腹部皮膚からの成人ヒト皮膚線維芽細胞の分離と非積分法を用いた人工多能性幹細胞の生成

Summary

細胞リプログラミングでは、多能性細胞状態を調節し維持する主要遺伝子の導入が必要です。記載されたプロトコルは、ウイルス/統合方法なしでヒト皮膚線維芽細胞からの誘導多能性幹細胞(iPSC)コロニーの形成を可能にするが、非修飾RNA(NM-RNA)を免疫回避因子と組み合わせて細胞防御機構を低下させる。

Abstract

人工多能性幹細胞(iPSC)は、現在治療不可能な疾患の管理、傷ついた組織の再構成と再生、および新薬の開発のための多能性細胞の有望な供給源と考えることができる。拒絶反応のリスクが低い、倫理的な問題が減り、再プログラミングの可能性に違いもなく老若男女両方の患者からそれらを得る可能性など、iPSCの使用に関連するすべての利点にもかかわらず、克服すべき問題まだ数多くあります。実際、ウイルスと統合ウイルスで行われる細胞リプログラミングは感染症を引き起こし、必要な遺伝子の導入はレシピエント細胞のゲノム不安定性を誘発し、クリニックでの使用を損なう可能性があります。特に、c-Myc遺伝子の使用に関する多くの懸念があり、その突然変異誘導活性に関するいくつかの研究からよく知られている。線維芽細胞は、細胞リプログラミングに適した細胞集団として出現し、分離や培養が容易であり、低侵襲の皮膚パンチ生検によって収穫される。ここで説明するプロトコルは、サンプル処理から細胞培養物を得るためのサンプル処理から、試薬や供給品の選択、洗浄と調製、商業的な手段による細胞リプログラミングまで、手順全体の詳細なステップバイステップの説明を提供します。非変更 RNA (NM-RNA) ベースのリプログラミング キット。選択されたリプログラミングキットは、iPSCおよび小さなコロニーへのヒト真皮線維芽細胞の効果的なリプログラミングを可能にし、標準的なデータシートに関する変更を加えても、最初のトランスフェクションの後に早くも24時間見ることができます。このプロトコルで使用されるリプログラミング手順は、ウイルスベクターベースの方法によって引き起こされる感染のリスクなしに、安全なリプログラミングの利点を提供し、細胞の防御メカニズムを低減し、ゼノフリーiPSCの生成を可能にします。さらなる臨床適用のために必須である重要な特徴。

Introduction

細胞リプログラミングは、体のすべての体細胞をiPSC¹として知られる多能性幹細胞に変換する新しい技術を表しています。成人体細胞を多能性および未分化状態に再プログラミングする可能性は、多能性細胞の使用に関連する利用可能性と倫理的問題によって課される限界を克服し、以前はヒト胚(胚性幹細胞またはESC)2、3、4からしか導出できなかった。2006年、高橋和俊と山中伸弥は、4つの特定の遺伝子を人工的に加えることで、成人の体細胞を皮膚から多能性細胞に初めて変換する先駆的な研究を行った(Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc)^5.1年後、トムソンの研究室で行われた作業は、4つの遺伝子の異なる組み合わせ(Oct4、Sox2、Nanog、Lin28)6の異なる組み合わせの伝達によって、体細胞をiPSCに再プログラミングすることに成功しました。

iPSCは、再生医療や薬理学など、さまざまな分野の科学者や研究者に多くの機会を提供し、異なる疾患を研究し、それらが由来する患者の特性のゲノム反射と共に治療するための優れたプラットフォームです。iPSCの使用は、細胞の完全に自家起源による免疫応答のリスクの低減を含むいくつかの利点を提供します。彼らは継続的に自己更新し、異なる細胞タイプを生成することができるので、新薬とその副作用への応答を予測するための重要なツール、細胞ライブラリを作成する可能性;薬物投与のためのカスタマイズされたアプローチを開発する機会^7,8,9.

現在、多様な技術が知られており、リプログラミング因子の発現を誘導し、それらは2つの主要なカテゴリーに含まれている:非ウイルスおよびウイルスベクターベースの方法10、11、12、13。非ウイルス法は、mRNAトランスフェクション、miRNA感染/トランスフェクション、ピギーバク、ミニサークルベクターおよびエピソソームプラスミドおよびエキソソーム^{10、11、12、13}を含む。ウイルスベースの方法は、アデノウイルス、センダイウイルスおよびタンパク質などの非統合ウイルス、およびレトロウイルスおよびレンチウイルス^{10、11、12、13}のようなウイルスを統合する。

いくつかの研究によれば、細胞リプログラミングの有効性の点でこれらの方法の間で有意な差は見られなっていないが、したがって、適切な方法の選択は、使用される細胞タイプ^{および得られた}iPSCの後続の用途に厳密に依存^する。前述のすべての方法は、例えば、センダイウイルスはすべての細胞タイプに有効であるが、iPSCを得るために多くの通路を必要とする欠点を示しています。エピソームによるリプログラミングは、血液細胞にとって優れていますが、線維芽細胞の標準的な培養条件の変更が必要です。PiggyBac法は魅力的な代替手段を表す可能性がありますが、ヒト細胞の研究はまだ限られており、弱い10、11、12、13.エキソソームは、細胞によってすべての体液に生理学的に分泌されるナノ小胞である。最近の研究によると、彼らは細胞間通信を担当し、細胞の増殖、移行、分化などの重要な生物学的プロセスに役割を持つことができます。エキソソームは、細胞膜¹⁶の同じ組成を共有するので、完全に自然なメカニズムを有するレシピエント細胞にmRNAおよびmiRNAを輸送および伝達することができる。したがって、エキソソームはリプログラミングのための有望な新世代技術ですが、その内容によって体細胞を再プログラムする可能性はまだ調査中です。ウイルスベクターベースの方法は、レシピエント細胞にリプログラミング遺伝子を伝えるために改変されたウイルスを使用します。この技術は、リプログラミングの高効率にもかかわらず、細胞内のウイルスの統合が感染、奇形腫およびゲノム不安定性¹⁷を引き起こし得るとして、安全であるとは考えられていない。

iPSCコロニーを生成する次のプロトコルは、山中とトンプソンのリプログラミングカクテルを組み合わせ、NM-RNAと免疫回避因子を必要とする方法の使用に基づいており、ゼノフリー条件でそれを実行する可能性があります。この方法の使用の背後にある根拠は、科学界内で、腹部皮膚からiPSC¹⁸への成人ヒト線維芽細胞の迅速かつシンプルかつ非常に効果的なリプログラミングを可能にするプロトコルを広めることである。

提案された方法の強みは、実際には、性能の容易さとiPSCの取得に要する短い時間です。さらに、この方法は、細胞の防御メカニズムとウイルスベクターの使用を回避し、関連する問題を担当します。

標準プロトコルに関しては、以下の改変が行われました:(1)コンフルエント線維芽細胞は、トリプシン化の前に48時間0.1%の血清に配置することによって通路4で同期しました。(2)培養用の細胞密度と試薬の体積は、6ウェルプレートの代わりに24ウェルマルチウェルプレート上の利用のために調整した。(3)リプログラミング実験は、大気(21%O2)または低酸素(5%O2)条件のインキュベーターの代わりに5%CO2インキュベーターを用いて行った。

Protocol

ヒト組織からの標本は、大学病院フェデリコIIガイドラインを観察しながら、ヘルシンキ宣言に従って収集された。この研究に関与するすべての患者は書面による同意を提供した。 1. 物資・文化メディアの準備 1組の大きな外科用ハサミ、2組の細かい鉗子、2組の微小分離ハサミ、1L滅菌ボトル、500 mL滅菌ボトル、250mL滅菌ボトルを清潔でオートクレーブします。</l…

Representative Results

このプロトコルの目的は、NM-RNAに基づく非統合リプログラミング法を用いて腹部皮膚から分離された皮膚線維芽細胞を再プログラムし、特定の因子の発現を誘導することであった。この目標を達成するために、ヒト皮膚線維芽細胞をおなかのタック手術を受けた患者の皮膚標本から単離し、iPSCはOct4、Sox2、Klf4、cMyc、ナノグ、Lin28リプログラミング因子およびE3、K3、B18免疫回避因子を導入し?…

Discussion

iPSCは、再生医療用途の最も有望な細胞候補として、また疾患モデリングおよび薬物検査^のための非常に有用なツールとして急速に出現しています^3,8.ここで提示されるプロトコルは、特定の機器やリプログラミング技術の経験を必要としないシンプルで効率的な手順で、スキンパンチ生検のサイズを持つサンプルからのヒトiPSCの生成について説明?…

Materials

10 mL serological pipet	Falcon	357551	Sterile, polystyrene
100 mm plates	Falcon	351029	Treated, sterile cell culture dish
15 mL sterile tubes	Falcon	352097	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
24-well plates	Falcon	353935	Clear, flat bottom, treated multiwell cell culture plate, with lid, sterile
25 mL serological pipet	Falcon	357525	Sterile, polystyrene
35 mm plates	Falcon	353001	Treated, sterile cell culture dish
5 mL serological pipet	Falcon	357543	Sterile, polystyrene
50 mL sterile tubes	Falcon	352098	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
Advanced DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Gibco	12491-015	Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Sigma- Aldrich	D6429-500ml	Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Fetal Bovine Serum	Sigma- Aldrich	F9665-500ml	Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma- Aldrich	H1387-1L	Powder
L-glutamine	Lonza	BE17-605E	Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	INVITROGEN	13778-030	Synthetic siRNA Transfection Reagent; store at 2-8 °C
Matrigel	CORNING	354234	Basement Membrane Matrix, store at -20 °C. Avoid multiple freeze-thaws.
Neubauer Chamber	VWR	631-1116	Hemocytometer
NutriStem XF Culture Medium	Biological Industries	05-100-1A-500ml	Xeno-free, serum-free, low growth factor human ESC/iPSC culture medium. Store at -20 °C. Upon thawing, the medium may be stored at 2-8 °C for 14 days. Media should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles.
Opti-MEM	Gibco	31985-062-100ml	Reduced-Serum Medium; store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Penicillin and Streptomycin	Sigma- Aldrich	P4333-100ml	Store at -20 °C. The solution should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Potassium Chloride	Sigma- Aldrich	P9333	Powder
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma- Aldrich	P5665	Powder
RNase-free 0.5 mL tubes	Eppendorf	H0030124537	RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene
RNase-free 1.5 mL tubes	Eppendorf	H0030120086	RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene
RNaseZAP	INVITROGEN	AM9780	Cleaning agent for removing RNase
Sodium Bicarbonate	Sigma- Aldrich	S5761	Powder
Sodium Chloride	Sigma- Aldrich	S7653	Powder
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma- Aldrich	94046	Powder
StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit	Reprocell	00-0076	Third Generation NM-RNAs-based Reprogramming Kit for Cellular Reprogramming of Fibroblasts, Blood, and Urine. Store at or below -70 °C.
Trypsin-EDTA	Sigma- Aldrich	T4049-100ml	Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles