Summary
이 프로토콜은 비인간 영장류 췌도에서 산소 소비의 정확하고 재현 가능한 측정을 보여줍니다. 마이크로플레이트의 아일렛 로딩 기술과 코팅은 다른 유형의 배양된 스페로이드에서 호흡을 효율적으로 측정할 수 있는 프레임워크를 제공합니다.
Abstract
전 생체 췌도와 같은 세포의 스페로이드 클러스터에서 산소 소비의 측정은 역사적으로 도전적이었습니다. 우리는 스페로이드의 산소 소비를 측정하기 위해 설계된 96 웰 마이크로 플레이트를 사용하여 아일렛 산소 소비의 측정을 보여줍니다. 이 분석에서, 스페로이드 마이크로 플레이트는 분석 전날 세포 및 조직 접착제로 코팅된다. 우리는 소량의 접착제 용액을 사용하여 우물의 바닥만에 대한 밑면 준수를 장려합니다. 분석 당일, 15개의 작은 섬은 최적의 섬 위치와 산소 소비의 정확한 측정을 보장하는 기술을 사용하여 각 우물의 기지에 직접 로드됩니다. 미토콘드리아 호흡의 다양한 측면은 ATP 의존호흡, 최대 호흡 및 양성자 누출을 포함한 비인간 영장류 아일에서 약리학적으로 조사됩니다. 이 방법을 사용하면 웰당 소수의 섬만 사용하여 일관되고 재현 가능한 결과를 볼 수 있습니다. 이론적으로 비슷한 크기의 배양 된 스페로이드에 적용 될 수 있습니다.
Introduction
정상적인 혈당 수준을 유지하기 위해 췌장 β 세포는 포도당의 고도를 감지하고 그에 따라 인슐린을 분비해야합니다. 포도 당 수준과 인슐린 분 비의 결합은 직접 포도 당 물질 대사와 미토 콘 드리 아 산화 인 산화를 통해 ATP의 생산에 연결. 따라서, 미토콘드리아는 자극 분비 커플링1에서중요한 역할을 한다. β 세포 미토콘드리아 기능을 평가하는 것은 손상한 인슐린 분비로 이끌어 내는 결점을 드러낼 수 있습니다. 췌장 α 세포에 의한 글루카곤의 분비는 또한 미토콘드리아 기능2와밀접하게 연관되어 있다. 불멸의 섬 세포주가 일부 유형의 분석에 유용하다는 것이 입증되었지만, 이들 세포의 생리학은 글루카곤3,4에 의한 인슐린 분비의 전위및 인슐린/소마토스타틴5,6에 의한 글루카곤 분비의 억제에 의해 예시된 바와 같이 전체 섬 기능을 정확하게 회귀하지 는 않는다. 이것은 전체, 그대로 섬을 사용하여 산소 소비를 측정할 필요성을 보여줍니다.
아일렛 세포 호흡측정기 의 측정 기술은 산소에 민감한 형광 염료7의 사용에서 산소 소비를 직접 측정하는 고체 센서에 이르기까지 시간이 지남에 따라 진화해 왔으며8. 처음에 단층, 부착 세포를 위해 설계, 일반적으로 사용되는 세포 배양 플레이트 시스템은 췌장 섬에 효과가 입증되었습니다. 작은 섬이 자연적으로 우물에 부착되지 않기 때문에, 그들은 잘 산소 소비의 부정확한 측정의 결과로 배양의 주변에 밀려되는 경향이있다 9. 이 문제에 대처하기 위해, 섬을 포함 할 수있는 중앙 우울증과 전문 24 웰플레이트는 9개발되었다 . 그러나, 24웰 플레이트 시스템은 필요한 많은 수의 섬들(웰당 50-80)과 동시에10개까지시험될 수 있는 조건의 수에 의해 제한되었다. 최근 스페로이드의 세포외 플럭스 분석을 위해 특별히 설계된 96웰 마이크로플레이트의 개발은 이러한 장벽을 극복하여 웰10당20개 이하의 섬으로 섬 호흡을 측정할 수 있게 되었습니다.
여기서, 우리는 일본 원숭이(마카카 fuscata),인간과유사한 섬 생물학을 가진 동물 모델에서 작은 섬에서 산소 소비를 측정하기 위해이 시스템의 사용을 보여줍니다11,12. 이 프로토콜에서는 15개의 마카크 섬을 웰당 분석합니다. 우리의 손에, 잘 생산 당 15 작은 섬 적은 섬 보다 더 높은 기준선 산소 소비, 강력한 활성화 및 약리학 조작에 대 한 응답에 호흡의 억압. 우리는 분석, 각 우물의 중심에 작은 섬을 일관되게 로딩하기위한 효과적인 방법, 이 분석법을 수행 할 때 일반적인 도전을 준비하는 단계를 강조한다.
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Protocol
1. 분석기 실행 전날 마이크로 플레이트 및 센서 카트리지 준비
섬은 앞서 설명한 대로 3 살 짜리 일본 원숭이에서 격리 되었다13. 이 방법은 시체 기증자로부터 인간의 섬을 분리하는 데 사용되는 것과 매우 유사하지만, 동물이 진정 상태에서 장기 제거 전에 췌장이 종종 콜라게나아제 용액으로 팽창되는 마우스와 다릅니다. 아일렛 검색은 오리건 국립 영장류 연구 센터 (ONPRC)와 오리건 보건 과학 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 지침에 따라 수행되었으며 ONPRC IACUC의 승인을 받았습니다. ONPRC는 미국 농무부(USDA)가 시행하는 동물 복지법 및 규정과 국립보건원이 발표한 실험실 동물 관리 및 사용에 관한 인도적 관리 및 사용에 관한 공중 보건 서비스 정책을 준수합니다.
- 스페로이드 마이크로 플레이트의 준비
- 중탄산나트륨0.1M 용액 3 mL를 준비합니다. 필터는 용액을 살균합니다. 우리는 0.45 μm 필터(재료 표)를이용했습니다.
- 세포 배양 후드에서, 0.1M 중탄산나트륨의 2.8 mL에 세포 및 조직 접착제(재료 표)의200 μL을 추가합니다. 이어서, 이 용액의 20 μL을 96웰 스페로이드마이크로플레이트(재료표)의각 웰의 바닥에 추가한다. 파이펫 팁에서 기포를 제거하고 플레이트 바닥만 덮여 있는지 확인합니다. 마이크로 플레이트의 코팅은 분석 기간 동안 약물이 추가되고 우물에 혼합 될 때 작은 섬이 우물의 측면위로 이동하는 것을 방지합니다.
참고: 분석이 실행될 때 섬에 사용되는 만큼많은 우물을 코팅하는 것이 필요합니다. 몇 개의 웰만 사용하면 셀 접착제 용액을 적절하게 축소할 수 있습니다. 분석법에 사용되는 세포 접착제는 해양 홍합에서 추출한 제형 단백질 용액이다. 또는 마이크로 플레이트 웰을 100 μg/mL 폴리-D-리신 의 20 μL로 코팅 할 수 있습니다. - 플레이트를 37°C,비CO2 인큐베이터에서 1시간 동안 배양한다.
- 멸균 환경에서, 플레이트로부터 세포 접착제 용액을 흡인한다. 다중 채널 파이프를 사용하여 37 °C 멸균 수의 400 μL로 각 우물을 두 번 씻으소서. 공기건조시에 두십시오.
- 30-40분 후에 접시를 덮고 4°C에서 밤새 보관합니다.
- 센서 카트리지의 수분 공급
- 멸균 환경에서 센서 카트리지패키지(재료 표)를열고 내용물을 제거합니다. 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트 옆에 거꾸로 놓습니다.
- 유틸리티 플레이트의 각 우물을 200 μL 멸균수로 채우고 센서 카트리지를 유틸리티 플레이트에 다시 넣습니다. 조립된 센서 카트리지와 유틸리티 플레이트를 37°C,비CO2 인큐베이터에 하룻밤 동안 놓습니다.
- 교정의 준비
- 50 mL 원엽 튜브에 교정(재료표)의25 mL. 튜브를 37°C,비CO2 인큐베이터에 하룻밤 동안 놓습니다.
2. 분석의 날에 미디어 준비, 섬 의적 로드 및 센서 카트리지 로딩을위한 프로토콜
- 미디어 준비
- 48.5 mL의 베이스 매질(최소 DMEM, 재료 표참조)에 피루바트 나트륨 1mM 과 글루타민 2mM각각500 μL을 추가합니다. 또한, 추가 496 200 mg/ml 포도 당의 μL (미디어에 포도 당의 최종 농도는 5.5 mM).
참고: 기준선 포도당 농도는 이러한 실험에 대해 일정하게 유지되었다. 그러나, 포도당은 또한 타격10에기재된 약리학적 조작 이외에 호흡을 자극하는데 사용될 수 있다. - pH가 7.4 +/- 0.1인지 확인하고 필요한 경우 조정합니다.
- 48.5 mL의 베이스 매질(최소 DMEM, 재료 표참조)에 피루바트 나트륨 1mM 과 글루타민 2mM각각500 μL을 추가합니다. 또한, 추가 496 200 mg/ml 포도 당의 μL (미디어에 포도 당의 최종 농도는 5.5 mM).
- 센서 카트리지 준비
- 인큐베이터에서 센서 카트리지를 꺼내 센서 카트리지 뚜껑을 제거하고 우물에서 물을 버리십시오. 200 mL의 미리 온온 교정을 각 우물에 넣고 센서 카트리지 뚜껑을 교체하십시오.
- 센서 카트리지를 인큐베이터에 약 1시간(필요할 때까지) 다시 놓습니다.
- 미토콘드리아 스트레스 분석법 약물 준비
- 응력 테스트키트(재료 표)를열고 내용물제거합니다. 올리고마이신, 카보닐 시안화물-4-(트리플루오로메톡시)페닐히드라존(FCCP) 및 로테네/안티마이신 A(AA)에 대한 재고 및 작업 솔루션을 다음과 같이 구성합니다.
- 올리고마이신: 630 μL의 조립된 매체를 튜브에 추가하여 100 μM 스톡을 만듭니다. 이어서, 포트 농도를 얻기 위해 매체로 45 μM으로 희석 (주입 후 최종 웰 농도는 4.5 μM이 될 것이다)
- FCCP: 튜브에 720 μL의 조립 된 매체를 추가하여 100 μM 스톡을 만듭니다. 포트 농도를 얻기 위해 매체로 10 μM으로 희석 (최종 웰 농도는 1 μM이 될 것입니다)
참고: BSA 및 / 또는 FBS는 미디어에 추가해서는 안됩니다. - 로테네/AA: 조립된 용지 540 μL을 튜브에 추가하여 50 μM 스톡을 만듭니다. 포트 농도를 얻기 위해 매체로 25 μM으로 희석 (최종 유 농도는 2.5 μM이 될 것입니다)
참고: 위의 농도는 우리의 손에 일관된 결과를 생산하고있다. 추가 FCCP는 호흡에 있는 더 이상 증가로 이끌어 냈습니다. 그러나, 약 농도는 작은 섬 크기에 따라 조정 될 필요가 있을 수 있습니다., 특히 다른 종 또는 비 섬 spheroids에서 섬. 참고로, 비인간 영장류 본도의 평균 직경은 약 150 μm15이다.
- 응력 테스트키트(재료 표)를열고 내용물제거합니다. 올리고마이신, 카보닐 시안화물-4-(트리플루오로메톡시)페닐히드라존(FCCP) 및 로테네/안티마이신 A(AA)에 대한 재고 및 작업 솔루션을 다음과 같이 구성합니다.
- 스페로이드 판의 준비 및 섬의 전송
- 60 mm x 15mm 세포 배양 접시에 췌도를 수작업으로 골라 조립 된 매체를 함유하여 100 % 순도에 가깝습니다.
참고: 섬은 명확하게 정의 된 주변과 둥근 표시해야하며, 외분비 조직 오염 물질보다 조밀하게 나타납니다. 손상되거나 마모된 것처럼 보이는 섬을 피하십시오. 이 실험에서, 섬 크기는 직접 측정되지 않았습니다, 우리는 각 우물과 샘플에 대해 대략 동등한 크기의 섬을 선택하려고 시도했지만. - 멀티채널 파이펫을 사용하여 175 μL의 조립된 용지로 스페로이드 마이크로플레이트의 각 웰을 적재합니다.
- P20 파이펫세트를 15 μL로 설정하여, 세포 배양 접시로부터 15개의 아일렛을 흡인한다. 작은 섬은 육안으로 파이펫 팁에 볼 수 있어야합니다.
- 섬을 스페로이드 마이크로 플레이트로 옮기려면, 하부 파이펫 팁을 우물 바닥으로 옮기고, 간신히 들어 올리고, 천천히 매우 작은 부피(~5 μL)를 피펫으로 내보푸세요. 모든 섬이 파이펫 팁을 남겼는지 확인합니다. 각 우물은 15 개의 섬을 받아야합니다. 때때로 현미경의 밑에 spheroid 마이크로 플레이트를 검사하여 섬이 측면에 달라붙지 않고 각 우물의 바닥에 있는지 확인합니다.
참고: 섬으로 코너 우물을로드하지 마십시오. 플라스틱에서 산소와 pH 플럭스는 분석 중에 발생할 수 있으며, 이것은 네 개의 코너 웰에서 악화된다. - 모든 섬이 스페로이드 마이크로플레이트로 옮겨지면, 아래 단계를 완료하면서 37°C,비CO2 인큐베이터에서 마이크로플레이트를 배양한다.
- 60 mm x 15mm 세포 배양 접시에 췌도를 수작업으로 골라 조립 된 매체를 함유하여 100 % 순도에 가깝습니다.
- 센서 카트리지 로드 및 분석 기 실행
- 인큐베이터에서 센서 카트리지를 분리합니다. 각 웰에 대한 포트 A-C는 약물 또는 미디어로 로드되어야 합니다. 섬과 네 개의 코너 웰을 포함하는 우물은 약물로로드해야합니다. 섬이없는 비 코너 우물은 미디어로로드해야합니다. 포트 D는 비워 두면 됩니다. 올리고마이신 또는 매폐의 20 μL로 로드 포트 A(각 센서의 왼쪽 상단). FCCP 또는 용지의 22 μL로 로드 포트 B(오른쪽 상단). 로테네/AA 또는 용지의 25 μL이 있는 로드 포트 C(왼쪽 아래).
- 30분 간의 기준선 호흡 주기(5사이클 3분 혼합, 3분 측정), 42분 올리고마이신 측정 주기(3분 혼합 7주기, 3분 측정), 30분 FCCP(3분 혼합 5주기, 3분 측정), 30분 로테노네/AA(3분 혼합 5회, 3분)에 대한 세포외 플럭스 분석기 분석기를 프로그래밍합니다.
- 분석기를 실행하고 센서를 교정하고 마이크로 플레이트를 삽입하기 위한 화면의 지침을 따릅니다.
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Representative Results
작은 섬을 마이크로 플레이트에 로드하려면 그림 1A와같이 15 μL의 용지로 15 개의 섬을 흡인해야합니다. 섬은 자연스럽게 몇 초 이내에 파이펫 팁의 바닥으로 정착합니다. 그런 다음, 파이펫 팁은 웰의 바닥으로 내린다. 팁은 매우 약간 들어 올려지고 작은 부피 (약 5 μL)가 섬과 함께 파이펫아웃됩니다. 이 기술은 정확한 산소 소비 측정을 위해 마이크로 플레이트 의 바닥에 잘(그림 1B)의바닥에 아슬렛의 일관된 배치 결과.
도 2는 분석결과 전반에 걸쳐 산소 소비에 대한 개별웰에 의한 대표적인 결과를 나타낸다. 이 특정 실험은 우물의 바닥이 아닌 우물의 측면에 붙어 많은 섬과 함께, 제대로로드 할 때 발생할 수있는 것을 보여줍니다. 이 문제는 섬이 이미 팁에서 파이펫팅된 후 우물에 너무 많은 용지를 파이펫팅하여 발생할 수 있습니다. 추가 미디어의 흐름은 우물의 바닥에서 섬을 밀어. 이 경우 산소 소비의 기준 수준이 매우 낮을 것이며, 이 웰은 FCCP에 대한 반응이 거의 또는 전혀 나타나지 않을 것입니다. 그림 2의 굵은 선은 이러한 현상을 보여줍니다.
도 3은 대부분의 웰이 약물에 대한 중요한 기준선 호흡 및 반응을 나타내었던 다른 실험을 나타낸다. 그러나 두 개의 우물 (굵은 선)은 로테네 / AA에 대한 반응을 보이지 않았습니다. 이것은 약이 우물로 제대로 풀어 놓이지 않았다는 것을 건의합니다. 이 경우, 기저 산소 소비가없는 경우와 마찬가지로,이 우물은 추가 분석에서 제외 될 수 있습니다.
도 4는 성공적인 분석의 결과를 나타낸다. 여기에서 우리는 우물이 제대로 섬으로 로드되고 제대로 약물로 주입된 별도의 실험에서 요약 데이터의 예를 보여줍니다. ATP 의존미토콘드리아 산소 소비는 올리고마이신에 의해 효과적으로 억제되었고, 최대 호흡-기저 수준 이상의 최대 호흡-FCCP에 의해 유도되었고, 미토콘드리아 호흡은 로테논/AA를 가진 전자 수송 사슬의 억제에 의해 올리고마이신 수준 아래를 완전히 폐쇄시켰다.
그림 1: 작은 섬을 마이크로 플레이트에 적재하는 파이펫팅 기술. (A)약 15 개의 섬 (빨간 화살표) 15 μL의 용지로 파이펫처리. (B)스페로이드 마이크로 플레이트의 하단을 중심으로 한 섬. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 아일렛 하중의 차이로 인한 웰-투-웰 가변성. 부적절하게 로드된 우물(굵은 파란색 선)은 기저 산소 소비량이 거의 또는 전혀 없으며 세포 스트레스 테스트 약물에 대한 최소한의 반응을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 약물 주사 실패. 두 개의 우물 (굵은 파란색 선) 로테네 / AA로 주입되지 않았고 산소 소비의 현저한 감소를 보여주지 않았다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 제대로 로드되지 않거나 주입된 웰을 제외한 실험에서 모든 웰의 평균 데이터. 16개의 기술적 복제를 포함하는 별도의 실험에서 세포 스트레스 시험 분석전반에 걸쳐 평균 산소 소비. 오류 막대는 n = 16웰에 대한 표준 편차를 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
섬 산소 소비의 연구는 이전에 작은 섬의 구형 모양에 의해 방해되었습니다, 배양 표면에 대한 준수의 부족, 그리고 잘 당 필요한 섬의 수. 이 프로토콜에서는 소수의 섬에 대한 섬 산소 소비를 측정하기 위한 96웰 스페로이드 마이크로플레이트의 효능을 강조하고 기술적으로 실현 가능하고 일관된 섬을 취급하고 적재하는 기술을 시연합니다. 결과.
작은 섬이 마이크로 플레이트의 바닥에 부착하고 분석을 통해 혼합 단계 동안 흔들리지 않도록하기 위해, 96 웰 마이크로 플레이트는 분석 전날 세포 접착제 용액으로 코팅된다. 이것은 일반적으로 유익하지만, 섬이 제대로로드되지 않은 경우 그들은 따라서 영향을 미치거나 정확한 측정을 배제, 오히려 바닥보다는 우물의 측면에 충실 할 책임이있다. 이에 대처하기 위해, 우리는 접착제 용액 전용 20 μL의 매우 작은 볼륨으로 우물을 코팅하는 것이 좋습니다. 또한, 우리가 보여주는 파이펫팅 기술은 섬이 우물의 바닥에 로드되고 추가 매체의 흐름에 의해 측면을 밀어 올리지 않도록합니다. .
96웰 스페로이드 마이크로플레이트는 필요한 많은 수의 섬과 동시에 테스트할 수 있는 조건수를 포함하여 측정 아일렛 산소 소비의 이전 한계를 극복했습니다. 실제로, 최근 연구10 잘 당 단일 인간의 작은 도움으로이 시스템의 사용을 입증. 그러나 단일 섬을 사용한 산소 소비량의 측정은 산소 소비의 매우 낮은 기저 측정을 초래했으며, 이는 가장 큰 섬 (직경 290 μm 이상)에서만 배경보다 훨씬 높았습니다. NHP 섬은 인간의 섬보다 작은 경향이, 단지 의 평균 직경 150 μm15. 우리의 손에, 15 잘 당 NHP 섬 더 높은 기준선 과 적은 섬 보다 세포 스트레스 테스트 동안 더 응답 프로필 을 보였다. 우리는 또한 우물 당 5개와 10개의 섬을 시험했지만, 기저 산소 소비와 소음에 대한 신호가 현저히 감소한다는 것을 발견했습니다.
웰 당 작은 수의 섬을 사용하는 기능 외에도 96 웰 마이크로 플레이트는 한 번에 여러 가지 조건을 테스트 할 수 있습니다. 이것은 작은 섬이 다른 화합물로 취급되거나 유전으로 조작되는 경우에 유익합니다. 그러나, 다른 근원에서 온 인간 또는 비 인간 영장류 작은 것의 단을 비교할 때 (예를 들면, 당뇨병 대 비 당뇨병 섬), 견본은 수시로 다른 일에 수신됩니다. 따라서, 이러한 경우는이 시스템을 최대한 활용할 수 없습니다.
미토콘드리아 산소 소비의 다양한 측면을 정량화하기 위해, 우리는 약리학적으로 호흡의 다른 측면을 조작. 사용된 약물 농도는 인간 아일즈10에서의투대 연구에 기초했다. FCCP의 복용량은 우리의 손에 최대 미토콘드리아 호흡을 유도하기 위해 최적화되었다. 구체적으로, 올리고마이신의 농도는 4.5 μM, FCCP는 1 μM, 로테닌/AA는 2.5 μM이었다. 그러나 이러한 농도는 이 프로토콜의 다른 응용 분야에 대해 보정되어야 합니다.
생성된 데이터는 여러 가지 방법을 사용하여 직접 분석하거나 정규화할 수 있습니다. 이 실험에서는 각 샘플에 대해 동일한 수의 유사한 크기의 섬을 사용했으며, 데이터는 세포 수 또는 섬 크기로 정규화되지 않았으며, 이는 직접 정량화하기 어려울 수 있습니다. 정규화의 대안적인 방법은 분석이 수행되고 단백질 수준을 정량화한 후에 세포를 포하하는 관련시키는 총 세포 단백질에 의하여 입니다. 데이터는 또한 기초 호흡 수준으로 정규화될 수 있습니다. 이것은 기초 수준의 백분율로 예비 용량의 정량화와 같은 특정 경우에 유익할 수 있습니다. 그러나 이러한 정규화 방법 등을 사용하면 앞서 설명한16과같이 정규화 중에 정보가 손실될 수 있습니다.
여기에 설명된 시스템은 작은 꽃의 생리학을 더 잘 이해할 수 있는 독특한 도구를 제공합니다. 실제로, 아일렛 건강에서 산소 소비의 중요성은 아일렛 산소 소비율이 아일렛 건강과 밀접하게 연관되어 있고 성공적인 아일렛 이식의확률(17)에의해 설명된다. 이 시스템은 이론적으로 비슷한 크기의 배양 된 스페로이드에도 적용 될 수있는 섬 산소 소비의 일관된 정량화를위한 훌륭한 플랫폼을 제공합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
저자는 그들의 시설의 사용에 대한 밴더빌트 높은 처리량 스크리닝 코어를 인정하고 싶습니다, 애질런트 생명 공학, 박사 폴 Kievit (오리건 건강 과학 대학) 비 인간 영장류 고립에 대한, 에릭 Donahue (밴더빌트 대학) 그림 에 대한 도움 1. J.M.E.는 수상 번호 T32GM007347에서 건강의 국가 학회의 NIGMS에 의해 지원되었습니다. M.G.는 NIH/NIDDK(R24DK090964-06)와 재향군인회(BX003744)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture dish, 60 mm X 15 mm style | Corning | 430166 | |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | Corning | 354240 | |
| Conical tube, 50 mL | Falcon | 352070 | |
| Dextrose anhydrous | Fisher Scientific | BP350-1 | For glucose solution, 200 mg/ml, sterile filetered |
| Disposable reservoirs (sterile), 25 ML | Vistalab | 3054-1033 | for loading multichannel pipet |
| EZFlow Sterile 0.45 μm PES Syringe Filter, 13 mm | Foxx Life Sciences | 371-3115-OEM | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | 200 mM (100x) |
| Multichannel pipette tips | ThermoFisher Scientific | 94410810 | |
| Multichannel pipette, 15-1250 μL | ThermoFisher Scientific | 4672100BT | Recommended |
| P20, P200, and P1000 pipettes | Eppendorf | 2231000602 | |
| pH Probe | Hanna Instruments | HI2210-01 | |
| Pipette tips, 20 μL, 200 μL, 1000 μL | Olympus | 24-404, 24-412, 24-430 | |
| Seahorse XF Base Media | Agilent | 103334-100 | |
| Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | Includes Oligomycin, FCCP, and Rotenone/Antimycin A |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | S7800B | Including prep station with 37 °C non-CO2 incubator |
| Seahorse XFe96 Spheroid Fluxpak Mini | Agilent | 102905-100 | Includes sensor cartridge, spheroid microplate, and calibrant |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | 100 mM (100x) |
| Stereo Microscope | Olympus | SZX9 | |
| Syringe (sterile), 5 mL | BD | 309603 | For sterile filtration |
| Water (sterile) | Sigma | W3500-500mL |
References
- Mulder, H. Transcribing β-cell mitochondria in health and disease. Molecular Metabolism. 6 (9), 1040-1051 (2017).
- Maechler, P., Wollheim, C. B. Mitochondrial signals in glucose-stimulated insulin secretion in the beta cell. The Journal of Physiology. 529 (Pt 1), 49-56 (2000).
- Curry, D. L. Glucagon Potentiation of Insulin Secretion by the Perfused Rat Pancreas. Diabetes. 19 (6), 420 (1970).
- Song, G., Pacini, G., Ahrén, B., D'Argenio, D. Z. Glucagon Increases Insulin Levels by Stimulating Insulin Secretion Without Effect on Insulin Clearance in Mice. Peptides. 88, 74-79 (2017).
- Vergari, E., et al. Insulin inhibits glucagon release by SGLT2-induced stimulation of somatostatin secretion. Nature Communications. 10 (1), 139 (2019).
- Watts, M., Ha, J., Kimchi, O., Sherman, A. Paracrine regulation of glucagon secretion: the β/α/δ model. American Journal of Physiology--Endocrinology and Metabolism. 310 (8), E597-E611 (2016).
- Sweet, I. R., et al. Continuous measurement of oxygen consumption by pancreatic islets. Diabetes Technology & Therapeutics. 4 (5), 661-672 (2002).
- Agilent Seahorse XF Instruments Overview and Selection Guide. , Agilent Technologies. https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/seahorse-xf-instruments-selection-guide (2019).
- Wikstrom, J. D., et al. A novel high-throughput assay for islet respiration reveals uncoupling of rodent and human islets. PLoS One. 7 (5), e33023 (2012).
- Taddeo, E. P., et al. Individual islet respirometry reveals functional diversity within the islet population of mice and human donors. Molecular Metabolism. 16, 150-159 (2018).
- Conrad, E., et al. The MAFB transcription factor impacts islet alpha-cell function in rodents and represents a unique signature of primate islet beta-cells. American Journal of Physiology--Endocrinology and Metabolism. 310 (1), E91-E102 (2016).
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
- Elsakr, J. M., et al. Maternal Western-style diet affects offspring islet composition and function in a non-human primate model of maternal over-nutrition. Molecular Metabolism. , (2019).
- Soutar, M. P. M., et al. FBS/BSA media concentration determines CCCP's ability to depolarize mitochondria and activate PINK1-PRKN mitophagy. Autophagy. , 1-10 (2019).
- Hirshberg, B., et al. Pancreatic Islet Transplantation Using the Nonhuman Primate (Rhesus) Model Predicts That the Portal Vein Is Superior to the Celiac Artery as the Islet Infusion Site. Diabetes. 51 (7), 2135-2140 (2002).
- Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).
- Papas, K. K., et al. Islet Oxygen Consumption Rate (OCR) Dose Predicts Insulin Independence in Clinical Islet Autotransplantation. PLoS One. 10 (8), e0134428 (2015).
