מתכנות התא מחייב הקדמה של גנים מרכזיים, אשר לווסת ולתחזק את מצב התאים pluriפוטנטי. הפרוטוקול המתואר מאפשר היווצרות של תאי גזע מושרה pluripotent iPSCs) מושבות של האדם המעטפת הגוף ללא ויראלי/שילוב שיטות אך באמצעות RNAs שאינו משתנה (ננומטר-RNAs) בשילוב עם גורמי התחמקות החיסון הפחתת מנגנוני ההגנה הסלולריים.
כתוצאה מפגיעה בתאי גזע (iPSCs) יכולה להיחשב, עד היום, מקור מבטיח של תאים בעלי עוצמה לניהול המחלות הבלתי ניתן לטיפול כרגע, עבור החוקה והתחדשות של רקמות פצועות ולפיתוח תרופות חדשות. למרות כל היתרונות הנוגעים לשימוש ב-iPSCs, כגון הסיכון הנמוך של דחייה, הסוגיות האתיות ההפדלות, והאפשרות להשיג אותם מחולים צעירים וישנים ללא כל הבדל בפוטנציאל התכנות שלהם, בעיות להתגבר על הם עדיין רבים. למעשה, תא מתכנות שנערך עם ויראלי ושילוב וירוסים יכול לגרום לזיהומים המבוא של גנים נדרשים יכול לגרום לחוסר יציבות גנומית של תא הנמען, פגיעה בשימוש שלהם במרפאה. בפרט, יש חששות רבים לגבי השימוש ב-c-Myc גן, ידוע מספר מחקרים לפעילות מוטציה שלה ממריץ. פיברותקיעות התפתחה כאוכלוסיית התא המתאים לתיכנות מחודש של הסלולר כפי שהם קל לבודד את התרבות, הם נקצרו על ידי ניקוב העור פולשנית מינימלית. הפרוטוקול המתואר כאן מספק תיאור מפורט צעד אחר צעד של ההליך כולו, מעיבוד לדוגמה כדי להשיג תרביות תאים, בחירת ריאגנטים ואספקה, ניקוי והכנה, לתא התיכנות מראש על ידי האמצעים של מסחרי ערכת הניתנת לתיכנות מבוססת RNAs (NM-RNAs) שאינה משתנה. הערכה הניתנת לתיכנות מראש מאפשר התכנות מראש יעיל של האדם העור פיברוהפיצוץ כדי iPSCs ומושבות קטנות ניתן לראות מוקדם ככל 24 h לאחר העברה הראשון, גם עם שינויים עם הכבוד לגליון הנתונים הרגיל. הליך התיכנות מחודש המשמש בפרוטוקול זה מציע את היתרון של בטוח תכנות מחודש, ללא הסיכון של זיהומים הנגרמים על ידי נגיפי שיטות וקטורים מבוססי, מפחית את מנגנוני ההגנה הסלולרית, ומאפשר את הדור של xeno iPSCs חינם, כל תכונות קריטיות הכרחיות עבור יישומים קליניים נוספים.
תכנות התא מייצג טכנולוגיה חדשנית להפוך כל תא הסומטיים של הגוף לתוך תא גזע pluripotent המכונה iPSC1. האפשרות לתיכנות מחודש של תא סומטיים למבוגרים בחזרה למצב pluripotent מובחן יש להתגבר על המגבלות המוטלות על ידי זמינות העניים וסוגיות אתיות הקשורות לשימוש בתאי pluriפוטנטי, בעבר רק ללעג של עוברי אדם (תאי גזע עובריים או ESC)2,3,4. בשנת 2006, Kazutoshi טקהאשי ושינייה יאמאנאקה ערכו מחקר חלוצי השגת ההמרה הראשונה של תאים סומטיים בוגרים מהעור לתאים בעלי עוצמה מלאכותית על ידי הוספת ארבעה גנים ספציפיים (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc)5. שנה לאחר מכן, העבודה שנערכה במעבדה של תומסון הובילה לתכנות מחדש של תאים סומטיים לתוך iPSCs על ידי התמרה של שילוב שונה של ארבעה גנים (Oct4, Sox2, Nanog, Lin28)6.
