Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay voor site-specifieke DNA Decolleté
Summary
Een zeer parallelle methode voor het meten van het site-specifieke decolleté van DNA op het niveau van één molecuul wordt beschreven. Dit protocol toont de techniek met behulp van de beperking endonuclease NdeI. De methode kan eenvoudig worden aangepast om elk proces dat resulteert in site-specifieke DNA-decolleté te bestuderen.
Abstract
Site-specifieke DNA decolleté (SSDC) is een belangrijke stap in veel cellulaire processen, en het is cruciaal voor genbewerking. Dit werk beschrijft een kinetische test die SSDC in veel afzonderlijke DNA-moleculen tegelijk kan meten. Kraal-gebonden substraat JA’s, elk met een enkele kopie van de doelsequentie, worden bereid in een microfluïdisch stroomkanaal. Een externe magneet past een zwakke kracht toe op de paramagnetische kralen. De integriteit van maximaal 1.000 individuele AV’s kan worden gecontroleerd door de microbeads onder darkfield imaging te visualiseren met behulp van een breedveld, lage vergrotingsdoelstelling. Het injecteren van een beperking endonuclease, NdeI, initieert de decolletéreactie. Videomicroscopie wordt gebruikt om het exacte moment van elk DNA-decolleté vast te leggen door het frame te observeren waarin de bijbehorende kraal omhoog en uit het brandpuntsvlak van het doel beweegt. Frame-voor-frame kraal tellen kwantificeert de reactie, en een exponentiële pasvorm bepaalt de reactiesnelheid. Deze methode maakt het verzamelen van kwantitatieve en statistisch significante gegevens over single molecule SSDC reacties in een enkel experiment.
Introduction
Site-specifieke DNA decolleté (SSDC) is een belangrijke stap in veel genomische transacties. Bijvoorbeeld, bacteriële beperking-modificatie (RM)1 en CRISPR2 systemen cellen te beschermen tegen aanvallen door fagen en plasmiden door het herkennen en klijmen van vreemd DNA op specifieke sequenties. In type II RM herkennen restrictie-endonucleases (REs) korte 4-8 basispaarsequenties (bp) via eiwit-nucleïnezuurinteracties3. CRISPR-geassocieerde endonucleases, zoals Cas9, binden zich aan sites via hybridisatie van de doelsite met crRNAs gebonden aan de endonucleases4. De creatie van site-specifieke double stranded breaks (DSB’s) zijn ook de eerste stap in veel DNA-recombinatiegebeurtenissen5. De diversiteit van antigeenbindingsgebieden die door de recombinatie V(D)J worden gecreëerd, vereist bijvoorbeeld de erkenning en decolleté van specifieke doellocaties6. Sommige transposons zijn bekend om specifieke DNA-sequenties richten,evenals 7. Niet verrassend, veel site-specifieke nucleases die betrokken zijn bij deze processen, zoals Cas9, zijn een belangrijk onderdeel van genbewerkingstechnologieën8. Daarnaast zijn ook nieuwe site-specifieke endonucleases (d.w.z. zinkvinger nucleases9 en TALENS10)ontworpen om genomen te bewerken.
Veel methoden zijn gebruikt om de kinetiek van site-specifieke decolleté van nucleïnezuren te meten. Deze omvatten gelanalyse, fluorescentie11,12, en sequencing gebaseerde methoden13. Een belangrijke vooruitgang werd bereikt met de tethering van microbeads, waardoor DSB’s in enkele moleculen van DNA kunnen worden gedetecteerd door de beweging van een kraal na de scheiding van de streng. Bij deze methoden worden verschillende soorten krachten gebruikt om strengscheiding en beweging van het kraal na decolleté te garanderen. In één geval zijn optische vallen gebruikt om het decolleté van DNA te meten door EcoRV14. In deze experimenten, doel zoeken is het doel van het onderzoek, met voorwaarden geoptimaliseerd, zodat site-specifieke binding is de tarief beperkende stap. Een nadeel van optische vallen is dat slechts een enkel DNA kan worden waargenomen op een moment. Daarnaast moet een periodieke grote trekkracht worden toegepast om te testen op de strengscheiding.
Een andere techniek maakt gebruik van een combinatie van stroom en zwakke magnetische krachten te trekken op de kraal op een continue manier15. Op deze manier wordt diffusie beperkt decolleté door NdeI gemeten. De gebruikte methode maakt het mogelijk om meerdere honderden NA’s tegelijk te meten, waardoor statistische significantie in één experiment kan worden bereikt. Er zijn ook experimenten gebruikt op basis van magnetische pincetten. In een dergelijke studie werd een retrovirale integrase bestudeerd door een DSB op te nemen in de invoeging oligonucleotide16. Succesvolle integratie resulteerde in de integratie van DSB in het vastgebonden DNA en het verlies van de bijgevoegde kraal. In een soortgelijke studie naar de ATP-afhankelijke type III-beperking endonuclease EcoPI werden tientallen DNO’s waargenomen in één experiment17. Magnetische pincet houden het voordeel dat spanning, evenals DNA-lus, kan worden gecontroleerd en gecontroleerd tijdens de reactie.
Hier gepresenteerd is een zeer parallelle single molecule methode voor het meten van SSDC kinetiek, die profiteert van recente verbeteringen in grootschalige tethering van DNAs. Deze methode is een verbetering en uitbreiding van eerdere methoden die worden gebruikt om DNA-replicatie18, contourlengte van DNA19en decolleté door REs15te meten . In deze techniek worden lineaire TINA’s met één kopie van de herkenningssequentie bereid met biotine aan de ene kant en aan de andere kant. De biotine bindt streptavidin, die covalent is bevestigd aan een paramagnetische microbead. De DNA-kraalcomplexen worden geïnjecteerd in een microfluïdisch kanaal dat is gefunctionaliseerd met anti-digoxigenin FAB-fragmenten. Het DNA bindt vervolgens aan de oppervlaktebevestigingspunten via binding van de digoxigenine aan de adsorbeerde FAB-fragmenten. Zwakke magnetische krachten toegepast met een permanente magneet houden de kraal niet-specifiek aan het oppervlak. Monsters kunnen snel (<30 s) in het stroomkanaal worden geïnjecteerd om de decolletéreactie te activeren. Stroom wordt uitgeschakeld tijdens het verzamelen van gegevens. Aangezien elk DNA wordt gedes cleaved, kan de nauwkeurige tijd van decolleté door het kader registreren waarin de parel zich op en uit het brandpuntsplan van het doel beweegt, waardoor van de videoverslag verdwijnt. Een frame-voor-frame telling van de resterende kralen kan worden gebruikt om de reactievoortgang te kwantificeren.
Hieronder vindt u het volledige protocol en voorbeeldgegevens die met NdeI worden verzameld. Als voorbeeld van hoe de techniek kan worden toegepast, worden decolletésnelheden voor een reeks eiwitconcentraties gemeten in twee verschillende concentraties magnesium, een essentiële metaalcofactor. Hoewel deze toepassing van het protocol NdeI gebruikt, kan de methode worden aangepast voor gebruik met elke site-specifieke nuclease door het DNA-substraatontwerp te variëren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het protocol kan worden gebruikt om de kinetiek van een SSDC-systeem te meten, op voorwaarde dat de strengscheiding tijdens het experiment wordt waargenomen. De detectie van decolleté wordt beïnvloed door het observeren van het loskoppelen van de vastgebonden kraal en markeert daarom het moment van strengscheiding. Alle voorgaande stappen vinden plaats vóór de detectie van het decolleté; zo wordt alleen de totale transittijd geregistreerd.
De flow cell coverslip wordt gefunctionaliseerd v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation subsidie MCB-1715317.
