Summary
Questo protocollo mostra come impiegare la microscopia super-risoluzione per studiare la co-localizzazione delle proteine nelle colture neuronali primarie.
Abstract
Le sinapsi sono gli elementi funzionali dei neuroni e i loro difetti o perdite sono alla base di diversi disturbi neurodegenerativi e neurologici. Gli studi di imaging sono ampiamente utilizzati per studiare la loro funzione e plasticità in condizioni fisiologiche e patologiche. A causa delle loro dimensioni e struttura, gli studi di localizzazione delle proteine richiedono tecniche di imaging ad alta risoluzione. In questo protocollo, descriviamo una procedura per studiare nei neuroni primari la co-localizzazione delle proteine bersaglio con marcatori sinaptici a un livello di super-risoluzione utilizzando la microscopia ad illuminazione strutturata (SIM). La SIM è una tecnica di illuminazione a luce modellata che raddoppia la risoluzione spaziale della microscopia a campo largo, raggiungendo un dettaglio di circa 100 nm. Il protocollo indica i controlli e le impostazioni necessari per robusti studi di co-localizzazione e una panoramica dei metodi statistici per analizzare correttamente i dati di imaging.
Introduction
La comprensione e la visione della sinapsi è cambiata enormemente dalla sua prima descrizione da Foster e Sherrington nel 18971. Da allora, la nostra conoscenza della comunicazione neuronale e dei processi molecolari alla base è cresciuta esponenzialmente2. È diventato chiaro che le sinapsi possono essere pensate come un sistema a due compartimenti: un compartimento pre-sinaptico contenente vesciche per il rilascio di neurotrasmettitori e un compartimento post-sinaptico con recettori3. Questa visione semplicistica, negli ultimi vent'anni, si è evoluta in una complessa rete di proteine necessarie per trasdurre il legame trasmettitore nella segnalazione4.
I vantaggi nella comprensione sono in parte dovuti a tecniche di super-risoluzione che hanno superato il limite di diffrazione della microscopia leggera convenzionale per soddisfare la dimensione delle sinapsimeglio 5,6,7,8,9,10. A causa del limite di diffrazione, un microscopio ottico non può raggiungere una risoluzione superiore a 200 nmlateralmente11,12. Per aggirare questo limite, sono state create tecniche di super-risoluzione, utilizzando approcci diversi e raggiungendo diverse risoluzioni limite di sub-diffrazione: SIM, STED (Stimulated Emission Depletion Microscopy), PALM (PhotoActivated Localization Microscopy) e STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)13,14. SIM raddoppia la risoluzione spaziale dei sistemi di microscopia a campo largo basati su laser inserendo una griglia di diffrazione nel percorso del fascio di eccitazione15. La grata mobile diffracts i raggi laser per creare un modello di illuminazione noto, di solito strisce. Questo modello di luce appositamente strutturato è sovrapposto alla distribuzione spaziale sconosciuta del colorante fluorescente (del campione). Le frange di interferenza formate dai due modelli codificano per dettagli fini altrimenti indistinguibili con la normale microscopia a campo largo. L'immagine finale super-risolta si ottiene combinando e decodificando con metodi matematici diverse immagini grezze dello stesso campione ottenute dalle traduzioni e rotazioni della grata di diffrazione. La risoluzione delle immagini super-risolte raggiunge i 100 nm nei 500 nm nelle direzioni assiali per 2D-SIM15 o 100 nm nei lateral e 250 nm nelle direzioni assiali per 3D-SIM16.
La nuova comprensione della sinapsi è ancora più importante alla luce dei molti disturbi neurologici in cui la disfunzione sinaptica svolge un ruolo importante nell'insorgenza e nella progressione17,18. Morbo di Alzheimer, Sindrome di Down, Morbo di Parkinson, malattie prioni, epilessia, disturbi dello spettro autistico e sindrome X fragile tra gli altri sono stati collegati ad anomalie nella composizione sinaptica, morfologia e funzione19,20,21,22.
Recentemente, utilizzando una serie di anticorpi specifici suMO, abbiamo usato la SIM per mostrare la co-localizzazione nei neuroni ippocampali primari delle proteine SUMO con i marcatori pre e post-sinaptici synaptophysin e PSD95 al livello disuper-risoluzione 23. Questo ci ha permesso di confermare la prova di microscopia biochimica e confocale della localizzazione SUMO nei neuroni.
Qui, descriviamo un protocollo per studiare la localizzazione delle proteine nei neuroni primari dell'ippocampo dei topi. Allo stesso tempo, questo protocollo può essere adattato a diversi tipi di colture neuronali primarie.
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Protocol
1. Culture primarie
- Coltura mouse ippocampo primario neuroni in coperture camerate (come Ibidi μ-Slide 8 Well o Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass) che corrispondono al requisito obiettivo per #1.5 (0.17 mm) coprelo spessore.
- Coperture con rivestimento camerato con 100 lL di poli-L-lysine (100 g/mL).
- Il giorno successivo, lavare due volte i coperture con camera con salina sterile tamponata al fosfato (PBS).
- Per ottenere i neuroni primari del topo, isolare gli ippocampi da P1-P4cuccioli 23.
- Posizionare l'ippocampo sezionato in 10 mL di Dissection Media (Tabella 1) e lasciarli depositare nella parte inferiore del tubo.
- Utilizzando una pipetta sterile, rimuovere con attenzione il Dissection Media, lasciando l'ippocampo indisturbato nella parte inferiore del tubo.
- Aggiungere 10 mL di Media 1 (Tabella 1) all'ippocampo e incubare per 30 minuti a 37 gradi centigradi.
- Utilizzando una pipetta sterile, rimuovere con attenzione Media 1, lasciando l'ippocampo indisturbato nella parte inferiore del tubo.
- Aggiungere 10 mL di media 2 (Tabella 1) e lasciare il tubo centrifuga (coperto) sotto il cofano orizzontalmente per 45 minuti.
- Lasciare che il tubo di centrifuga sia in piedi verticalmente per consentire al tessuto di depositarsi nella parte inferiore del tubo.
- Utilizzando una pipetta sterile, rimuovere con attenzione Media 2, lasciando l'ippocampo indisturbato nella parte inferiore del tubo di centrifuga.
- Aggiungere 2 mL di supporto 3 (Tabella 1).
- Utilizzando una pipetta p1000 con una punta filtrata, dissociare meccanicamente le cellule dal tessuto.
- Trasferire il supernatant, in cui si trovano i neuroni isolati, in un tubo di centrifuga di 15 mL.
- Centrifugare la sospensione delle celle per 2 min a 300 x g a temperatura ambiente (RT).
- Dopo la centrifugazione, le cellule si trovano nella parte inferiore del tubo di centrifuga. Utilizzando una pipetta sterile scartare il supernante.
- Riespose le celle in 1 mL di Media 4.
- Utilizzare un filtro di 70 m per eliminare le celle non dissociate.
- Contare le cellule vitali in una camera di Bàrker aggiungendo 1 soluzione blu Trypan da 0,4 % a 19 L della sospensione cellulare.
- Cellule piacche a 70.000 cellule/pozzo in un volume di 200 L per pozzo.
- Lasciare che le cellule si alleghino per 2 h in un'incubatrice umidificata a 37 gradi centigradi e al 5% di CO2.
- Togliere le coperture camerate dall'incubatrice e sostituire con cura il mezzo con 200 L di Culture Media.
- Lasciare le coperture camerate in un'incubatrice umidificata a 37 gradi centigradi e al 5% di CO2.
- Sostituire un terzo del mezzo con supporti di coltura freschi ogni 5-7 giorni.
- Attendere fino a quando i neuroni primari ippocampo sono completamente maturati (12-14 giorni dopo la placcatura) per eseguire studi di co-localizzazione.
2. Colorazione dell'immunofluorescenza
- Prendi le coperte camerate dall'incubatrice.
- Rimuovere il supporto.
- Lavare rapidamente i pozzetti con 200 L di PBS.
- Aggiungere il 4% di paraformaldeide (PFA) in PBS (200 L/well) ai neuroni per fissarli rapidamente.
- Incubare le cellule per 15 min a RT.
- Rimuovere la soluzione PFA.
- Permeare le cellule aggiungendo PBS con 0,2% Tritone X-100 (200 l/pozzo).
- Incubare per 1 min a RT.
- Rimuovere la soluzione e incubare i campioni con 1% di albumina di siero bovino (BSA) in PBS (200 l/pozzo) per 1 h a RT per coprire passivamente tutte le superfici di legame libero della piastra con una proteina irrilevante per l'analisi. Un buffer di blocco basato su BSA senza Triton X-100 riduce lo sfondo dell'anticorpo in modo più efficiente rispetto allo stesso buffer con 0,2% Triton X-100.
- Rimuovere la soluzione.
- Aggiungere l'anticorpo primario di scelta diluito in una soluzione PBS contenente 1% BSA e 0,2% Triton X-100 (120-200 L/well, a seconda della diluizione e della disponibilità dell'anticorpo). Incubare i campioni per 2 h.
- Come controllo negativo, non aggiungere alcun anticorpo primario a uno dei pozzi. Contemporaneamente possono essere utilizzati più anticorpi di specie diverse contro obiettivi diversi. Usa un anticorpo contro MAP2 (un marcatore neuronale) allevato nel pollo, un anticorpo contro PSD95 o sinotofisi allevati nel topo e un anticorpo contro una proteina bersaglio allevata nel coniglio. Ciò consente analisi SIM a tre colori.
