deux paires de ciseaux microdissés, 1 bouteille stérile L, une bouteille stérile de 500 …

Representative Results

Le but du protocole était de reprogrammer les fibroblastes dermiques isolés de la peau abdominale en utilisant la méthode de reprogrammation non-intégration basée sur NM-ARN pour induire l’expression de facteurs spécifiques. Pour atteindre cet objectif, les fibroblastes dermiques humains ont été isolés à partir de spécimens de peau de patients subissant une chirurgie abdominale et iPSCs ont été générés introduisant Oct4, Sox2, Klf4, cMyc, Nanog, Lin28 facteurs de reprogrammation et E3, K3, B18 facteurs d’…

Discussion

IPSCs sont rapidement émerger comme le candidat cellulaire le plus prometteur pour les applications de médecine régénérative et comme un outil extrêmement utile pour la modélisation des maladies et le dépistage des médicaments^3,8. Le protocole présenté ici décrit la génération d’iPSC humains à partir d’un échantillon ayant la taille d’une biopsie de poinçon de peau avec une procédure simple et efficace qui ne nécessite aucun équipement spécif…

Materials

10 mL serological pipet	Falcon	357551	Sterile, polystyrene
100 mm plates	Falcon	351029	Treated, sterile cell culture dish
15 mL sterile tubes	Falcon	352097	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
24-well plates	Falcon	353935	Clear, flat bottom, treated multiwell cell culture plate, with lid, sterile
25 mL serological pipet	Falcon	357525	Sterile, polystyrene
35 mm plates	Falcon	353001	Treated, sterile cell culture dish
5 mL serological pipet	Falcon	357543	Sterile, polystyrene
50 mL sterile tubes	Falcon	352098	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
Advanced DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Gibco	12491-015	Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Sigma- Aldrich	D6429-500ml	Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Fetal Bovine Serum	Sigma- Aldrich	F9665-500ml	Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma- Aldrich	H1387-1L	Powder
L-glutamine	Lonza	BE17-605E	Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	INVITROGEN	13778-030	Synthetic siRNA Transfection Reagent; store at 2-8 °C
Matrigel	CORNING	354234	Basement Membrane Matrix, store at -20 °C. Avoid multiple freeze-thaws.
Neubauer Chamber	VWR	631-1116	Hemocytometer
NutriStem XF Culture Medium	Biological Industries	05-100-1A-500ml	Xeno-free, serum-free, low growth factor human ESC/iPSC culture medium. Store at -20 °C. Upon thawing, the medium may be stored at 2-8 °C for 14 days. Media should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles.
Opti-MEM	Gibco	31985-062-100ml	Reduced-Serum Medium; store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Penicillin and Streptomycin	Sigma- Aldrich	P4333-100ml	Store at -20 °C. The solution should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Potassium Chloride	Sigma- Aldrich	P9333	Powder
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma- Aldrich	P5665	Powder
RNase-free 0.5 mL tubes	Eppendorf	H0030124537	RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene
RNase-free 1.5 mL tubes	Eppendorf	H0030120086	RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene
RNaseZAP	INVITROGEN	AM9780	Cleaning agent for removing RNase
Sodium Bicarbonate	Sigma- Aldrich	S5761	Powder
Sodium Chloride	Sigma- Aldrich	S7653	Powder
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma- Aldrich	94046	Powder
StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit	Reprocell	00-0076	Third Generation NM-RNAs-based Reprogramming Kit for Cellular Reprogramming of Fibroblasts, Blood, and Urine. Store at or below -70 °C.
Trypsin-EDTA	Sigma- Aldrich	T4049-100ml	Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles