Параллельная высокая пропускная способность одной молекулы кинетический анализ для сайта-специфического расщепления ДНК
Summary
Описан весьма параллельный метод измерения специфического участка расщепления ДНК на уровне одной молекулы. Этот протокол демонстрирует технику с использованием ограничения endonuclease NdeI. Метод может быть легко изменен для изучения любого процесса, что приводит к сайту конкретных расщепления ДНК.
Abstract
Расщепление ДНК (SSDC) является ключевым шагом во многих клеточных процессах, и это имеет решающее значение для редактирования генов. Эта работа описывает кинетический анализ, способный измерять SSDC во многих отдельных молекулах ДНК одновременно. Привязные бисером субстратные ДНК, каждый из которых содержит одну копию целевой последовательности, готовятся в канале микрофлюидного потока. Внешний магнит применяет слабую силу к парамагнитным бусинкам. Целостность до 1000 отдельных ДНК можно контролировать с помощью визуализации микробусов под темным полем изображения с помощью широкого поля, с низким увеличением цели. Инъекция эндонуклеазы ограничения, NdeI, инициирует реакцию расщепления. Видео микроскопия используется для записи точного момента каждого расщепления ДНК, наблюдая кадр, в котором связанный шарик движется вверх и из фокусной плоскости цели. Подсчет бисера кадр за кадром количественно определяет реакцию, и экспоненциальная подгонка определяет скорость реакции. Этот метод позволяет сбор количественных и статистически значимых данных о реакции одной молекулы SSDC в одном эксперименте.
Introduction
Расщепление ДНК(SSDC) является ключевым шагом во многих геномных транзакциях. Например, системы бактериального ограничения модификации (RM)1 и CRISPR2 защищают клетки от атак фагов и плазмидов, распознавая и расщепляя иную ДНК в определенных последовательностях. В типе II RM, ограничения эндонуклеи (REs) распознают короткие 4-8 базовых пар (bp) последовательности через белково-нуклеиновой кислотывзаимодействий 3. СВЯЗАННЫе с CRISPR эндонуклеи, такие как Cas9, связываются с сайтами через гибридизацию целевого сайта с crRNAs, связанными с эндонуклеями4. Создание сайта конкретных двойных мель перерывов (DSBs) также являются первым шагом во многих событиях рекомбинацииДНК 5. Например, разнообразие антигенных связывающих областей, созданных рекомбинацией V(D)J, требует распознавания и расщепления конкретных целевыхобъектов 6. Некоторые транспозоны, как известно, нацелены на конкретные последовательности ДНК, атакже 7. Неудивительно, что многие ядра, связанные с конкретными участками, участвующие в этих процессах, такие как Cas9, являются ключевым компонентом технологий редактирования генов8. Кроме того, для редактирования геномов были также разработаны новые эндонуклеазы для конкретныхсайтов (т.е. ядра цинковых пальцев 9 и TALENS10).
Многие методы были использованы для измерения кинетики сайта конкретных расщепления нуклеиновых кислот. К ним относятся гель анализ, флуоресценция11,12, и секвенирования на основеметодов 13. Значительный прогресс был достигнут с привязыванием микробусов, что позволяет DSBs в отдельных молекул ДНК, которые будут обнаружены движением шарика после разделения нити. В этих методах, различные типы сил используются для обеспечения разделения нити и движения шарика после расщепления. В одном случае, оптические ловушки были использованы для измерения расщепления ДНК EcoRV14. В этих экспериментах целевой поиск является целью исследования, при этом условия оптимизированы таким образом, чтобы привязкой к конкретному сайту был шаг ограничения скорости. Одним из недостатков оптических ловушек является то, что только одна ДНК может наблюдаться одновременно. Кроме того, периодические большие силы потянув должны быть применены для проверки на разделение нити.
Другой метод использует сочетание потока и слабых магнитных сил, чтобы тянуть на шарик в непрерывной манере15. Таким образом, диффузия ограниченного расщепления NdeI измеряется. Используемый метод позволяет одновременно измерять сразу несколько сотен ДНК, что позволяет достичь статистической значимости в ходе одного эксперимента. Эксперименты на основе магнитных пинцетов также были использованы. В одном из таких исследований, ретровирусной интегразы был изучен в том числе DSB в вставке олигонуклеотид16. Успешная интеграция привела к включению DSB в привязанную ДНК и потере прикрепленного шарика. В аналогичном исследовании АТФ-зависимого типа III ограничения эндонуклеазы EcoPI, десятки ДНК наблюдались в одном эксперименте17. Магнитные пинцеты имеют то преимущество, что напряжение, а также цикл ДНК, можно контролировать и контролировать во время реакции.
Здесь представлен весьма параллельный метод одной молекулы для измерения кинетики SSDC, который использует недавние улучшения в крупномасштабных привязываниях ДНК. Этот метод является улучшение и расширение предыдущих методов, используемых дляизмерения репликации ДНК 18, длинаконтура ДНК 19, и расщепление REs15. В этом методе линейные ДНК, содержащие одну копию последовательности распознавания, готовятся с биотином на одном конце и дигоксигенином на другом. Биотин связывает стрептавидин, который ковалентно крепится к парамагнитной микробусу. ДНК-бисерные комплексы вводятся в микрофлюидный канал, который был функционализирован с анти-digoxigenin FAB фрагментов. Затем ДНК привязывается к точкам крепления поверхности через привязку дигоксигенина к адсорбированным фрагментам FAB. Слабые магнитные силы, применяемые с помощью постоянного магнита, не держат шарик от прилипания некондиентного к поверхности. Образцы могут быть введены быстро (Lt;30 s) в канал потока, чтобы активировать реакцию расщепления. Поток отключается во время сбора данных. Поскольку каждая ДНК расщепляется, точное время расщепления может быть определено путем записи кадра, в котором шарик движется вверх и из координационного плана цели, тем самым исчезая из видеозаписи. Для количественной оценки прогресса реакции можно использовать рамку за кадром, подсчитывая оставшиеся бусы.
Ниже приведен полный протокол, а также пример данных, собранных с помощью NdeI. В качестве примера того, как метод может быть применен, расщепление ставки для целого ряда концентраций белка измеряются в двух различных концентрациях магния, существенного кофактора металла. Хотя это применение протокола использует NdeI, метод может быть адаптирован для использования с любым сайтом конкретных нуклеазы путем изменения конструкции субстрата ДНК.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол может быть использован для измерения кинетики любой системы SSDC, при условии, что разделение нити наблюдается в ходе эксперимента. Обнаружение расщепления зависит от наблюдения за отслоение привязали шарика и, следовательно, знаменует собой момент разделения нити. Все предыду…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Грантом Национального научного фонда MCB-1715317.
Materials
| 5 minute Epoxy | Devcon | 14250 | |
| anti-digoxigenin FAB fragments | Roche Diagnostics | 11214667001 | |
| camera and software | Jenoptik | GRYPHAX SUBRA | |
| data analysis software | Vernier Inc. | LP | |
| double sided tape | Grace Biolabs | SA-S-1L | |
| Dulbeccos Phosphate Buffered Saline | Corning | 21-031-CV | |
| ethanol 95% | VWR | 89370-082 | |
| forward primer: digoxigenin-CCAACTTAATCGCCTTGC | Integrated DNA Technologies | n/a | |
| image analysis software | National Institutes of Health | ImageJ | |
| inverted microscope | Nikon | TE2000 | |
| knife printer | Silhouette | ||
| M13mp18 DNA | New England Biolabs | N4040S | |
| MyOne streptavidin beads | Thermo Fisher Scientific | 65601 | |
| NdeI enzyme | New England Biolabs | R0111S | |
| PCR cleanup kit | Qiagen | 28104 | |
| pluronic F-127 | Anatrace | P305 | |
| polyethylene tubing PE-20 | BD Intramedic | 427406 | |
| polyethylene tubing PE-60 | BD Intramedic | 427416 | |
| Q5 Mastermix | New England Biolabs | M0492S | |
| rare earth magnet 0.5" OD 0.25" ID | National Imports | NSN0814 | |
| rare earth magnet 0.75" OD 0.5" ID | National Imports | NSN0615 | |
| reverse primer: biotin-TGACCATTAGATACATTTCGC | Integrated DNA Technologies | n/a | |
| syringe pump | Kent Scientific | Genie Plus | |
| β-Casein from bovine Milk | Sigma-Aldrich | C6905 |
References
- Tock, M. R., Dryden, D. T. The biology of restriction and anti-restriction. Current Opinion in Microbiology. 8 (4), 466-472 (2005).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., Wende, W. Type II restriction endonucleases: structure and mechanism. Cellular and Molecular Life Sciences. 62 (6), 685-707 (2005).
- Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).
- Sadowski, P. D. Site-specific genetic recombination: hops, flips, and flops. The FASEB Journal. 7 (9), 760-767 (1993).
- Schatz, D. G. Antigen receptor genes and the evolution of a recombinase. Seminars in Immunology. 16 (4), 245-256 (2004).
- Craig, N. L. Tn7: a target site-specific transposon. Molecular Microbiology. 5 (11), 2569-2573 (1991).
- Gori, J. L., et al. Delivery and Specificity of CRISPR/Cas9 Genome Editing Technologies for Human Gene Therapy. Human Gene Therapy. 26 (7), 443-451 (2015).
- Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).
- Joung, J. K., Sander, J. D. TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).
- Alves, J., Urbanke, C., Fliess, A., Maass, G., Pingoud, A. Fluorescence stopped-flow kinetics of the cleavage of synthetic oligodeoxynucleotides by the EcoRI restriction endonuclease. 생화학. 28 (19), 7879-7888 (1989).
- Deng, J., Jin, Y., Chen, G., Wang, L. Label-free fluorescent assay for real-time monitoring site-specific DNA cleavage by EcoRI endonuclease. Analyst. 137 (7), 1713-1717 (2012).
- Becker, W. R., et al. High-throughput analysis reveals rules for target RNA binding and cleavage by AGO2. Molecular Cell. 75 (4), 741-755 (2019).
- vanden Broek, B., Lomholt, M. A., Kalisch, S. M., Metzler, R., Wuite, G. J. How DNA coiling enhances target localization by proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (41), 15738-15742 (2008).
- Gambino, S., et al. A single molecule assay for measuring site-specific DNA cleavage. Analytical Biochemistry. 495, 3-5 (2016).
- Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nature Communications. 7, 11409 (2016).
- van Aelst, K., et al. Type III restriction enzymes cleave DNA by long-range interaction between sites in both head-to-head and tail-to-tail inverted repeat. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (20), 9123-9128 (2010).
- Williams, K., et al. A single molecule DNA flow stretching microscope for undergraduates. American Journal of Physics. 79 (11), 1112-1120 (2011).
- Song, D., et al. Tethered particle motion with single DNA molecules. American Journal of Physics. 83 (5), 418-426 (2015).
- Etson, C. M., Todorov, P., Walt, D. R. Elucidating Restriction Endonucleases Reaction Mechanisms via Dwell-Time Distribution Analysis. Biophys Journal. 106 (2), 22 (2014).
- Piatt, S., Price, A. C. Analyzing dwell times with the Generalized Method of Moments. PLoS One. 14 (1), 0197726 (2019).
