Ensayo cinético de molécula única de alto rendimiento paralelo para la escoja de ADN específica del sitio

Summary

Se describe un método altamente paralelo para medir el escote específico del sitio del ADN a nivel de molécula única. Este protocolo muestra la técnica mediante la restricción endonucleasa NdeI. El método se puede modificar fácilmente para estudiar cualquier proceso que resulte en una escisión de ADN específica del sitio.

Abstract

La escisión de ADN específica del sitio (SSDC) es un paso clave en muchos procesos celulares, y es crucial para la edición de genes. Este trabajo describe un ensayo cinético capaz de medir SSDC en muchas moléculas de ADN individuales simultáneamente. Los DNA de sustrato amarreado, cada uno de los que contienen una sola copia de la secuencia de destino, se preparan en un canal de flujo microfluídico. Un imán externo aplica una fuerza débil a las perlas paramagnéticas. La integridad de hasta 1.000 DNAs individuales se puede monitorear visualizando las micropersas bajo imágenes de campo oscuro utilizando un objetivo de campo amplio y bajo aumento. La inyección de una restricción endonucleasa, NdeI, inicia la reacción de escote. La microscopía de vídeo se utiliza para registrar el momento exacto de cada escisión de ADN observando el marco en el que el cordón asociado se mueve hacia arriba y fuera del plano focal del objetivo. El recuento de cuentas fotograma a fotograma cuantifica la reacción y un ajuste exponencial determina la velocidad de reacción. Este método permite la recopilación de datos cuantitativos y estadísticamente significativos sobre reacciones SSDC de molécula única en un solo experimento.

Introduction

La escisión de ADN específica del sitio (SSDC) es un paso clave en muchas transacciones genómicas. Por ejemplo, los sistemas de modificación de restricciones bacterianas (RM)¹ y CRISPR² protegen las células del ataque por fagos y plásmidos reconociendo y cortando ADN extraño en secuencias específicas. En el tipo II RM, las endonucleaciones de restricción (RE) reconocen secuencias cortas de 4-8 pares de bases (bp) mediante interacciones entre proteínas y ácidos nucleicos³. Las endonucleasas asociadas a CRISPR, como Cas9, se unen a sitios a través de la hibridación del sitio de destino con crRNAs enlazados a las endonucleasas^4. La creación de roturas de doble cadena (DSB) específicas del sitio también son el primer paso en muchos eventos de recombinación de ADN⁵. Por ejemplo, la diversidad de regiones de enlace de antígenos creadas por la recombinación V(D)J requiere el reconocimiento y la escisión de sitios de destino específicos^6. Se sabe que algunos transposones apuntan a secuencias de ADN específicas, así como⁷. No es de extrañar que muchas nuclelas específicas del sitio implicadas en estos procesos, como Cas9, sean un componente clave de las tecnologías de edición génica⁸. Además, también se han diseñado nuevas endonucleasas específicas del sitio (es decir, nucleasas de dedos de zinc⁹ y TALENS¹⁰⁾para editar genomas.

Se han empleado muchos métodos para medir la cinética de la escisión específica del sitio de los ácidos nucleicos. Estos incluyen análisis de gel, fluorescencia^11,12, y métodos basados en la^{secuenciación 13}. Se logró un avance importante con el anclaje de microperlas, lo que permite que los DSB en moléculas individuales de ADN sean detectados por el movimiento de un cordón después de la separación de la hebra. En estos métodos, se emplean diferentes tipos de fuerzas para asegurar la separación de las hebras y el movimiento del cordón después de la escote. En un caso, las trampas ópticas se han utilizado para medir la escisión del ADN mediante EcoRV¹⁴. En estos experimentos, la búsqueda de destino es el objetivo de la investigación, con condiciones optimizadas para que el enlace específico del sitio sea el paso de limitación de velocidad. Un inconveniente de las trampas ópticas es que sólo se puede observar un solo ADN a la vez. Además, se debe aplicar una fuerza de tracción grande periódica para probar la separación de la hebra.

Otra técnica utiliza una combinación de flujo y fuerzas magnéticas débiles para tirar del cordón de una manera continua¹⁵. De esta manera, se mide la difusión limitada de escote por NdeI. El método empleado permite la medición simultánea de varios cientos de DNA a la vez, lo que permite alcanzar la significancia estadística en un solo experimento. También se han utilizado experimentos basados en pinzas magnéticas. En uno de esos estudios, se estudió una integrasa retroviral mediante la inclusión de un OSD en el oligonucleótido de inserción¹⁶. La integración exitosa dio lugar a la incorporación del OSD en el ADN atado y la pérdida del cordón adjunto. En un estudio similar de la restricción de ATP tipo III endonucleasa EcoPI, se observaron decenas de DNA en un solo experimento¹⁷. Las pinzas magnéticas tienen la ventaja de que la tensión, así como el bucle de ADN, se pueden controlar y monitorear durante la reacción.

Aquí se presenta un método de molécula única altamente paralelo para medir la cinética SSDC, que aprovecha las mejoras recientes en el anclaje a gran escala de DNAs. Este método es una mejora y extensión de los métodos anteriores utilizados para medir la replicación del ADN^18,la longitud del contorno del ADN^19,y la escisión por REs¹⁵. En esta técnica, los DNA lineales que contienen una sola copia de la secuencia de reconocimiento se preparan con biotina en un extremo y digoxigenina en el otro. La biotina se une a la estreptavidina, que se une covalentemente a un microbead paramagnético. Los complejos de las cuentas de ADN se inyectan en un canal microfluídico que ha sido funcionalizado con fragmentos de la FAB anti-digoxigenina. A continuación, el ADN se une a los puntos de unión superficial mediante la unión de digoxigenina a los fragmentos del FAB adsorbidos. Las fuerzas magnéticas débiles aplicadas con un imán permanente impiden que el cordón se pegue de forma no específica a la superficie. Las muestras se pueden inyectar rápidamente (<30 s) en el canal de flujo para activar la reacción de escote. El flujo se desactiva durante la recopilación de datos. A medida que se corta cada ADN, la hora exacta de la escisión se puede determinar mediante la grabación del marco en el que el cordón se mueve hacia arriba y fuera del plan focal del objetivo, desapareciendo así de la grabación de vídeo. Se puede utilizar un recuento fotograma por fotograma de las perlas restantes para cuantificar el progreso de la reacción.

A continuación se presenta el protocolo completo, así como los datos de ejemplo recopilados con NdeI. Como ejemplo de cómo se puede aplicar la técnica, las tasas de escote para una gama de concentraciones de proteínas se miden en dos concentraciones diferentes de magnesio, un cofactor de metal esencial. Aunque esta aplicación del protocolo utiliza NdeI, el método se puede adaptar para su uso con cualquier nucleasa específica del sitio variando el diseño del sustrato de ADN.

Protocol

1. Hacer que la celda de flujo Lavado de los cubreobjetos Coloque los cubreobjetos en frascos de tinción y sonicar con etanol (EtOH), luego con 1 M KOH (durante 30 minutos cada uno). Para evitar la precipitación de KOH en EtOH, enjuague bien con ddH2O entre lavados. Repita el procedimiento tanto EtOH como los pasos de lavado de KOH 1x para un número total de cuatro lavados (dos EtOH y dos KOH). Almacene los cubreobjetos limpios en ddH2O en frascos de tinción. <…

Representative Results

Usando esta técnica, las tasas SSDC de NdeI se midieron para una gama de concentraciones de proteínas (0,25–4,00 U/ml) en dos concentraciones diferentes de magnesio (2 mM y 4 mM). Cada una de estas condiciones se replicó al menos dos veces, con unos pocos cientos a 1.000 DNAs atados por experimento. La Figura 2 describe el diseño experimental. En la figura 3 se muestran ejemplos de detalles de recopilación y análisis de datos. La Fig…

Discussion

El protocolo se puede utilizar para medir la cinética de cualquier sistema SSDC, siempre que se observe la separación de hebras durante el experimento. La detección de escote se ve afectada por la observación del desprendimiento del cordón amarreado y, por lo tanto, marca el instante de separación de la hebra. Todos los pasos anteriores se producen antes de la detección del escote; por lo tanto, sólo se registra el tiempo total de tránsito.

El cubreobjetos de células de flujo se func…

Materials

5 minute Epoxy	Devcon	14250
anti-digoxigenin FAB fragments	Roche Diagnostics	11214667001
camera and software	Jenoptik	GRYPHAX SUBRA
data analysis software	Vernier Inc.	LP
double sided tape	Grace Biolabs	SA-S-1L
Dulbeccos Phosphate Buffered Saline	Corning	21-031-CV
ethanol 95%	VWR	89370-082
forward primer: digoxigenin-CCAACTTAATCGCCTTGC	Integrated DNA Technologies	n/a
image analysis software	National Institutes of Health	ImageJ
inverted microscope	Nikon	TE2000
knife printer	Silhouette
M13mp18 DNA	New England Biolabs	N4040S
MyOne streptavidin beads	Thermo Fisher Scientific	65601
NdeI enzyme	New England Biolabs	R0111S
PCR cleanup kit	Qiagen	28104
pluronic F-127	Anatrace	P305
polyethylene tubing PE-20	BD Intramedic	427406
polyethylene tubing PE-60	BD Intramedic	427416
Q5 Mastermix	New England Biolabs	M0492S
rare earth magnet 0.5" OD 0.25" ID	National Imports	NSN0814
rare earth magnet 0.75" OD 0.5" ID	National Imports	NSN0615
reverse primer: biotin-TGACCATTAGATACATTTCGC	Integrated DNA Technologies	n/a
syringe pump	Kent Scientific	Genie Plus
β-Casein from bovine Milk	Sigma-Aldrich	C6905