- Lavare rapidamente i pozzetti tre volte con PBS (200 L/pozzo).
- Aggiungere anticorpi secondari (gli anticorpi secondari dyLight e Alexa possono essere entrambi utilizzati) diluiti in una soluzione PBS contenente 1% BSA e 0,2% Triton X-100 (200 l/well). Incubare i campioni per 1 h a RT.
- Lavare rapidamente i pozzetti tre volte con PBS (200 L/pozzo).
- Aggiungere il colorante Hoechst ad una concentrazione di 1 g/mL diluito in PBS (200 L/well) ai nuclei di macchia. Incubare i campioni per 10 minuti a RT.
- Lavare rapidamente i pozzi due volte con PBS.
- Montare le celle utilizzando un montante compatibile con la SIM. Utilizzare 10 L/pozzo di ProLong Glass Antifade Mountant.
- Coprire e proteggere le cellule con un vetro di copertura (ad esempio, un sottovecchiale rotondo con un diametro di 8 mm). Possono essere utilizzati anche quelli quadrati.
- Conservare le copertine a camera a RT e attendere almeno 48 h prima di acquisire le immagini. Diamond Glass richiede almeno due giorni di stagionatura prima delle acquisizioni di super-risoluzione.
3. Controllo della specificità dell'anticorpo
NOTA: utilizzare due strategie per assicurare la specificità degli anticorpi. La prima strategia consiste nell'utilizzare almeno due anticorpi diversi che prendono di mira lo stesso substrato. La seconda strategia è la neutralizzazione degli anticorpi mediante incubazione con il bersaglio proteico purificato o l'epitopo utilizzato per sollevare l'anticorpo.
- Incubare l'anticorpo di scelta con cinque volte superiore del bersaglio ricombinante o epitopo per 1 h a RT in 1% BSA in PBS.
- Dopo l'incubazione, utilizzare l'anticorpo neutralizzato alla concentrazione abituale per la colorazione come descritto sopra a partire da 2.11.
4. Calibrazione al microscopio
NOTA: Usiamo abitualmente un sistema microscopo N-SIM Super-Resolution prodotto da Nikon per gli studi di super-risoluzione. Tuttavia, molte altre aziende offrono anche microscopi super-risoluzione nei loro cataloghi. Anche se sono descritte indicazioni specifiche per il sistema N-SIM di Nikon, le istruzioni che seguono possono essere generalizzate ad altri sistemi. Prima dell'acquisizione di immagini SIM, il sistema richiede una corretta calibrazione con specifiche perline fluorescenti di dimensioni sub-risoluzione. Un esempio sono le microsfere TetraSpeck. Queste perle sono macchiate con diversi coloranti fluorescenti per consentire la calibrazione di diversi laser con un campione.
- In un bagno d'acqua si sorrendono circa 1,8 x10 8 microsfere fluorescenti per 10 minuti. Il sistema N-SIM di Nikon richiede un campione di perline multicolore scarsamente popolate per la calibrazione. Questo potrebbe essere diverso per altri sistemi che richiedono un singolo strato denso di perline fluorescenti di dimensioni sub-risoluzione. Regolare il numero di particelle fluorescenti di conseguenza.
- Diluire le microsfere fluorescenti 1:500 in acqua doppia distillata.
- Sonicare una seconda volta per altri 10 minuti.
- Pipetto 15 L delle perline diluite in un pozzo di un coperture camerate.
- Lasciare asciugare la soluzione per 5 minuti a RT.
- Aggiungete 10 L della soluzione di montaggio e posizionate sopra un coperture da 8 mm.
- Attendere almeno 48 ore per consentire una corretta cura.
- Accendere il microscopio e i laser.
- Lasciare che il sistema si smori per raggiungere l'equilibrio termico di tutti i componenti del microscopio. N-SIM Super-Resolution Microscope System richiede almeno 3 ore.
- Selezionare l'obiettivo 100x.
- Avviare la calibrazione allineando i laser al centro del blocco di griglia di diffrazione. Nel sistema N-SIM, una manopola micrometrica e una telecamera dedicata consentono la centramento dei fasci di luce verso il bersaglio.
- Inserire il coperture camerate nel microscopio per la visualizzazione. Impostare il sistema sul coperture cameratesori del foglio regolando il collare di correzione obiettivo. Il software NIS, il software proprietario fornito con i sistemi N-SIM Super-Resolution Microscope, ha una funzione automatica per regolare i collari di correzione.
- Regolare la messa a fuoco del blocco di grata per ogni canale per garantire l'illuminazione del modello strutturato focalizzato sul campione. Il software NIS fornisce una funzione automatica per questa attività.
- Successivamente, acquisire immagini raw 3D-SIM delle microsfere multicolore. Ricostruire le immagini grezze per ottenere un'immagine super-risolta utilizzando il software al microscopio o la piattaforma software open-source per l'analisi delle immagini biologiche ImageJ24 e il plugin fairSIM25.
- Calcolare, per ogni lunghezza d'onda separata, la trasformazione di Fourier dell'immagine super-risolta ottenuta in 4.14. Se l'immagine trasformata non riesce a ottenere un modello simile a un fiore corretto, riavviare la calibrazione dalla 4.11 poiché la super-risoluzione non è stata raggiunta.
- Nell'immagine super-risolta, selezionare una singola microsfera e calcolarne il profilo di intensità per ogni canale per misurare la risoluzione raggiunta. Ora dovrebbe essere vicino a 100 nm lateralmente.
- Successivamente, eseguire la registrazione del canale sovrapponendo un'acquisizione multicanale delle microsfere. L'obiettivo è quello di collimate tutti i segnali di canale lateralmente e assia. Ciò eliminerà le aberrazioni cromatiche a causa del disallineamento dei diversi canali e aiuterà l'analisi di co-localizzazione.
- Confermare la qualità della calibrazione utilizzando le funzioni "Illumination Phase Steps" e "Illumination Pattern Focus" di SIMcheck26, una suite di plugin per l'applicazione open source ImageJ. A questo scopo, preparare un coperture camerate per ottenere un singolo strato denso di microsfere TetraSpeck e acquisire un'immagine 3D-SIM del campione. Analizzare l'immagine in ImageJ e, se vengono rilevate aberrazioni, riavviare la calibrazione del microscopio dal passaggio 4.11.
5. Acquisizione
- Iniziare ad analizzare il campione utilizzando un obiettivo 40x in modalità confocale o widefield. Ciò consente la navigazione all'esempio, mantenendo buoni dettagli e un ampio campo di visualizzazione.
- Utilizzare il segnale anticorpale MAP2 per identificare un'area che rappresenta i processi neuronali.
- Acquisire immagini del campione in modalità confocale per determinare la qualità della colorazione. Una scarsa qualità confocale si rifletterà nella scarsa qualità della SIM, richiedendo quindi lo scarto dei campioni.
- Se l'area e la qualità delle immagini sono soddisfacenti, impostare l'obiettivo su 100x.
- Applicare l'olio sull'obiettivo 100x.
- Acquisire un'immagine widefield o confocal che verrà utilizzata in seguito per valutare la qualità dell'immagine super-risolta (Figura 1A,B).
- Passare alla modalità 3D-SIM.
- Utilizzando le finestre di dialogo per impostare i parametri per l'acquisizione, selezionare l'impostazione di profondità di bit più alta disponibile per ottimizzare le informazioni sul colore. In genere, 16 bit è la scelta standard. Inoltre, per migliorare il rapporto segnale-rumore, selezionare un valore di bassa frequenza per l'acquisizione, ad esempio 1 MHz.
- Utilizzando finestre istogramma, impostare la potenza laser per ottenere una risposta lineare del segnale. Per evitare la perdita di informazioni, limitare i pixel saturi nelle immagini. Il sistema N-SIM utilizza una fotocamera Andor iXon3. Quando si lavora a 16 bit, scegliere un'intensità di destinazione di 16.000 per garantire la risposta lineare della fotocamera. In alternativa, scegli un intervallo compreso tra 30.000 e 45.000 per massimizzare la gamma dinamica dell'acquisizione.
- Impostare la potenza laser tra lo 0,1% e il 50% quando si imagingno i campioni e i tempi di esposizione tra 50 ms e 2 s. Le potenze laser superiori al 50% possono causare una rapida fotomarcazione dei fluorofori in uso.
- Avviare l'acquisizione delle immagini in modalità 3D-SIM.
- Utilizzare SIMcheck, una suite di plugin gratuiti per ImageJ, per valutare la qualità di acquisizione delle immagini raw.
- Se SIMCheck non rileva artefatti o problemi di qualità, acquisire un minimo di 10 immagini da 4 repliche tecniche per consentire l'analisi statistica.
6. Post-produzione: ricostruzione dell'immagine
NOTA: le immagini acquisite in 3D-SIM sono immagini raw che devono essere elaborate per ottenere immagini super-risolte ricostruite. Una ricostruzione non corretta delle immagini non elaborati può portare a artefatti che potrebbero influire sull'analisi dei campioni. Si dovrebbe quindi prestare grande attenzione alla scelta corretta dei parametri di ricostruzione.
- Elaborare le immagini raw utilizzando il software di analisi della ricostruzione al microscopio per ottenere un'immagine super-risolta (Figura 1C). In alternativa, utilizzare il plug-in
ImageJ per ricostruire le immagini raw. - Calcolare la trasformazione di Fourier delle immagini super-risolte utilizzando il software di ricostruzione al microscopio o ImageJ plugin SIMCheck. Una buona immagine ricostruita dovrebbe restituire, per ogni canale, un'immagine floreale. Se le immagini ricostruite non riescono a ricreare una forma floreale, riavviare dalle immagini raw e ricostruirle modificando i parametri di ricostruzione come il filtraggio Wiener, l'apodizzazione e la soppressione in ordine zero27. Nel software NIS, utilizzando l'anteprima per monitorare come la modifica dei parametri influisce sull'immagine risolta finale, modificare i parametri i) Contrasto di modulazione illuminazione, ii) Soppressione del rumore ad alta risoluzione e iii) Soppressione fuori fuoco.
- Successivamente, analizzare l'immagine ricostruita per rilevare in modo imparziale gli artefatti utilizzando NanoJ-SQUIRREL28, un plugin basato su ImageJ per valutare la qualità delle immagini super-risolte.
- Se NanoJ-SQUIRREL rileva gli artefatti, riavviali dalle immagini raw e ricostruiscili modificando i parametri di ricostruzione come il filtraggio Wiener, l'apodizzazione e la soppressione dell'ordine zero. Nel software NIS, utilizzando l'anteprima per monitorare il modo in cui la modifica dei parametri influisce sull'immagine risolta finale, modificare i parametri Contrasto modulazione illuminazione, Soppressione rumore ad alta risoluzione e Soppressione fuori fuoco.
- Utilizzare le immagini super-risolte per calcolare il profilo di co-localizzazione e/o i coefficienti di Pearson e Mander.
7. Co-localizzazione con analisi del profilo
NOTA: Come primo passo per studiare la co-localizzazione tra marcatori sinaptici e una proteina di interesse, prendere un'immagine super-risolta e analizzare un singolo locus per determinare la sovrapposizione del segnale.
- Identificare un singolo locus sull'immagine super-risolta.
- Ottenere i profili di intensità dei segnali fluorescenti del luogo di interesse.
- Esportare i dati.
- Utilizzare GraphPad Prism, o un software di analisi simile, per normalizzare tutti i picchi di segnale e ottenere intensità di segnale comparabili per ogni canale con l'obiettivo finale di determinare la co-localizzazione specifica del locus.
8. Quantificazione dei coefficienti di Pearson e Mander
NOTA: Se l'analisi del profilo ha suggerito la co-localizzazione di singoli locus, un'analisi più generale dell'intera immagine può essere effettuata calcolando i coefficienti di Pearson e Mander29,30.
- Utilizzare JACoP31, un plug-in ImageJ , per determinare i due parametri di co-localizzazione: Pearson's e Mander's.
9. Analisi statistica
- Utilizzare GraphPad Prism, o un software di analisi e grafica simile, per elaborare i dati raccolti con JACoP.
- Utilizzare almeno 40 immagini SIM per ogni condizione analizzata per ottenere grafici e per la pertinenza statistica.
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Representative Results
Vi presentiamo qui il flusso di lavoro standard per studiare la co-localizzazione delle proteine neuronali. Abbiamo prima calibrato il microscopio e successivamente abbiamo eseguito l'analisi SIM dei campioni. Per calibrare il sistema, abbiamo usato microsfere fluorescenti di diametro di 0,1 m. Dopo aver ottenuto immagini 3D-SIM super-risolte delle perline, i dati dell'immagine sottostanti vengono trasformati da Fourier per convertirli nuovamente in una rappresentazione di frequenza spaziale. Nella Figura 2A, il modello di fiori distinto è presentato come un'indicazione dei livelli di dettaglio super-risoluzione. Abbiamo poi misurato la risoluzione ottenuta calcolando l'intera larghezza a metà massima (FWHM) del picco del profilo di intensità di una singola perla (Figura 2B,C). Infine, abbiamo corretto l'aberrazione cromatica mediante la registrazione del canale, sempre utilizzando microsfere fluorescenti (Figura 3A,B). Successivamente, abbiamo iniziato ad analizzare il campione con un obiettivo 100x e abbiamo acquisito immagini 3D-SIM. Abbiamo utilizzato SIMCheck per valutare l'evenilazione dell'illuminazione sul campo o il movimento durante l'acquisizione (Figura 4A). Abbiamo controllato le differenze di intensità tra gli angoli del modello di illuminazione (Figura 4B) e abbiamo calcolato il rapporto tra il contrasto di modulazione e il rumore per misurare il contrasto delle strisce locali (Figura 4C). Infine, abbiamo stimato la risoluzione effettiva della ricostruzione (Figura 4D).
Abbiamo poi confermato la qualità delle immagini super-risolte utilizzando NanoJ-SQUIRREL. Nella prima immagine ricostruita (Figura 5A), NanoJ-SQUIRREL ha rilevato la presenza di artefatti (Figura 5C). Sono stati modificati i parametri di ricostruzione per ottenere una nuova immagine super-risolta (Figura 5B) e NanoJ-SQUIRREL ha confermato la mancanza di artefatti (Figura 5D). Dopo aver calibrato il sistema e valutato la qualità delle immagini ricostruite, abbiamo iniziato ad analizzare le colture neuronali primarie macchiate con un anticorpo contro MAP2, un marcatore neuronale, PSD95, un marcatore post-sinaptico e la proteina bersaglio SUMO1. Abbiamo analizzato per la prima volta il campione eseguendo la microscopia confocale a quattro canali con un obiettivo 40x (Figura 6A). Selezionando un'area che rappresenta i processi neuronali, siamo passati a un obiettivo 100x. Abbiamo acquisito immagini sia confocali che SIM della stessa area per valutare la qualità della ricostruzione con NanoJ-SQUIRREL ed eseguire analisi di co-localizzazione. Nella Figura 6B, mostriamo l'immagine 3D-SIM super-risolta dei neuroni macchiati per SENP1 e drebrin. La co-localizzazione nelle immagini super-risolte può essere analizzata con l'analisi del profilo (Figura 7A) e la quantificazione dei coefficienti di Pearson e Mander (Figura 7B).
Figura 1: Confronto tra acquisizioni di widefield, confocali e SIM. (A) Immagine Widefield dei neuroni ippocampali primari immunostati per SENP1 (verde), drebrina (rosso) e MAP2 (malva). DAPI è stato utilizzato per macchiare i nuclei. Barra della scala 5 m. (B) Immagine confocale dello stesso campione del pannello A. (C) Immagine SIM dello stesso campione dei pannelli A e B. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Analisi di un'immagine 3D-SIM delle microsfere per la calibrazione del microscopio. (A) Trasformazione veloce di Fourier di un'acquisizione di microsfere con la sua forma floreale. (B) Selezione di una singola microsfera per determinare la risoluzione spaziale laterale. (C) Profilo di intensità della microsfera singola in B con la misurazione del suo FWHM. I valori rappresentano la risoluzione raggiunta dallo strumento. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Registrazione a tre canali. (A) Acquisizione di microsfere TetraSpeck multicolore (lunghezze d'onda 488nm, 555nm e 647nm) TetraSpeck prima della registrazione. (B) Acquisizione dello stesso campione dopo la calibrazione. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Valutazione della qualità delle immagini raw e ricostruite utilizzando SIMcheck. (A) Analisi della variazione di movimento e illuminazione mediante SIMCheck. Segnale grigio al bianco rappresenta l'illuminazione omogenea e l'assenza di movimento durante l'acquisizione. (B) Profilo di intensità del canale ottenuto analizzando l'immagine raw. In questo esempio la variazione di intensità è minima, per suggerire mancanza o sbiancamento o fluttuazioni. (C) Contrasto di modulazione non elaborato per calcolare il rapporto tra contrasto di modulazione e rumore all'interno dell'immagine. La mappa termica mostra variazioni di contrasto di modulazione. (D) Ricostruito Fourier Plot per analizzare l'ampiezza dello spettro Fourier per determinare la risoluzione effettiva della ricostruzione. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Valutazione della qualità dell'immagine super-risoluzione utilizzando NanoJ-SQUIRREL. (A) Riferimento immagine super-risoluzione con artefatti. (B) Riferimento immagine super-risoluzione di buona qualità. (C) Immagine che rappresenta la mappa degli errori NanoJ-SQUIRREL di A. Le aree più chiare rappresentano artefatti su larga scala, mentre quelle più scure rappresentano una ricostruzione corretta. (D) Mappa di errore NanoJ-SQUIRREL di B. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Esempio di immagine SIM. (A) Microscopia confocale dei neuroni primari. È stato scelto un obiettivo 40X per ottenere una panoramica del campione mantenendo una buona risoluzione. Le cellule sono state immunisse per SUMO1 (verde), PSD95 (rosso) e MAP2 (mauve). DAPI è stato utilizzato per macchiare i nuclei. Barra di scala 50 m. Le immagini sono state visualizzate come proiezione . (B) Immagini SIM per SUMO1 e PSD95 sull'area evidenziata nella casella verde nel pannello A utilizzando un obiettivo 100X. Le punte delle frecce rosse indicano la posizione dell'interno mostrato nella A utilizzata per calcolare il profilo di intensità. Barra della scala 5 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Analisi della co-localizzazione. (A) Immagine super-risolta dei neuroni primari macchiati con un anticorpo contro SENP1 (in verde) e drebrina (in rosso), barra scala 0,5 m, e il suo profilo di intensità. I valori del grafico sono stati normalizzati per ogni canale a 100 (unità arbitraria) e corrispondono all'intensità in pixel mostrata dalla freccia blu. (B) Analisi utilizzando JACoP per calcolare il coefficiente di correlazione di Pearson e il coefficiente di Mander tra SENP1 e drebrin. Vengono visualizzate le finestre del set del plug-in e la soglia visiva. Il coefficiente di Mander è espresso da due valori: la frazione SENP1 che co-localizza con la drebrina (M1) e la frazione di drebrina che co-localizza con SENP1 (M2). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Chiarire la struttura e la composizione della sinapsi è fondamentale per comprendere i processi fisiologici e patologici che regolano la memoria e la cognizione. Mentre nello stato normale, le sinapsi sono gli elementi costitutivi della memoria, sono anche alla base di disturbi neurologici complessi come il morbo di Alzheimer32. Il protocollo qui descritto serve a studiare la co-localizzazione delle proteine neuronali con una tecnica di microscopia super-risoluzione chiamata SIM. Utilizzando un particolare modello di illuminazione, la SIM può raggiungere una risoluzione di circa 0,1 m, che è adatta per lo studio delle sinapsi, che normalmente misurano tra 0,03 e 0,15 m. Per un dettaglio ancora maggiore, altre tecniche di super-risoluzione come STED (Stimulated Emission Depletion Microscopy), PALM (PhotoActivated Localization Microscopy) o STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy), che possono raggiungere una risoluzione di 10-20 nm, possono essereapplicate 33.
Qui, descriviamo l'analisi della co-localizzazione delle proteine bersaglio con marcatori sinaptici nei neuroni primari. Il protocollo può essere applicato a qualsiasi coltura primaria di cellule neuronali, come ippocampo, cerebellare o neuroni corticali e anche a colture di neuroni primari che non appartengono al sistema nervoso centrale, come i neuroni del sistema nervoso enterico. La chiave dell'analisi a livello di super-risoluzione, tuttavia, sono i reagenti utilizzati durante l'acquisizione, come le coperture camerate e le soluzioni di montaggio compatibili con l'indice di diffrazione dell'obiettivo. Abbiamo usato copriseffi camerati per la loro facilità d'uso, ma il metodo classico e più economico di crescita dei neuroni primari su vetro di copertura rivestito è comunque valido, in particolare con un bicchiere da copertura #1,5H (0,17 mm) di alta precisione. Inoltre, è necessario utilizzare un supporto di montaggio in grado di raggiungere un indice di rifrazione il più vicino possibile all'indice di rifrazione del vetro (1,52) e un olio di immersione per l'obiettivo 100x con un indice di rifrazione di 1,515. Anche la temperatura ambiente costante e i tavoli stabilizzati sono obbligatori per garantire l'accuratezza delle acquisizioni.
Usiamo sia anticorpi secondari dyLight che Alexa negli studi SIM. A causa dei loro picchi stretti di eccitazione ed emissione e di buona resa quantistica, sono indicati per tecniche di super-risoluzione che richiedono il miglior rapporto segnale/rumore. Dempsey et al. ha confrontato Alexa, dyLight e altri fluorofori per l'imaging asuper-risoluzione 34.
Durante l'acquisizione, abbiamo regolarmente impostato la fotocamera a 1 MHz su 10 MHz. 1 MHz, grazie a una velocità di acquisizione più lenta, dà alle immagini più precisione e meno rumore di 10 MHz. 1 modalità di lettura MHz può anche registrare con una profondità di bit di 16 bit (rispetto al massimo 14 bit di 10 MHz), dando più informazioni di colore e un gradiente di colore più preciso per le immagini. Tuttavia, 10 MHz, con la sua velocità, è utile per le immagini dal vivo. Per evitare lo sbiancamento e preservare il fluoroforo, abbiamo anche impostato la potenza laser il più basso possibile. Per migliorare l'intensità del segnale, i valori di guadagno possono essere aumentati. Vale la pena notare che il guadagno più basso garantisce immagini più pulite senza migliorare il rumore. In generale, si ottengono i migliori risultati mentre l'imaging è compreso tra 7 e 7 m dal fondo del coperture camerate. Ciò è particolarmente importante quando si utilizza un obiettivo 100x con immersione dell'olio. Se è necessaria un'acquisizione più profonda tra le cellule / tessuti, una scelta migliore può essere l'uso di un obiettivo 60x con immersione in acqua.
Una delle principali sfide nell'esecuzione di studi SIM è la ricostruzionedell'immagine 35. Ottenere immagini super-risolte senza artefatti e aberrazione richiede non solo l'uso di condizioni sperimentali ad hoc, ma anche un'attenta calibrazione del sistema e l'ottimizzazione dei parametri per ottenere le immagini finali. Nel protocollo, descriviamo come evitare alcuni degli errori più comuni valutando la calibrazione del sistema e l'analisi della qualità delle immagini grezze e ricostruite. In particolare, descriviamo l'uso dei plugin ImageJ SIMCheck e NanoJ-SQUIRREL per assicurare le impostazioni corrette dello strumento per prevenire artefatti comuni di immagini super-risolte. Le applicazioni consentono una valutazione imparziale della qualità delle immagini finali che non si basa sul benchmarking soggettivo dei risultati rispetto alla conoscenza preventiva delle strutture di studio.
Si consiglia di utilizzare sinaptofisin e PSD95 o drebrin come marcatori pre e post-sinaptici, anche se altri marcatori sono validi pure. Un enorme corpo di letteratura descrive proteine come il fagotto come marcatori sinaptici36,37. Vale la pena notare che i marcatori pre- e post-sinaptici sono comunque presenti in tutta la cellula, escludendo il nucleo. Gran parte del loro segnale è non sinaptico, ma rappresenta proteine nel trasporto o nella degradazione, sfondo o altri artefatti. È quindi importante scegliere con attenzione l'area dell'analisi. Usiamo il segnale anticorpale MAP2 per scegliere terminali assone e dendritici.
Nell'analisi della co-localizzazione usiamo due approcci. Il primo è un approccio visivo, basato sull'analisi del profilo che mostra singoli eventi di co-localizzazione e identifica il contributo di ogni canale. Un avvertimento di questo approccio, tuttavia, è la scarsa potenza statistica. Per questo motivo, abbiamo deciso anche di utilizzare un secondo metodo basato sull'analisi di un maggior numero di eventi rappresentativi dell'intero campo di ogni immagine. Questo metodo si basa sul calcolo del coefficiente di correlazione di Pearson e dei coefficienti M1 e M2 di Mander. Usiamo il coefficiente di correlazione di Pearson per descrivere la sovrapposizione dei segnali nell'immagine e M1 e M2 di Mander per descrivere la co-localizzazione reciproca tra i segnali di interesse38. Per il calcolo, impieghiamo il plugin ImageJ JACoP, dal momento che ha una funzione che consente di impostare una soglia manuale per scartare qualsiasi contributo di sfondo all'analisi, particolarmente critica per l'analisi di Mander.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Edoardo Micotti per la critica costruttiva del manoscritto. Lo studio è stato sostenuto da BrightFocus A2019296F, di Fondo di Beneficenza - Gruppo Intesa Sanpaolo (LC), di Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (Care4NeuroRare CP_20/2018) (CN) e della Rete di Formazione Innovativa Marie skadorwska-Curie (JK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Chemical |
| 70 µm filter | Corning | 352350 | Equiment |
| Alexa | Thermo Fisher Scientific | - | Antibody |
| Antibody SENP1 | Santa Cruz | sc-271360 | Antibody |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | Chemical |
| Bovine serum albumin | Merck | 5470 | Chemical |
| CaCl2 | Merck Life Science | 21115 | Chemical |
| Chambered coverslips | Ibidi | 80826 | Equiment |
| DyLight | Thermo Fisher Scientific | - | Antibody |
| FBS (Hyclone) | GIBCO | SH3007002 (CHA1111L) | Serum |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow–green fluorescent | Thermo Fisher Scientific | F8803 | Equiment |
| Glucose | Merck Life Science | G8769 | Chemical |
| Glutamax | GIBCO | 35050061 | Chemical |
| HEPES | Merck Life Science | H3537 | Chemical |
| L-Cystein | Merck Life Science | C6852-25g | Chemical |
| MAP2 | Merck | AB15452 | Antibody |
| MEM | Life Technologies | 21575022 | Medium |
| MgCl | Merck Life Science | M8266 | Chemical |
| NaOH | VWR International | 1,091,371,000 | Chemical |
| Neurobasal A | Life Technologies | 10888022 | Medium |
| N-SIM Super Resolution Microscope | Nikon | - | Instrument |
| Papain | Merck Life Science | P-3125 | Chemical |
| paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Chemical |
| Pen/Strep 10x | Life Technologies | 15140122 | Chemical |
| phosphate-buffered saline | Gibco | 10010023 | Chemical |
| Poly-L lysine | Sigma | P2636 | Chemical |
| ProLong Diamond Glass Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36970 | Chemical |
| PSD95 | NeuroMab | K28/43 | Antibody |
| Round coverglass | Thermo | 12052712 | Equiment |
| SUMO1 | Abcam | ab32058 | Antibody |
| Synaptophysin | Merck | S5768 | Antibody |
| Triton X-100 | Merck | T8787 | Chemical |
| Trypsin inhibitor | Merck Life Science | T9003-500MG | Chemical |
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