비통합 방법을 사용하여 복부 피부에서 성인 인간 진피 섬유 아세포의 분리 및 유도 만능 줄기 세포의 생성

Summary

세포 재프로그래밍은 다능성 세포 상태를 조절하고 유지하는 주요 유전자의 도입을 요구합니다. 기술된 프로토콜은 바이러스/통합 방법 없이 인간 진피 섬유아세포로부터 유도된 만능 줄기 세포(iPSCs) 콜로니의 형성을 가능하게 하지만, 세포 방어 메커니즘을 감소시키는 면역 회피 인자와 결합된 비변형 RNA(NM-RNAs)를 사용한다.

Abstract

유도 된 만능 줄기 세포 (iPSCs)는 현재까지 현재 치료 할 수없는 질병의 관리, 부상당한 조직의 재구성 및 재생 및 신약 개발을위한 다능성 세포의 유망한 공급원으로 간주 될 수 있습니다. 거부의 낮은 위험, 감소 된 윤리적 문제 및 재프로그래밍 잠재력의 차이없이 젊은 환자와 노인 환자 모두에서 얻을 수있는 가능성과 같은 iPSCs의 사용과 관련된 모든 장점에도 불구하고, 극복해야 할 문제 여전히 많다. 실제로, 바이러스 및 통합 바이러스로 행해진 세포 재프로그래밍은 감염을 일으킬 수 있고 필요한 유전자의 도입은 수용자 세포의 게놈 불안정성을 유도하여 클리닉에서의 사용을 손상시킬 수 있다. 특히, c-Myc 유전자의 사용에 대 한 많은 우려가 있다, 그것의 돌연변이 유도 활동에 대 한 여러 연구에서 잘 알려진. 섬유아세포는 세포 재프로그래밍에 적합한 세포 집단으로 나타났으며, 분리및 배양이 용이하고 최소 침습성 피부 펀치 생검에 의해 수확된다. 여기에 설명된 프로토콜은 시료 처리에서 세포 배양, 시약 및 소모품 선택, 세척 및 준비, 상업적 수단에 의한 세포 재프로그래밍에 이르기까지 전체 절차에 대한 상세한 단계별 설명을 제공합니다. 수정되지 않은 RNA(NM-RNAs) 기반 리프로그래밍 키트. 선택된 리프로그래밍 키트는 iPSCs및 작은 콜로니에 인간 진피 섬유아세포의 효과적인 재프로그래밍을 허용하고 작은 콜로니는 표준 데이터 시트에 대하여 수정되더라도, 첫번째 형질전환 후에 24 시간 일찍 보일 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 재프로그래밍 절차는 바이러스 벡터 기반 방법으로 인한 감염의 위험없이 안전한 재프로그래밍의 이점을 제공하고 세포 방어 메커니즘을 감소시키며 xeno-free iPSC의 생성을 허용합니다. 추가 임상 응용을 위해 필수인 중요한 기능.

Introduction

세포 재프로그래밍은 iPSC^1로알려져 있는 다능성 줄기 세포로 바디의 모든 체세포 세포를 변환하는 새로운 기술을 나타냅니다. 성인 체세포세포를 다능성 및 미분화 상태로 다시 재프로그래밍할 가능성은 다능성 세포의 사용과 관련된 빈약한 가용성 및 윤리적 문제에 의해 부과된 한계를 극복하였으며, 이전에는 인간 배아(배아 줄기 세포 또는^{ESC)에서만}유래할 수 있었다^2,3,4. 2006년 다카하시 카즈토시와 야마나카 신야는 4개의 특정 유전자(Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc)를 인위적으로 추가하여 피부에서 다능성 세포로의성인 체세포가 최초로 변환되는 선구적인 연구를 수행했습니다 5. 1 년 후, 톰슨의 실험실에서 수행 된 작업은 4 개의 유전자 (Oct4, Sox2, Nanog, Lin28)의 다른 조합의 변환에 의해 iPSCs로 체세포의 성공적인 재프로그래밍으로 이어졌다^6.

iPSCs는 재생 의학 및 약리학과 같은 다양한 분야의 과학자와 연구자에게 다양한 기회를 제공하며, 다른 질병을 연구하고 치료할 수 있는 훌륭한 플랫폼이며, 그(것)들이 파생되는 환자의 특성의 유전형 반사와 더불어. iPSCs의 사용은 다음과 같은 몇 가지 장점을 제공합니다 : 세포의 완전히 자가 기원으로 인한 면역 반응의 위험 감소; 세포 라이브러리를 생성할 수 있는 가능성, 새로운 약물과 그들의 부작용에 대 한 반응을 예측 하는 중요 한 도구, 그들은 지속적으로 자체 갱신 하 고 다른 세포 종류를 생성할 수 있습니다. 및 약물 투여를위한 맞춤형 접근 법을 개발할 수있는 기회^7,8,9.