iPSCs מציעים מספר הזדמנויות למדענים וחוקרים של תחומים שונים, כגון רפואה רגנרטיבית ופרמקולוגיה, להיות פלטפורמה מצוינת ללמוד ולטפל במחלות שונות יחד עם השתקפות genotypic של המאפיינים של המטופל שהם נגזר. השימוש ב iPSCs מספק מספר יתרונות כולל: סיכון מופחת לתגובה חיסונית בשל מקור אוטוולוגי לחלוטין של תאים; האפשרות של יצירת ספריית תאים, כלי חשוב כדי לנבא את התגובה לתרופות חדשות ואת תופעות הלוואי שלהם, כפי שהם מסוגלים ברציפות לחדש את עצמי וליצור סוגי תאים שונים; וההזדמנות לפתח גישה מותאמת אישית. למנהל התרופות7,8,9
טכניקות מגוונות ידועות כיום, כדי לגרום לביטוי של גורמי תכנות משנה והם נכללים בשתי קטגוריות עיקריות: שיטות וקטוריות שאינן ויראליות ונגיפי10,11,12,13. שיטות שאינן ויראליות כוללות העברה של mrna, זיהום/העברה, העברה, מיני וקטורים ו אפיזומיום ואקזומים10,11,12,13. שיטות המבוססות על ויראלי כוללות וירוסים שאינם משתלבים, כגון אדנווירוס, וירוס סנדאי וחלבונים, ושילוב וירוסים כמו רטרווירוס ו-וירוס10,11,12,13.
לדברי מספר מחקרים, אין הבדלים משמעותיים הבחין בין שיטות אלה במונחים של יעילות של תא מתיכנות מראש, ומכאן, הבחירה של השיטה המתאימה תלוי לחלוטין בסוג התא המשמש וביישומים הבאים של iPSCs שהתקבלו14,15. כל השיטות שהוזכרו להראות חסרונות, למשל, וירוס סנדאי הוא יעיל בכל סוגי התאים, אבל דורש הרבה מעברים כדי להשיג iPSCs; מתכנות מראש על ידי אפיזומים מצוין עבור תאי דם, אבל צריך שינוי של תנאי התרבות הסטנדרטיים לפיברופיצוצים; השיטה מסוגלת לייצג חלופה אטרקטיבית אך מחקרים בתאי האדם עדיין מוגבלים וחלשים10,11,12,13. אקסוזומים הם ננו-שלפוחית פיזיולוגית המופרש לתוך נוזלי הגוף בתאים. לפי המחקרים האחרונים, הם אחראים לתקשורת בין-תאית ויכולים להיות בעלי תפקיד בתהליכים ביולוגיים חשובים, כגון הפצת תאים, הגירה ובידול. אקסוזומים יכול להעביר ולהעביר mRNA ו miRNA לתאי הנמען עם מנגנון טבעי לחלוטין, כפי שהם חולקים את הרכב זהה של קרום התא16. לכן, האקסוזומים היא טכניקת הדור החדש והמבטיח לתכנות, אך הפוטנציאל שלהם לתכנות מיתכנת תאים סומטיים על-ידי תוכנם עדיין נמצא בחקירה. ויראלי וקטורים מבוססי שיטות להשתמש וירוסים שונה כדי להעביר גנים מתיכנות לתאי הנמען. טכניקה זו, למרות היעילות הגבוהה של תכנות מראש, אינו נחשב בטוח, כמו שילוב של הנגיף בתוך התא יכול להיות אחראי על זיהום, teratomas ויציבות גנומית17.
הפרוטוקול הבא כדי לייצר מושבות iPSCs משלבת את הקוקטייל התכנות של יאמאנאקה ו תומפסון והוא מבוסס על השימוש בשיטה הדורשת NM-RNAs וגורמי התחמקות החיסונית עם האפשרות לבצע את זה בתנאי xeno-חינם. הרציונל מאחורי השימוש בשיטה זו הוא להתפשט, בתוך הקהילה המדעית, פרוטוקול המאפשר תכנות מהיר, פשוט, יעיל מאוד של העור האנושי מפני הבטן לתוך iPSCs18.
היתרונות של השיטה המוצעת הם, למעשה, את קלות הביצועים ואת הזמן הקצר הדרוש כדי להשיג iPSCs. יתרה מזאת, השיטה נמנעת ממנגנוני הגנה סלולאריים והשימוש בווקטורים ויראליות, האחראים לסוגיות רלוונטיות.
