Paralleler Hochdurchsatz-Single Molecule Kinetic Assay für standortspezifische DNA-Spaltung
Summary
Beschrieben wird eine hochparallele Methode zur Messung der standortspezifischen DNA-Spaltung auf einzelmolekülebene. Dieses Protokoll demonstriert die Technik mithilfe der Einschränkung endonuklease NdeI. Die Methode kann leicht modifiziert werden, um jeden Prozess zu untersuchen, der zu einer standortspezifischen DNA-Spaltung führt.
Abstract
Standortspezifische DNA-Spaltung (SSDC) ist ein wichtiger Schritt in vielen zellulären Prozessen, und es ist entscheidend für die Genbearbeitung. Diese Arbeit beschreibt einen kinetischen Assay, der sSDC in vielen einzelnen DNA-Molekülen gleichzeitig messen kann. Bead-tethered Substrat DNAs, die jeweils eine einzige Kopie der Zielsequenz enthalten, werden in einem mikrofluidischen Durchflusskanal hergestellt. Ein äußerer Magnet wendet eine schwache Kraft auf die paramagnetischen Perlen an. Die Integrität von bis zu 1.000 einzelnen DNAs kann überwacht werden, indem die Mikroperlen unter Dunkelfeld-Bildgebung mit einem Breitfeld-Objektiv mit geringer Vergrößerung visualisiert werden. Die Injektion einer Restriktionsendonuklease, NdeI, löst die Spaltungsreaktion aus. Die Videomikroskopie wird verwendet, um das genaue Moment jeder DNA-Spaltung aufzuzeichnen, indem der Rahmen beobachtet wird, in dem sich die zugehörige Perle auf und ab der Brennebene des Objektivs bewegt. Frame-by-Frame-Perlenzählung quantifiziert die Reaktion, und eine exponentielle Anpassung bestimmt die Reaktionsgeschwindigkeit. Diese Methode ermöglicht die Erfassung quantitativer und statistisch signifikanter Daten über Einzelne Molekül-SSDC-Reaktionen in einem einzigen Experiment.
Introduction
Standortspezifische DNA-Spaltung (SSDC) ist ein wichtiger Schritt in vielen genomischen Transaktionen. Beispielsweise schützen bakterielle Restriktionsmodifikationssysteme (RM)1 und CRISPR2 Zellen vor Angriffen durch Phagen und Plasmide, indem sie fremde DNA in bestimmten Sequenzen erkennen und spalten. In Typ II RM erkennen Restriktionsendonukleasen (REs) kurze 4–8 Basenpaarsequenzen (bp) über Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen3. CRISPR-assoziierte Endonukleasen, wie Cas9, binden über die Hybridisierung des Zielstandorts an Standorte mit crRNAs, die an die Endonukleases4gebunden sind. Die Erstellung von ortsspezifischen Doppelsträngigenbrüchen (DSBs) ist auch der erste Schritt bei vielen DNA-Rekombinationsereignissen5. Beispielsweise erfordert die Vielfalt der Durch V(D)J-Rekombination geschaffenen Antigenbindungsbereiche die Erkennung und Spaltung bestimmter Zielstandorte6. Einige Transposons sind dafür bekannt, bestimmte DNA-Sequenzen anzusprechen, sowie7. Es überrascht nicht, dass viele standortspezifische Nukleasen, die an diesen Prozessen beteiligt sind, wie Cas9, eine Schlüsselkomponente von Gen-Editing-Technologiensind 8. Darüber hinaus wurden auch neuartige ortsspezifische Endonukleasen (d. h. Zinkfingernukleasen9 und TALENS10) entwickelt, um Genome zu bearbeiten.
Viele Methoden wurden eingesetzt, um die Kinetik der standortspezifischen Spaltung von Nukleinsäuren zu messen. Dazu gehören Gelanalyse, Fluoreszenz11,12und Sequenzierung basierende Methoden13. Ein großer Fortschritt wurde mit dem Ankleben von Mikroperlen erreicht, wodurch DSBs in einzelnen DNA-Molekülen durch die Bewegung einer Perle nach der Strangtrennung nachgewiesen werden können. Bei diesen Methoden werden verschiedene Arten von Kräften eingesetzt, um die Strangtrennung und Bewegung der Perle nach der Spaltung zu gewährleisten. In einem Fall wurden optische Fallen verwendet, um die Spaltung der DNA durch EcoRV14zu messen. In diesen Experimenten ist die Zielsuche das Ziel der Untersuchung, wobei die Bedingungen so optimiert sind, dass die standortspezifische Bindung der Schritt zur Preisbegrenzung ist. Ein Nachteil optischer Fallen ist, dass jeweils nur eine einzige DNA beobachtet werden kann. Darüber hinaus muss eine periodisch große Zugkraft angewendet werden, um die Strangtrennung zu testen.
Eine andere Technik verwendet eine Kombination aus Strömung und schwachen magnetischen Kräften, um die Perle kontinuierlich zu ziehen15. Auf diese Weise wird die Diffusionsbegrenzte Spaltung durch NdeI gemessen. Die angewandte Methode ermöglicht die gleichzeitige Messung von mehreren hundert DNAs auf einmal, so dass die statistische Signifikanz in einem einzigen Experiment erreicht werden kann. Experimente auf Basis magnetischer Pinzetten wurden ebenfalls verwendet. In einer solchen Studie wurde ein retrovirales Integras untersucht, indem ein DSB in das Insertionsoligonukleotid16eingebunden wurde. Eine erfolgreiche Integration führte zur Einbindung von DSB in die gebundene DNA und zum Verlust der angehängten Perle. In einer ähnlichen Studie der ATP-abhängigen Typ-III-Beschränkung Endonuklease EcoPI wurden Dutzende von DNAs in einem einzigen Experiment beobachtet17. Magnetische Pinzette haben den Vorteil, dass Spannung, sowie DNA-Looping, während der Reaktion gesteuert und überwacht werden können.
Hier wird eine hochparallele Einzelmolekülmethode zur Messung der SSDC-Kinetik vorgestellt, die die jüngsten Verbesserungen bei der großflächigen Tethering von DNAs nutzt. Diese Methode ist eine Verbesserung und Erweiterung der bisherigen Methoden zur Messung der DNA-Replikation18, Konturlänge von DNA19und Spaltung durch REs15. Bei dieser Technik werden lineare DNAs, die eine einzige Kopie der Erkennungssequenz enthalten, mit Biotin an einem Ende und Digoxigenin am anderen Ende hergestellt. Das Biotin bindet Streptavidin, das kovalent an einer paramagnetischen Mikroperle befestigt ist. Die DNA-Perlenkomplexe werden in einen mikrofluidischen Kanal injiziert, der mit Anti-Digoxigenin-FAB-Fragmenten funktionalisiert wurde. Die DNA bindet sich dann über die Bindung des Digoxigenins an die adsorbierten FAB-Fragmente an die Oberflächenbefestigungspunkte. Schwache magnetische Kräfte, die mit einem Permanentmagneten aufgebracht werden, halten die Perle davon ab, nicht spezifisch an der Oberfläche zu kleben. Proben können schnell (<30 s) in den Durchflusskanal injiziert werden, um die Spaltreaktion zu aktivieren. Der Flow wird während der Datenerfassung deaktiviert. Da jede DNA spaltet wird, kann der genaue Zeitpunkt der Spaltung bestimmt werden, indem der Rahmen aufgezeichnet wird, in dem sich die Perle nach oben und aus dem Brennplan des Objektivs bewegt und somit aus dem Videoaufgenommen verschwindet. Eine Frame-by-Frame-Anzahl der verbleibenden Perlen kann verwendet werden, um den Reaktionsfortschritt zu quantifizieren.
Im Folgenden wird das komplette Protokoll sowie Beispieldaten dargestellt, die mit NdeI gesammelt werden. Als Beispiel dafür, wie die Technik angewendet werden kann, werden die Spaltraten für eine Reihe von Proteinkonzentrationen in zwei verschiedenen Konzentrationen von Magnesium, einem essentiellen Metallkofaktor, gemessen. Obwohl diese Anwendung des Protokolls NdeI verwendet, kann das Verfahren für die Verwendung mit jeder standortspezifischen Nuklease angepasst werden, indem das DNA-Substratdesign variiert wird.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Protokoll kann verwendet werden, um die Kinetik jedes SSDC-Systems zu messen, vorausgesetzt, dass die Strangtrennung während des Experiments beobachtet wird. Der Nachweis der Spaltung wird durch die Beobachtung der Ablösung der gefesselten Perle beeinflusst und markiert somit den Moment der Strangtrennung. Alle vorhergehenden Schritte erfolgen vor der Detektion der Spaltung; somit wird nur die gesamte Transitzeit erfasst.
Der Flow Cell Coverslip wird durch unspezifische Adsorption von An…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation Stipendium MCB-1715317 unterstützt.
Materials
| 5 minute Epoxy | Devcon | 14250 | |
| anti-digoxigenin FAB fragments | Roche Diagnostics | 11214667001 | |
| camera and software | Jenoptik | GRYPHAX SUBRA | |
| data analysis software | Vernier Inc. | LP | |
| double sided tape | Grace Biolabs | SA-S-1L | |
| Dulbeccos Phosphate Buffered Saline | Corning | 21-031-CV | |
| ethanol 95% | VWR | 89370-082 | |
| forward primer: digoxigenin-CCAACTTAATCGCCTTGC | Integrated DNA Technologies | n/a | |
| image analysis software | National Institutes of Health | ImageJ | |
| inverted microscope | Nikon | TE2000 | |
| knife printer | Silhouette | ||
| M13mp18 DNA | New England Biolabs | N4040S | |
| MyOne streptavidin beads | Thermo Fisher Scientific | 65601 | |
| NdeI enzyme | New England Biolabs | R0111S | |
| PCR cleanup kit | Qiagen | 28104 | |
| pluronic F-127 | Anatrace | P305 | |
| polyethylene tubing PE-20 | BD Intramedic | 427406 | |
| polyethylene tubing PE-60 | BD Intramedic | 427416 | |
| Q5 Mastermix | New England Biolabs | M0492S | |
| rare earth magnet 0.5" OD 0.25" ID | National Imports | NSN0814 | |
| rare earth magnet 0.75" OD 0.5" ID | National Imports | NSN0615 | |
| reverse primer: biotin-TGACCATTAGATACATTTCGC | Integrated DNA Technologies | n/a | |
| syringe pump | Kent Scientific | Genie Plus | |
| β-Casein from bovine Milk | Sigma-Aldrich | C6905 |
References
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