다양한 기술은 현재, 재프로그래밍 인자의 발현을 유도하기 위해 알려져 있으며, 이들은 두 가지 주요 범주에 포함된다: 비바이러스 및 바이러스 벡터 기반 방법^10,11,12,13. 비 바이러스성 방법은 mRNA 형질감염, miRNA 감염/형질감염, PiggyBac, 미니서클 벡터 및 에피솜 플라스미드 및 엑소좀^{10,11,12,13을}포함한다. 바이러스 기반 방법은 아데노바이러스, 센다이 바이러스 및 단백질과 같은 비통합 바이러스를 포함하며, 레트로바이러스 및 렌티바이러스^{10,11,12,13과}같은 바이러스를 통합한다.

여러 연구에 따르면, 세포 리프로그래밍의 효과성 측면에서 이러한 방법들 사이에서 유의한 차이가 발견되지 않았으며, 따라서 적합한 방법의 선택은 사용되는 세포 유형 및^14,15를수득한 iPSCs의 후속 적용에 따라 엄격하게 의존한다. 언급된 모든 방법은 단점을 보여 준다, 예를 들어, 센다이 바이러스는 모든 세포 유형에 효과적이지만, iPSCs를 얻기 위해 많은 구절이 필요합니다; 에피솜에 의한 재프로그래밍은 혈액 세포에 우수하지만 섬유아세포에 대한 표준 배양 조건의 수정이 필요합니다. PiggyBac 방법은 매력적인 대안을 나타낼 수 있지만 인간 세포에 대한 연구는 여전히 제한적이며 약한^10,11,12,13. 엑소좀은 나노 소포생리학적으로 세포에 의해 모든 체액으로 분비됩니다. 최근 연구에 따르면, 그들은 세포 간 통신에 대 한 책임 및 중요 한 생물학적 프로세스에 역할을 가질 수 있습니다., 세포 증식 등, 마이그레이션 및 분화. 엑소좀은^{세포막(16)의}동일한 조성을 공유하기 때문에 완전히 자연적인 메커니즘을 가진 수용자 세포로 mRNA 및 miRNA를 수송하고 전달할 수 있다. 따라서, 엑소좀은 재프로그래밍을 위한 유망한 차세대 기술이지만, 그들의 내용에 의해 체세포세포를 재프로그래밍할 수 있는 잠재력은 아직 조사 중이다. 바이러스 벡터 기반 방법은 수신자 세포에 재프로그래밍 유전자를 전달하기 위해 수정 된 바이러스를 사용합니다. 이 기술은, 리프로그래밍의 높은 효율에도 불구하고, 세포 내의 바이러스의 통합이 감염, 기형종 및 게놈 불안정성을 담당할 수 있기 때문에 안전한 것으로 간주되지 않는다^17.

iPSCs 콜로니를 생성하는 다음 프로토콜은 야마나카와 톰슨의 리프로그래밍 칵테일을 결합하고 NM-RNA 및 면역 회피 인자를 필요로하는 방법의 사용을 기반으로 합니다. 이 방법의 사용 뒤에 근거는^iPSCs18로복부 피부에서 성인 인간 섬유아세포의 신속하고, 간단하고 매우 효과적인 재프로그래밍을 허용하는 프로토콜, 과학 적인 지역 사회 내의 퍼지는 것입니다.

제안 된 방법의 강점은 사실, 성능의 용이성과 iPSC를 획득하는 데 필요한 짧은 시간입니다. 또한, 방법은 세포 방어 메커니즘 및 바이러스 벡터의 사용을 방지, 관련 문제에 대 한 책임.

표준 프로토콜에 대하여, 다음과 같은 변형이 이루어졌다: (1) 결합섬유아세포는 트립시네화 전에 48시간 동안 0.1% 혈청에 배치됨으로써 통로 4에서 동기화되었다; (2) 배양세포 밀도 및 시약의 부피는 6웰 플레이트 대신 24웰 멀티웰 플레이트의 활용도를 조정하였다; (3) 재프로그래밍 실험은 대기(21%_O2) 또는 저산소(5%_O2)조건을 가진 인큐베이터 대신 5%_CO2인큐베이터를 사용하여 수행하였다.