ביחס לפרוטוקול הסטנדרטי, נעשו השינויים הבאים: (1) פיברולזציה שוטפת סונכרנו במעבר 4 על ידי הצבת ב 0.1% סרום עבור 48 h לפני הטריסינוניזציה; (2) הצפיפות התאית לתרבות ולנפח של ריאגנטים הותאמו לניצול על צלחת מרובת היטב של 24 שעות במקום צלחת של 6 היטב; (3) ניסוי תכנות מחודש בוצע באמצעות אינקובטור 5% CO2 במקום אינקובטור עם אטמוספרית (21% o2) או ארוי (5% o2) תנאים.
iPSCs הם מתעוררים במהירות כמו המועמד התא המבטיח ביותר עבור יישומים רפואה רגנרטיבית וככלי מאוד שימושי עבור דוגמנות מחלות ובדיקות סמים3,8. הפרוטוקול המוצג כאן מתאר את הדור של iPSCs אנושי ממדגם בעל גודל של ניקוב עור ביופסיה עם הליך פשוט ויעיל שאינו דורש שום ציוד ספצ…
The authors have nothing to disclose.
למחברים אין ותודות.
10 mL serological pipet | Falcon | 357551 | Sterile, polystyrene |
100 mm plates | Falcon | 351029 | Treated, sterile cell culture dish |
15 mL sterile tubes | Falcon | 352097 | Centrifuge sterile tubes, polypropylene |
24-well plates | Falcon | 353935 | Clear, flat bottom, treated multiwell cell culture plate, with lid, sterile |
25 mL serological pipet | Falcon | 357525 | Sterile, polystyrene |
35 mm plates | Falcon | 353001 | Treated, sterile cell culture dish |
5 mL serological pipet | Falcon | 357543 | Sterile, polystyrene |
50 mL sterile tubes | Falcon | 352098 | Centrifuge sterile tubes, polypropylene |
Advanced DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco | 12491-015 | Store at 2-8 °C; avoid exposure to light |
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Sigma- Aldrich | D6429-500ml | Store at 2-8 °C; avoid exposure to light |
Fetal Bovine Serum | Sigma- Aldrich | F9665-500ml | Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
Hank's Balanced Salt Solution | Sigma- Aldrich | H1387-1L | Powder |
L-glutamine | Lonza | BE17-605E | Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | INVITROGEN | 13778-030 | Synthetic siRNA Transfection Reagent; store at 2-8 °C |
Matrigel | CORNING | 354234 | Basement Membrane Matrix, store at -20 °C. Avoid multiple freeze-thaws. |
Neubauer Chamber | VWR | 631-1116 | Hemocytometer |
NutriStem XF Culture Medium | Biological Industries | 05-100-1A-500ml | Xeno-free, serum-free, low growth factor human ESC/iPSC culture medium. Store at -20 °C. Upon thawing, the medium may be stored at 2-8 °C for 14 days. Media should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles. |
Opti-MEM | Gibco | 31985-062-100ml | Reduced-Serum Medium; store at 2-8 °C; avoid exposure to light |
Penicillin and Streptomycin | Sigma- Aldrich | P4333-100ml | Store at -20 °C. The solution should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |
Potassium Chloride | Sigma- Aldrich | P9333 | Powder |
Potassium Phosphate Monobasic | Sigma- Aldrich | P5665 | Powder |
RNase-free 0.5 mL tubes | Eppendorf | H0030124537 | RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene |
RNase-free 1.5 mL tubes | Eppendorf | H0030120086 | RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene |
RNaseZAP | INVITROGEN | AM9780 | Cleaning agent for removing RNase |
Sodium Bicarbonate | Sigma- Aldrich | S5761 | Powder |
Sodium Chloride | Sigma- Aldrich | S7653 | Powder |
Sodium Phosphate Dibasic | Sigma- Aldrich | 94046 | Powder |
StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit | Reprocell | 00-0076 | Third Generation NM-RNAs-based Reprogramming Kit for Cellular Reprogramming of Fibroblasts, Blood, and Urine. Store at or below -70 °C. |
Trypsin-EDTA | Sigma- Aldrich | T4049-100ml | Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles |