Isolamento de fibroblastos dérmicos humanos adultos da pele abdominal e geração de células-tronco pluripotentes induzidas usando um método não integrador

Summary

A reprogramação celular requer a introdução de genes-chave, que regulam e mantêm o estado celular pluripotente. O protocolo descrito permite a formação de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) colônias de fibroblastos dérmicos humanos sem métodos virais/integradores, mas usando RNAs não modificados (NM-RNAs) combinados com fatores de evasão imunológica reduzindo os mecanismos de defesa celular.

Abstract

As células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) poderiam ser consideradas, até o momento, uma fonte promissora de células pluripotentes para o manejo de doenças atualmente intratáveis, para a reconstituição e regeneração de tecidos feridos e para o desenvolvimento de novos medicamentos. Apesar de todas as vantagens relacionadas ao uso de iPSCs, como o baixo risco de rejeição, as questões éticas diminuídas e a possibilidade de obtê-las de pacientes jovens e idosos sem qualquer diferença em seu potencial de reprogramação, problemas para superar ainda são numerosos. Na verdade, a reprogramação celular realizada com vírus virais e integradores pode causar infecções e a introdução de genes necessários pode induzir uma instabilidade genômica da célula receptora, prejudicando seu uso na clínica. Em particular, há muitas preocupações sobre o uso do gene c-Myc, bem conhecido de vários estudos para a sua atividade indutora de mutação. Fibroblastos surgiram como a população celular adequada para reprogramação celular como eles são fáceis de isolar e cultura e são colhidas por uma biópsia de perfuração da pele minimamente invasiva. O protocolo aqui descrito fornece uma descrição detalhada passo a passo de todo o procedimento, desde o processamento de amostras até a obtenção de culturas celulares, escolha de reagentes e suprimentos, limpeza e preparação, até a reprogramação celular por meio de um comercial RNAs não modificados (NM-RNAs) kit de reprogramação baseada em RNAs. O kit de reprogramação escolhido permite uma reprogramação eficaz do fibroblasto dérmico humano para iPSCs e pequenas colônias pode ser visto tão cedo quanto 24 h após a primeira transfecção, mesmo com modificações no que diz respeito à folha de dados padrão. O procedimento de reprogramação utilizado neste protocolo oferece a vantagem de uma reprogramação segura, sem o risco de infecções causadas por métodos virais baseados em vetores, reduz os mecanismos de defesa celular e permite a geração de iPSCs livres de xeno, todos características críticas que são obrigatórias para novas aplicações clínicas.

Introduction

A reprogramação celular representa uma nova tecnologia para transformar todas as células somáticas do corpo em uma célula-tronco pluripotente, conhecida como iPSC^1. A possibilidade de reprogramar uma célula somática adulta de volta a um estado pluripotente e indiferenciado superou os limites impostos pela baixa disponibilidade e questões éticas relacionadas ao uso de células pluripotentes, anteriormente derivadas apenas de embriões humanos (células-tronco embrionárias ou ESC)^2,3,4. Em 2006, Kazutoshi Takahashi e Shinya Yamanaka realizaram um estudo pioneiro alcançando a primeira conversão de células somáticas adultas da pele em células pluripotentes adicionando artificialmente quatro genes específicos (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc)⁵. Um ano depois, o trabalho realizado no laboratório da Thomson levou à reprogramação bem-sucedida de células somáticas em iPSCs por transdução de uma combinação diferente de quatro genes (Oct4, Sox2, Nanog, Lin28)⁶.

Os iPSCs oferecem uma série de oportunidades para cientistas e pesquisadores de diferentes áreas, como medicina regenerativa e farmacologia, sendo uma excelente plataforma para estudar e tratar diferentes doenças, juntamente com um reflexo genotípico das características do paciente de que são derivados. O uso de iPSCs fornece várias vantagens, incluindo: o risco reduzido de resposta imune devido a uma origem completamente autóloga das células; a possibilidade de criar uma biblioteca celular, uma ferramenta importante para prever a resposta a novas drogas e seus efeitos colaterais, pois eles são capazes de se auto-renovar continuamente e gerar diferentes tipos de células; e a chance de desenvolver uma abordagem personalizada para a administração de medicamentos^7,8,9.

Diversas técnicas são conhecidas no momento, para induzir a expressão dos fatores de reprogramação e estão incluídas em duas categorias principais: métodos não virais e virais baseados em vetores^10,11,12,13. Métodos não virais incluem transfecção de mRNA, infecção/transfecção de miRNA, PiggyBac, vetores de minicírculos e plasmídeos episómicos e exossomos^10,11,12,13. Métodos baseados em vírus incluem vírus não integradores, como Adenovírus, vírus Sendai e proteínas, e integração de vírus como Retrovírus e Lentivirus^10,11,12,13.

De acordo com vários estudos, não foram observadas diferenças significativas entre esses métodos em termos de eficácia da reprogramação celular, portanto, a escolha do método adequado depende estritamente do tipo celular utilizado e das aplicações subsequentes dos iPSCs obtidos^14,15. Todos os métodos mencionados mostram desvantagens, por exemplo, o vírus Sendai é eficaz em todos os tipos de células, mas requer um monte de passagens para obter iPSCs; reprogramação por epísmios é excelente para as células do sangue, mas precisa de modificação das condições culturais padrão para fibroblastos; o método PiggyBac poderia representar uma alternativa atraente, mas os estudos em células humanas ainda são limitados e fracos^10,11,12,13. Exossomos são nano-vesículas fisiologicamente secretadas em todos os fluidos corporais por células. De acordo com estudos recentes, eles são responsáveis pela comunicação intercelular e podem ter um papel em importantes processos biológicos, como proliferação celular, migração e diferenciação. Exossomos podem transportar e transferir mRNA e miRNA para células receptoras com um mecanismo completamente natural, pois compartilham a mesma composição da membrana celular¹⁶. Portanto, exossomos são uma técnica promissora de nova geração para reprogramação, mas seu potencial para reprogramar células somáticas por seu conteúdo ainda está investigação. Métodos baseados em vetores virais usam vírus modificados para transmitir genes de reprogramação para as células receptoras. Esta técnica, apesar da alta eficiência da reprogramação, não é considerada segura, pois a integração do vírus dentro da célula pode ser responsável pela infecção, teratópodes e instabilidade genômica¹⁷.

O seguinte protocolo para gerar colônias de iPSCs combina o coquetel de reprogramação de Yamanaka e Thompson e é baseado no uso de um método que exige NM-RNAs e fatores de evasão imunológica com a possibilidade de realizá-lo em condições livres de xeno. A lógica por trás do uso deste método é se espalhar, dentro da comunidade científica, um protocolo que permite uma reprogramação rápida, simples e altamente eficaz de fibroblastos humanos adultos da pele abdominal para iPSCs¹⁸.

Os pontos fortes do método proposto são, de fato, a facilidade de desempenho e o curto espaço de tempo necessário para obter iPSCs. Além disso, o método evita mecanismos de defesa celular e o uso de vetores virais, responsáveis por questões relevantes.

Com relação ao protocolo padrão, foram feitas as seguintes modificações: (1) Os fibroblastos de confluentto foram sincronizados na passagem 4 ao colocar em 0,1% de soro por 48 h antes da trippsinização; (2) A densidade celular para a cultura e o volume de reagentes foram ajustados para a utilização em uma placa multi-poço de 24 poços em vez de uma placa de 6 poços; (3) O experimento de reprogramação foi realizado usando uma incubadora de 5% de CO₂ em vez de uma incubadora com condições atmosféricas (21% O₂₎ou hipóxico (5% O_2).

Protocol

Os espécimes do tecido humano foram coletados de acordo com a Declaração de Helsínquia, observando as diretrizes do Hospital Universitário Federico II. Todos os pacientes envolvidos neste estudo forneceram o consentimento escrito. 1. Preparação de Suprimentos e Cultura Mídia Limpe e autoclave um grande par de tesouras cirúrgicas, dois conjuntos de fórceps finos, dois pares de tesouras microdissecting, 1 L garrafa estéril, 500 mL garrafa estéril, e uma garrafa estéril de …

Representative Results

O objetivo do protocolo foi reprogramar fibroblastos dérmicos isolados da pele abdominal, utilizando método de reprogramação não integrador com base em RNAs Para induzir a expressão de fatores específicos. Para atingir esse objetivo, os fibroblastos dérmicos humanos foram isolados de amostras de pele de pacientes submetidos a cirurgia de abdominoplastia e iPSCs foram gerados introduzindo outubro4, Sox2, Klf4, cMyc, Nanog, Fatores de reprogramação Lin28 e e3, K3, B18 fatores de evasão imunológica por um kit de…

Discussion

IPSCs estão emergindo rapidamente como o candidato celular mais promissor para aplicações de medicina regenerativa e como uma ferramenta tremendamente útil para modelagem de doenças e testes de drogas^3,8. O protocolo apresentado aqui descreve a geração de iPSCs humanos de uma amostra com o tamanho de uma biópsia de perfuração de pele com um procedimento simples e eficiente que não requer nenhum equipamento específico ou experiência prévia com tecnol…

Materials

10 mL serological pipet	Falcon	357551	Sterile, polystyrene
100 mm plates	Falcon	351029	Treated, sterile cell culture dish
15 mL sterile tubes	Falcon	352097	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
24-well plates	Falcon	353935	Clear, flat bottom, treated multiwell cell culture plate, with lid, sterile
25 mL serological pipet	Falcon	357525	Sterile, polystyrene
35 mm plates	Falcon	353001	Treated, sterile cell culture dish
5 mL serological pipet	Falcon	357543	Sterile, polystyrene
50 mL sterile tubes	Falcon	352098	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
Advanced DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Gibco	12491-015	Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Sigma- Aldrich	D6429-500ml	Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Fetal Bovine Serum	Sigma- Aldrich	F9665-500ml	Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma- Aldrich	H1387-1L	Powder
L-glutamine	Lonza	BE17-605E	Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	INVITROGEN	13778-030	Synthetic siRNA Transfection Reagent; store at 2-8 °C
Matrigel	CORNING	354234	Basement Membrane Matrix, store at -20 °C. Avoid multiple freeze-thaws.
Neubauer Chamber	VWR	631-1116	Hemocytometer
NutriStem XF Culture Medium	Biological Industries	05-100-1A-500ml	Xeno-free, serum-free, low growth factor human ESC/iPSC culture medium. Store at -20 °C. Upon thawing, the medium may be stored at 2-8 °C for 14 days. Media should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles.
Opti-MEM	Gibco	31985-062-100ml	Reduced-Serum Medium; store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Penicillin and Streptomycin	Sigma- Aldrich	P4333-100ml	Store at -20 °C. The solution should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles
Potassium Chloride	Sigma- Aldrich	P9333	Powder
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma- Aldrich	P5665	Powder
RNase-free 0.5 mL tubes	Eppendorf	H0030124537	RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene
RNase-free 1.5 mL tubes	Eppendorf	H0030120086	RNase-free sterile, microfuge tubes, polypropylene
RNaseZAP	INVITROGEN	AM9780	Cleaning agent for removing RNase
Sodium Bicarbonate	Sigma- Aldrich	S5761	Powder
Sodium Chloride	Sigma- Aldrich	S7653	Powder
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma- Aldrich	94046	Powder
StemRNA 3rd Gen Reprogramming Kit	Reprocell	00-0076	Third Generation NM-RNAs-based Reprogramming Kit for Cellular Reprogramming of Fibroblasts, Blood, and Urine. Store at or below -70 °C.
Trypsin-EDTA	Sigma- Aldrich	T4049-100ml	Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes to avoid repeated freeze/thaw cycles