Protocol

인간 조직에서 견본은 대학 병원 페데리코 II 지침을 관찰하는 동안 헬싱키의 선언에 따라 수집되었다. 이 연구에 관여하는 모든 환자는 서면 동의를 제공했습니다. 1. 보급품 및 문화 미디어 준비 수술용 가위 1쌍, 미세 집게 2세트, 미세 한 두 쌍, 미세 분절 가위 2쌍, 멸균 병 1개, 500mL 멸균 병, 250mL 멸균 병. 100mm 플레이트, 60mm 플레이트, 35mm 플레이트, 일회용 메?…

Representative Results

프로토콜의 목적은 NM-RNA에 기초한 비통합 재프로그래밍 방법을 사용하여 복부 피부로부터 분리된 진피 섬유아세포를 재프로그래밍하여 특정 인자의 발현을 유도하는 것이었다. 이러한 목표를 달성하기 위해, 인간 진피 섬유아세포는 배턱 수술을 받은 환자의 피부 표본으로부터 분리되었고 iPSCs는 NM-RNA 및 마이크로RNA 기술을 결합한 상업적 기성 용 재프로그래밍 키트에 의해 Oct4, Sox2, Klf4, CMyc, Nan…

Discussion

iPSCs는 재생 의학 응용 분야에서 가장 유망한 세포 후보로 빠르게 부상하고 있으며 질병 모델링 및 약물^{검사를위한}대단히 유용한 도구로^3,8. 여기에 제시된 프로토콜은 특정 장비 또는 리프로그래밍 기술에 대한 이전의 경험이 필요하지 않은 간단하고 효율적인 절차로 피부 펀치 생검의 크기를 갖는 샘플로부터 인간 iPSCs의 생성을 설명합니다.

<p class…

Materials

10 mL serological pipet	Falcon	357551	Sterile, polystyrene
100 mm plates	Falcon	351029	Treated, sterile cell culture dish
15 mL sterile tubes	Falcon	352097	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
24-well plates	Falcon	353935	Clear, flat bottom, treated multiwell cell culture plate, with lid, sterile
25 mL serological pipet	Falcon	357525	Sterile, polystyrene
35 mm plates	Falcon	353001	Treated, sterile cell culture dish
5 mL serological pipet	Falcon	357543	Sterile, polystyrene
50 mL sterile tubes	Falcon	352098	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
Advanced DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Gibco	12491-015	Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Sigma- Aldrich	D6429-500ml	Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Fetal Bovine Serum	Sigma- Aldrich	F9665-500ml	Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma- Aldrich	H1387-1L	Powder
L-glutamine	Lonza	BE17-605E	Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	INVITROGEN	13778-030	Synthetic siRNA Transfection Reagent; store at 2-8 °C
Matrigel	CORNING	354234	Basement Membrane Matrix, store at -20 °C. Avoid multiple freeze-thaws.
Neubauer Chamber	VWR	631-1116	Hemocytometer
NutriStem XF Culture Medium	Biological Industries	05-100-1A-500ml	Xeno-free, serum-free, low growth factor human ESC/iPSC culture medium. Store at -20 °C. Upon thawing, the medium may be stored at 2-8 °C for 14 days. Media should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles.
Opti-MEM	Gibco	31985-062-100ml	Reduced-Serum Medium; store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Penicillin and Streptomycin	Sigma- Aldrich	P4333-100ml	Store at -20 °C. The solution should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Potassium Chloride	Sigma- Aldrich	P9333	Powder
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma- Aldrich	P5665	Powder
RNase-free 0.5 mL tubes	Eppendorf	H0030124537	RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene
RNase-free 1.5 mL tubes	Eppendorf	H0030120086	RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene
RNaseZAP	INVITROGEN	AM9780	Cleaning agent for removing RNase
Sodium Bicarbonate	Sigma- Aldrich	S5761	Powder
Sodium Chloride	Sigma- Aldrich	S7653	Powder
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma- Aldrich	94046	Powder
StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit	Reprocell	00-0076	Third Generation NM-RNAs-based Reprogramming Kit for Cellular Reprogramming of Fibroblasts, Blood, and Urine. Store at or below -70 °C.
Trypsin-EDTA	Sigma- Aldrich	T4049-100ml	Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles