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JoVE Journal Genetics
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Genetics

Uma tela supressora para a caracterização de links genéticos regulando a vida cronológica em Saccharomyces cerevisiae

Published: September 17, 2020 doi: 10.3791/61506
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biology, William Paterson University

Summary

Aqui está um protocolo para identificar interações genéticas através de uma tela supressora de número de cópia aumentada em Saccharomyces cerevisiae. Este método permite que os pesquisadores identifiquem, clonem e testem supressores em mutantes de levedura de curta duração. Testamos o efeito do aumento do número de cópias de SIR2 na vida útil em um mutante nulo autofagia.

Abstract

O envelhecimento é o tempo dependente da deterioração dos processos biológicos normais de um organismo que aumenta a probabilidade de morte. Muitos fatores genéticos contribuem para alterações no processo normal de envelhecimento. Esses fatores se cruzam de forma complexa, como evidenciado pela riqueza de elos documentados identificados e conservados em muitos organismos. A maioria desses estudos se concentra na perda de função, mutantes nulos que permitem a triagem rápida de muitos genes simultaneamente. Há muito menos trabalho que se concentra em caracterizar o papel que a superexpressão de um gene nesse processo. No presente trabalho, apresentamos uma metodologia simples para identificar e clonar genes na levedura brotante, Saccharomyces cerevisiae, para estudo em supressão do fenótipo cronológico de vida curta visto em muitas origens genéticas. Este protocolo foi projetado para ser acessível a pesquisadores de uma ampla variedade de origens e em vários estágios acadêmicos. O gene SIR2, que codifica uma deacetilase histone, foi selecionado para clonagem no vetor pRS315, pois houve relatos conflitantes sobre seu efeito sobre a vida cronológica. O SIR2 também desempenha um papel na autofagia, que resulta quando interrompida através da exclusão de vários genes, incluindo o fator de transcrição ATG1. Como prova de princípio, clonamos o gene SIR2 para realizar uma tela supressora no fenótipo de vida encurtado característico do mutante atg1Δ deficiente da autofagia e compará-lo com um fundo genético isogênico e selvagem.

Introduction

O envelhecimento é a perda de integridade dependente do tempo em uma miríade de processos biológicos que, em última análise, aumenta a probabilidade de morte organismoal. O envelhecimento é quase inevitável para todas as espécies. Em nível celular, existem várias marcas bem caracterizadas que estão associadas ao envelhecimento, incluindo: instabilidade genômica, alterações epigenéticas, perda de proteostase, disfunção mitocondrial, sensoriamento de nutrientes desregulamentado, senescência celular e atrito de telômero1,,2. Em organismos unicelulares, como as leveduras, isso leva a uma redução do potencial replicativo e da vida cronológica3,4. Essas alterações celulares se manifestam em organismos mais complexos, como humanos, como patologias que incluem cânceres, insuficiência cardíaca, neurodegeneração, diabetes e osteoporose5,,6,7. Apesar das muitas complexidades que caracterizam o processo de envelhecimento, há a conservação dessas marcas moleculares subjacentes a esse processo em organismos amplamente divergentes8,,9,,10. A identificação dessas vias durante o envelhecimento levou à percepção de que elas podem ser manipuladas através de mudanças no estilo de vida – a restrição alimentar é demonstrada para prolongar substancialmente a vida útil em muitos organismos11. Esses caminhos convergem e se cruzam entre si e muitos outros caminhos, de formas complexas. A elucidação e caracterização dessas interações oferece potencial para intervenções terapêuticas para prolongar a vida útil e a vida saudável12,,13,,14.

A conservação dos fundamentos moleculares do envelhecimento permite a dissecção funcional das interações genéticas subjacentes ao processo através do uso de organismos modelos mais simples – inclusive na levedura brotante, Saccharomyces cerevisiae15,16. Existem dois tipos estabelecidos de envelhecimento modelado por levedura brotante: envelhecimento cronológico (a vida cronológica, CLS) e envelhecimento replicativo (a vida útil replicativa, RLS)17. O envelhecimento cronológico mede a quantidade de tempo que uma célula pode sobreviver em um estado não-divisória. Isso é análogo ao envelhecimento que é visto em células que passam a maior parte de sua vida em G0,como os neurônios4. Alternativamente, a vida útil replicativa é o número de vezes que uma célula pode se dividir antes da exaustão e é um modelo para tipos de células mitoticamente ativas (por exemplo, o número de células filhas que uma célula pode ter)18.

O objetivo geral deste método é apresentar um protocolo que permita a dissecção funcional da genética do envelhecimento utilizando S. cerevisiae. Embora tenha havido muitos estudos excelentes realizados por muitos pesquisadores que levaram ao nosso entendimento atual, ainda há muitas oportunidades disponíveis para os pesquisadores contribuirem para o campo do envelhecimento desde o início de sua carreira acadêmica. Apresentamos uma metodologia clara que permitirá aos pesquisadores avançar ainda mais no campo do envelhecimento. Este protocolo foi projetado para ser acessível para todos os pesquisadores, independentemente do estágio em sua carreira acadêmica, fornecendo as ferramentas necessárias para formular e testar suas próprias hipóteses novas. A vantagem de nossa abordagem é que este é um método econômico facilmente acessível a todos os pesquisadores independentemente da instituição – e não requer equipamentos caros e especializados necessários para alguns protocolos19. Existem várias maneiras diferentes de projetar este tipo de tela, a abordagem descrita neste trabalho é particularmente favorável à triagem de mutantes nulos de genes não essenciais que exibem uma redução severa na vida cronológica em comparação com uma cepa isogênica de levedura selvagem.

Como prova de princípio, clonamos o SIR2, uma deacetylase de liseina relatada como exibindo um CLS estendido e encurtado quando superexpresso. A superexpressão SIR2 foi recentemente encontrada para aumentar o CLS em leveduras vinícolas; no entanto, vários grupos não relataram nenhuma ligação entre a extensão SIR2 e a CLS, deixando seu papel sob caracterizado20,21,22. Devido a esses relatos conflitantes na literatura, selecionamos este gene para adicionar pesquisas independentes para ajudar a esclarecer o papel do SIR2 no envelhecimento cronológico, se houver. Além disso, aumentar o número de cópias de um homólogo SIR2 estende a vida útil em um sistema modelo de verme de nematoides23.

A autofagia é um sistema de degradação intracelular para fornecer produtos citolíticos, como proteínas e organelas, ao lyssomsome24. A autofagia está intimamente ligada à longevidade através de seu papel na degradação de proteínas e organelas danificadas para manter a homeostase celular25. A indução da autofagia depende da orquestração da expressão de muitos genes, e a exclusão do gene ATG1 resulta em um CLS anormalmente curto na levedurabrotante 26. Códigos ATG1 para uma proteína serina/threonina quinase necessária para a formação de vesículas em autofagia e a via citoplasma-para-vacuole (o equivalente fúngico lysosômico)27,28. Aqui, apresentamos nosso método para uma tela de número de cópia aumentada, testando o efeito do aumento da cópia SIR2 no CLS em um tipo selvagem e um fundo atg1-nulo. Esse método é particularmente favorável a pesquisadores juniores e grupos de pesquisa em instituições de graduação, muitas das quais atendem comunidades sub-representadas nas ciências e têm recursos limitados.

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Protocol

1. Identifique interações genéticas potenciais para triagem

  1. Identifique o histórico genético para caracterização, que resulta em uma vida cronológica anormalmente curta (CLS) em Saccharomyces cerevisiae usando o Banco de Dados do Genoma de Saccharomyces (o SGD, https://www.yeastgenome.org29,,30), que compila informações fenotípicas conhecidas para este organismo.
    1. Selecione a guia Função nas opções na parte superior da página web.
    2. Selecione o Fenótipo seguido pela seleção de Procurar todos os Fenótipos.
    3. Desde as opções de ontologia do fenótipo de levedura rolem até a subposição de desenvolvimento e selecione a vida cronológica,encontrada sob a subposição lifespan.
    4. Selecione o qualificador para diminuído,o que permite a identificação de genes que exibem um fenótipo que resulta em um fenótipo cronológico reduzido quando excluído. Para este atg1Δ de prova de método foi selecionado, o que resulta em um fenótipo cls de curta duração e é interrompido para autofagia26.
  2. Identificar genees de destino para rastrear interações genéticas que possam suprimir o fenótipo, com base em atributos de ontologia relatados ou previstos, do mutante identificado na parte 1.2. Repita a pesquisa de fenótipo encontrada nas etapas 1.1.1-1.1.4 acima, consultando genes que resultam em um CLS mais longo quando superexpresso em um fundo tipo selvagem. O SIR2 foi selecionado com base no fenótipo cls relatado e relatou interações com a autofagia31,32.

2. Prepare os reagentes

NOTA: A menos que seja especificado de outra forma, autoclave cada solução a 121 °C por 20 minutos para esterilizar antes de ser usada.

  1. Mídia líquida YPAD: Adicione 1% extrato de levedura, 2% Peptone, 2% Dextrose (glicose) e 40 mg de adenina (como sulfato de adenina desidratado) por litro de água dupla destilada. Misture bem com um agitador magnético.
  2. Mídia líquida LB: Adicione Triptona (10 g), extrato de levedura (5 g) e cloreto de sódio (10 g) por litro de água dupla destilada. Misture bem com um agitador magnético.
  3. Prepare 1000x (100 mg/mL) de ampicillin, em água dupla destilada. Misture bem e o filtro se esterilize.
  4. Completo sintético – Mídia líquida leucina (SC-LEU): Adicione 1,7 g de base de nitrogênio de levedura c/o aminoácidos, 2% glicose, 1,92 g de mistura de gota SC-LEU, 5 g de sulfato de amônio por litro de água dupla destilada. Misture bem com um agitador magnético.
  5. Tampão te: Mix Tris (concentração final de 10 mM), EDTA (concentração final de 1 mM) na solução com água dupla destilada. Misture bem com um agitador magnético.
  6. Prepare 50% PEG 3350 em solução com dupla água destilada. Misture bem com um agitador magnético.
  7. Prepare a solução de acetato de lítio de 1 M e 100 mM com água destilada dupla. Misture bem com um agitador magnético.
    NOTA: Para fazer placas de ágar sólidos adicione 20 g de ágar (por litro com água dupla destilada) à mídia preparada em 2,1 e 2,2 acima antes da autoclavagem. Se preparar as placas de ampicillina adicione 1mL da ampicilina à mídia em 2,2 acima depois de ter esfriado para cerca de 60 °C. Despeje em placas estéreis e deixe fixar por 48-72 h antes de usar. Armazene as placas a 4 °C para um armazenamento mais longo.

3. Projete a estratégia de clonagem para clonar SIR2 no vetor pRS315

  1. Projete primers PCR para amplificar o gene SIR2 para clonagem no vetor pRS315.
    1. Projete primers manualmente para ter complementaridade nucleotídeo de 21 a 22 para as regiões intergênicas rio acima e rio abaixo do SIR2. Certifique-se de que todo o gene, juntamente com as regiões não traduzidas do mRNA, seja clonado mapeando esses recursos a partir dos conjuntos de dados disponíveis33,34.
    2. Certifique-se de que o design da cartilha PCR resulte em primers dianteiros e invertidos que tenham uma temperatura de fusão (Tm) acima de 53 °C e abaixo de 60 °C.
      NOTA: Idealmente, ambos os primers devem ter um Tm tão próximo um do outro quanto a sequência permitirá, com um conteúdo GC aproximado entre 40-50%, certificando-se de evitar repetições de dinucleotídeos e equilibrando a distribuição GC e AT durante toda a sequência.
    3. Após o desenho dos primers PCR que permitirão a geração do amplicon para clonagem, adicione os locais de destino de digestão da enzima de restrição (R.E.D.) até a extremidade de 5' de cada primer compatível com o vetor de clonagem de plasmídeos. Neste método, um local de digestão enzimática de restrição hindiII (5'-AAGCTT-3') é adicionado ao primer upstream, forward e um local de digestão da enzima de restrição SacII (5'-CCGCGG-3') é adicionado ao primer downstream, reverso.
      NOTA: O uso dos locais SacII e HindIII exige que o local de corte de consenso para cada endonuclease não esteja presente no gene alvo. Se qualquer enzima atingir alvos dentro do gene alvo, enzimas alternativas de restrição devem ser escolhidas. Há muitos que são compatíveis com a região do polilinker no vetor pRS315.
    4. Por último, adicione uma sequência de quatro nucleotídeos (5'-NNNN-3') ao final de 5' de cada primer para permitir que a enzima de restrição se ligue e digerir o amplicon. Uma vez que os primers tenham sido projetados, tenha os oligonucleotídeos comercialmente sintetizados para usar a clonagem do gene SIR2.
    5. Resuspensão dos primers PCR: Centrifugar os primers PCR usando um microfuge de mesa em velocidade máxima por 4 minutos. Adicione a solução TE para fazer uma concentração de estoque de 100 μM. Armazene a concentração de estoque a -20 °C e dilua 1/10 para uso em aplicações PCR.
      NOTA: Para fazer um estoque de 100 μM, dissolva os primers em um volume de tampão te estéril que é de 10x a quantidade de nmoles no tubo primer, utilizando microlitros de TE. Por exemplo, se o tubo contiver 15,6 nmoles de primer, adicione 156 μL de tampão TE.
  2. Isole gDNA de levedura silvestre para amplificação pcr da construção de clonagem SIR2.
    NOTA: Várias opções de alta qualidade estão disponíveis comercialmente para isolar o gDNA de levedura. A utilização de um kit que inclui a digestão da parede celular fúngica com zymolyase resulta em gDNA de melhor qualidade (maior rendimento, menos impurezas). O protocolo abaixo retorna consistentemente alta concentração e pureza. Detalhes de um kit que recomendamos podem ser encontrados na Tabela de Materiais.
    1. Cresça 5 mL de levedura tipo selvagem por 48-72 h para a fase pós-log em mídia enriquecida, como YPAD. Pelota as células de levedura em >800 x g por 3 min à temperatura ambiente, remova a mídia de crescimento e resuspenda em 120 μL de tampão de digestão zymolyase suplementado com 5 μL de zymolyase (2 unidades enzima/μL). Misture a amostra por vórtice e incubar a 37 °C por 40 min.
    2. Adicione 120 μL de um tampão de lise chaotrópico (por exemplo, cloreto de guanidinium), 250 μL de clorofórmio e vórtice da amostra para 60 s.
    3. Centrifugar a >8.000 x g por 2 min e transferir o supernante para uma coluna de purificação em um tubo de coleta estéril.
    4. Centrifugar a >8.000 x g para 60 s e descartar o fluxo através. O gDNA será vinculado à matriz da coluna.
    5. Lave a coluna duas vezes com 300 μL de um tampão de lavagem à base de etanol, repetindo o passo de centrifugação de cima (3,2,4). Descarte o fluxo após cada giro. Transfira a coluna para um tubo de microfuça de 1,5 mL, adicione 60 μL de tampão de TE e incubar à temperatura ambiente por 60 s. Gire a amostra por 30 anos para elutar o DNA.
      NOTA: Determine a concentração do DNA na amostra (Absorvância a 260nm) e a qualidade (Absorvância 260nm/280nm). Um rendimento típico será de 100-200 ng/ μL de gDNA com taxa de absorvância em 260nm/280nm o mais próximo possível de 1,8.
  3. Amplie e isole o vetor pRS315 plasmídeo para clonagem.
    NOTA: Várias opções de alta qualidade estão disponíveis comercialmente para a purificação de vetores plasmídeos. Recomenda-se uma química de coluna à base de sílica para esta etapa. As mudanças observadas abaixo levaram à maior concentração e pureza. Os detalhes são encontrados na Tabela de Materiais.
    1. Cresça 5 mL de cultura de E. coli contendo o vetor pRS315 durante a noite em mídia lb+ ampicillin (80 μg/mL). Pelota a cultura por centrifugação a >8.000 x g por 2 min no RT (15-25 °C).
    2. Suspenda de forma re-suspender células bacterianas pelleted em 250 μL de tampão de TE com RNase A (100 μg/mL) e transferir para um tubo de microcentrifuuge. Certifique-se de que não restam aglomerados de células.
    3. Adicione 250 μL de tampão de lise e misture invertendo o tubo 6-8 vezes. Incubar por 5 minutos em temperatura ambiente. Não permita que a lise prossiga por mais de 5 min – um pouco menos é preferível.
    4. Adicione 350 μL de tampão de neutralização e misture imediatamente e completamente invertendo o tubo 10 vezes. Centrifugar por 10 min a >8.000 x g.
    5. Transfira cuidadosamente o supernatante de cima para uma coluna de giro de sílica por pipetação. Centrifugar por 30 s e descartar o fluxo.
    6. Adicione 500 μL de um tampão de lavagem de sal alto e centrífuga como na etapa 3.3.5. Descarte o fluxo. Lave a coluna de giro de ligação de DNA adicionando 750 μL de um tampão de lavagem à base de etanol, para remover sais residuais e centrífuga como na etapa 3.3.5.
    7. Descarte o fluxo através e centrífuga por um adicional de 2 min a >8.000 x g para remover o tampão de lavagem residual. Coloque a coluna de giro em um tubo de microcentrifuge limpo e rotulado de 1,5 mL. Ao DNA elute, adicione 20 μL de tampão te ao centro da coluna de giro, incubar por 1 min em temperatura ambiente e centrífuga por 1 min a >8.000 x g.
    8. Use um espectrofotômetro para determinar a quantidade (Absorvância a 260nm) e a qualidade (Absorvância 260 nm/280 nm) de DNA. Um rendimento típico será de 1-2 μg/μL.
  4. Amplificação PCR do gene candidato, SIR2, de DNA genômico tipo selvagem
    1. Para produzir um amplicon adequado para clonagem, utilize uma polimerase PCR de alta fidelidade (HF) para evitar que a geração não intencional de mutações na sequência seja amplificada.
      NOTA: Muitas opções diferentes de PCR de alta fidelidade estão disponíveis comercialmente. Para facilitar a otimização das condições de reação do PCR, use uma combinação de dois buffers: uma que seja um buffer HF padrão e uma otimizada para alta GC e amplicons complexos. Os detalhes podem ser encontrados na Tabela de Materiais.
    2. O PCR amplifica a construção SIR2 para clonagem conforme descrito na Tabela 1.
      NOTA: Para maximizar o sucesso nas etapas de clonagem, vários 50 μL idênticos podem ser configuradas e concentradas por um passo de limpeza da coluna PCR. Certifique-se de configurar uma reação de controle de modelo gDNA (controle negativo).
    3. Configure as condições de ciclismo PCR conforme descrito na Tabela 2.
      NOTA: Diferentes pares de primer variam em sua temperatura de ressarção e diferentes polímeros funcionam em velocidades diferentes. Certifique-se de otimizar as condições de amplificação com base na enzima selecionada e nas especificações da combinação de primer conforme projetado.
    4. Verifique o sucesso da reação do PCR visualizando a reação pcr, que produziria aproximadamente 2,5 kb de fragmento de DNA, em um gel tae-agarose de 1,0% (com brometo de etídio de 0,5 μg/mL para visualização).
  5. Digestão e ligadura do gene candidato, SIR2,no vetor pRS315 plasmid.
    1. Realizar a digestão de restrição do vetor e da inserção: 625 ng DNA (seja o vetor ou inserção), água q.s. para trazer o volume de reação final para 50 μL, 5 μL de tampão, 1 μL SacII e 1 μL HindIII. Incubar as digestões de restrição a 37 °C por 3h, seguido de 80 °C por 20 minutos para aquecer inativar as enzimas. Os digestos podem ser armazenados a 4 °C antes de prosseguir para a próxima etapa.
    2. Configure uma reação de ligadura de 15 μL para criar o plasmídeo desejado: 6 μL de água estéril, 2 μL de vetor digerido de 2 μL (50 ng DNA), inserção digerida de 4 μL (100 ng DNA), tampão de reação T4 2 μL e 1 μL de Ligase de DNA T4. Incubar as reações de ligadura durante a noite a 16 °C, seguido de 80 °C por 20 minutos para aquecer a enzima.
      NOTA: Configure um controle sem inserção, substituindo um adicional de 4 μL de água estéril (10 μL total) em vez da inserção.
    3. Transforme as reações de ligadura em E. coli.
      NOTA: Existem muitas opções disponíveis para células competentes que estão disponíveis. Este protocolo utiliza células quimicamente competentes que são armazenadas a -80 °C antes do uso.
      1. Descongele um tubo de 50 μL de células E. coli congeladas e competentes no gelo até descongelar e adicionar imediatamente 15 μL da reação de ligadura. Aperte o tubo várias vezes. Devolva imediatamente os tubos ao gelo e incubar por 30 minutos.
      2. Choque térmico das células por 20 s em um banho de água exatamente a 42 °C, e imediatamente retornar os tubos ao gelo para uma incubação de 2 minutos. Adicione 450 μL de mídia de recuperação de temperatura ambiente (por exemplo, SOC ou LB) a cada reação de transformação e incubar por 60 min a 37 °C com agitação.
      3. Para cada reação de transformação, faça uma diluição de 1:10 das células. Utilizando técnica estéril, placa 150 μL das células não diluídas e as diluições de 1:10 em placas de ampicillina LB + (80 μg/mL)35. Incubar as placas a 37 °C durante a noite.
  6. Screen potenciais transformadores para o vetor de sobreexpressão.
    1. Usando técnica estéril, inocular os potenciais transformadores que cresceram em 5 mL LB + (80 μg/mL) ampicillin e crescer durante a noite. Seguindo o procedimento descrito na seção 3.3.1-3.3.7 acima, isole os plasmídeos de todos os potenciais transformadores e tela para uma integração bem sucedida da inserção por digestão de restrição seguida de eletroforese de gel em um gel tae-agarose de 1,0% (com brometo de ethidium de 0,5 μg/mL para visualização).

4. Transforme o vetor em atg1Δ e cepas de levedura tipo selvagem

NOTA: Isto é realizado utilizando um protocolo modificado de transformação de acetato de lítio36.

  1. Pelota 15 mL de tipo selvagem e células de levedura atg1-nulas cultivadas durante a noite em mídia YPAD para fase inicial a mid-log (O.D. 600nm = 0,4-0,9) de crescimento por 3 min a > 800 x g à temperatura ambiente.
  2. Decante o supernascer, suspenda a pelota celular em 1 mL de ddH2O estéril e transfira o conteúdo para um tubo de microfuça de 1,7 mL. Pelota as células por 3 min a > 800 x g em temperatura ambiente.
  3. Remova o supernasce e suspenda as células em 250 μL de acetato de lítio de 100 mM com tubulação suave. Divida as células em tubos de microfuge separados para cada uma das transformações que você realizará. Use 50 μL da mistura de acetato celular-lítio por transformação.
  4. Criar uma mistura de transformação. Para cada uma das transformações somam-se: 240 μL de 50% PEG3350, 36 μL de acetato de lítio de 1,0 M e 5 μL de DNA de esperma de salmão (ou outro portador), fervido por 5 min e no gelo.
    NOTA: PEG é muito viscoso. Pipeta e meça cuidadosamente. Misture por pipetação após a adição de cada componente antes de seguir em frente.
  5. Adicione 5 μL do plasmídeo apropriado para cada transformação realizada. Vórtice cada tubo para misturar bem. Incubar as amostras a 30 °C por 45 min. Amostras de choque térmico a 42 °C por 10 min.
  6. Células de pelotas por 3 min a > 800 x g à temperatura ambiente, removam cuidadosamente a mistura de transformação e suspendam cuidadosamente amostras em 300 μL de células estéreis ddH2O. Repetindo o giro acima, remova cuidadosamente a água e suspenda suas amostras em 200 μL de ddH2O estéril.
  7. Configure 1/10 e 1/100 diluições para cada cepa transformada de levedura.
  8. Utilizando placa técnica estéril 150 μL de cada amostra em placas sc-leucina para selecionar para os plasmídeos. Espalhe as células uniformemente e uniformemente e deixe a placa secar antes de inverter e incubar a 30 °C para crescer por 48-72 h.
    NOTA: Uma vez gerada a cepa apropriada, ela poderá ser armazenada a longo prazo em 25% de glicerol a -80 °C. A quantificação do número de cópia presente pode ser determinada por diversas metodologias, incluindo qPCR, RNA-FISH ou outra medida apropriada37,38.