Materials
| 5 minute Epoxy | Devcon | 14250 | |
| anti-digoxigenin FAB fragments | Roche Diagnostics | 11214667001 | |
| camera and software | Jenoptik | GRYPHAX SUBRA | |
| data analysis software | Vernier Inc. | LP | |
| double sided tape | Grace Biolabs | SA-S-1L | |
| Dulbeccos Phosphate Buffered Saline | Corning | 21-031-CV | |
| ethanol 95% | VWR | 89370-082 | |
| forward primer: digoxigenin-CCAACTTAATCGCCTTGC | Integrated DNA Technologies | n/a | |
| image analysis software | National Institutes of Health | ImageJ | |
| inverted microscope | Nikon | TE2000 | |
| knife printer | Silhouette | ||
| M13mp18 DNA | New England Biolabs | N4040S | |
| MyOne streptavidin beads | Thermo Fisher Scientific | 65601 | |
| NdeI enzyme | New England Biolabs | R0111S | |
| PCR cleanup kit | Qiagen | 28104 | |
| pluronic F-127 | Anatrace | P305 | |
| polyethylene tubing PE-20 | BD Intramedic | 427406 | |
| polyethylene tubing PE-60 | BD Intramedic | 427416 | |
| Q5 Mastermix | New England Biolabs | M0492S | |
| rare earth magnet 0.5" OD 0.25" ID | National Imports | NSN0814 | |
| rare earth magnet 0.75" OD 0.5" ID | National Imports | NSN0615 | |
| reverse primer: biotin-TGACCATTAGATACATTTCGC | Integrated DNA Technologies | n/a | |
| syringe pump | Kent Scientific | Genie Plus | |
| β-Casein from bovine Milk | Sigma-Aldrich | C6905 |
References
- Tock, M. R., Dryden, D. T. The biology of restriction and anti-restriction. Current Opinion in Microbiology. 8 (4), 466-472 (2005).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., Wende, W. Type II restriction endonucleases: structure and mechanism. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (6), 685-707 (2005).
- Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).
- Sadowski, P. D. Site-specific genetic recombination: hops, flips, and flops. The FASEB Journal. 7 (9), 760-767 (1993).
- Schatz, D. G. Antigen receptor genes and the evolution of a recombinase. Seminars in Immunology. 16 (4), 245-256 (2004).
- Craig, N. L. Tn7: a target site-specific transposon. Molecular Microbiology. 5 (11), 2569-2573 (1991).
- Gori, J. L., et al. Delivery and Specificity of CRISPR/Cas9 Genome Editing Technologies for Human Gene Therapy. Human Gene Therapy. 26 (7), 443-451 (2015).
- Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).
- Joung, J. K., Sander, J. D. TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).
- Alves, J., Urbanke, C., Fliess, A., Maass, G., Pingoud, A. Fluorescence stopped-flow kinetics of the cleavage of synthetic oligodeoxynucleotides by the EcoRI restriction endonuclease. 생화학. 28 (19), 7879-7888 (1989).
- Deng, J., Jin, Y., Chen, G., Wang, L. Label-free fluorescent assay for real-time monitoring site-specific DNA cleavage by EcoRI endonuclease. Analyst. 137 (7), 1713-1717 (2012).
- Becker, W. R., et al. High-throughput analysis reveals rules for target RNA binding and cleavage by AGO2. Molecular Cell. 75 (4), 741-755 (2019).
- vanden Broek, B., Lomholt, M. A., Kalisch, S. M., Metzler, R., Wuite, G. J. How DNA coiling enhances target localization by proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (41), 15738-15742 (2008).
- Gambino, S., et al. A single molecule assay for measuring site-specific DNA cleavage. Analytical Biochemistry. 495, 3-5 (2016).
- Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nature Communications. 7, 11409 (2016).
- van Aelst, K., et al. Type III restriction enzymes cleave DNA by long-range interaction between sites in both head-to-head and tail-to-tail inverted repeat. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (20), 9123-9128 (2010).
- Williams, K., et al. A single molecule DNA flow stretching microscope for undergraduates. American Journal of Physics. 79 (11), 1112-1120 (2011).
- Song, D., et al. Tethered particle motion with single DNA molecules. American Journal of Physics. 83 (5), 418-426 (2015).
- Etson, C. M., Todorov, P., Walt, D. R. Elucidating Restriction Endonucleases Reaction Mechanisms via Dwell-Time Distribution Analysis. Biophys Journal. 106 (2), 22 (2014).
- Piatt, S., Price, A. C. Analyzing dwell times with the Generalized Method of Moments. PLoS One. 14 (1), 0197726 (2019).