5. Determine a vida útil cronológica para testar a supressão do fenótipo cls encurtado

  1. Teste o efeito da superexpressão do supressor putativo na CLS na levedura de curta duração, mutante atg1Δ, determinando o número de unidades formadoras de colônias (UFC) que permanecem em função do tempo39.
    NOTA: É necessário configurar esta parte do experimento com os controles apropriados. Um experimento típico irá comparar uma variedade de levedura tipo selvagem (WT) com o vetor vazio, WT com o vetor supressor, o mutante de exclusão com o vetor vazio, e o mutante de exclusão com o vetor supressor.
    1. Pegue uma única colônia da cepa para estudar e inocula-a na mídia SC-LEU. Cresça a cultura a 30 °C por 72 h, com agitação.
    2. Utilizando um hemócito, determine a concentração de células presentes na cultura40.
    3. Diluir uma alíquota da cultura, de modo que o resultado seja um número uniforme de células em um volume de 150 μL de água estéril. Emplaque a cultura usando técnica estéril em placas SC-LEU e cresça a 30 °C por 72 h. Essas placas são o terceiro ponto de tempo do dia e o experimento será normalizado até este ponto de tempo como 100% de viabilidade39.
      NOTA: O número de células deve ser de 200 a 500, suficientemente grande para a análise e um número gerenciável para contagem. Neste estudo, utilizamos 200 células para nossa quantidade de revestimento.
    4. Continue incubando as culturas de levedura a 30 °C, tomando alíquotas regulares e chapeamento como descrito em 5.1.3. Continue esse processo até que as cepas não sejam mais viáveis, depois compile e analise os resultados.
      NOTA: A lista completa de cepas utilizadas neste estudo está encontrada na Tabela 3.

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Representative Results

Como há relatos conflitantes sobre o papel do SIR2 durante o envelhecimento, escolhemos este gene para estudo como um potencial supressor do fenótipo CLS do mutante atg1Δ 26. O papel do SIR2 é um tanto controverso, com relatórios conflitantes sobre seu papel na extensão da CLS, porém tem sido claramente ligado ao aumento da CLS em pelo menos um fundo de levedura, com um papel tanto na autofagia quanto na mitofagia22,,31,,32,41.

Nossa escolha de vetor plasmídeo é o vetor pRS315, que foi construído para facilitar a manipulação genética, propagação e manutenção tanto na levedura brotante quanto na bactéria42. Este vetor contém o marcador nutricional LEU2, os promotores T7 e T3, e é um vetor centromeric (CEN)para passagem estável durante a divisãocelular 42. A estabilidade desse vetor entre as divisões de células mitóticas foi mais desejável quando comparada aos vetores isogênicos que diferem pelo marcador nutricional42. O vetor pRS315 também contém uma sequência de replicação autônoma, que combinada com o CEN mantém níveis baixos e consistentes de plasmídeos dentro (e em toda) uma população celular43.

O gene SIR2 e a sequência de DNA da região genômica de 5' UTR (5' UTR) foram obtidos33. Para garantir que o gene transcrito contivesse os componentes necessários para estabilidade e tradução do produto proteico, nossa janela inicial era de +/- 400 bp. Esta janela expandiu-se para +/- 500bp com base na composição nucleotídea dentro desta região, pois nossa janela inicial não resultou em uma região propícia para a clonagem. Projetamos primers PCR que permitem a amplificação do gene e regiões regulatórias correspondentes, incorporando locais de digestão de restrição e uma saliência de quatro nucleotídeos adicionadas ao final de 5' de cada primer(Figura 1A). A amplificação bem sucedida dessa região por PCR resulta em um fragmento de DNA de 2.469 kb de comprimento(Figura 1B).

O SIR2 foi amplificado por PCR, e os produtos dessa reação foram visualizados pela eletroforese do gel agarose e comparados a uma reação de controle sem modelo(Figura 2). A amplificação SIR2 foi vista em ambas as pistas com o modelo de DNA genômico; as duas reações foram agrupadas e concentradas. Foi realizada purificação plasmida de pRS315 de E. coli, que foram visualizadas pela eletroforese de gel de agarose(Figura 3). As amostras foram quantificadas por espectrofotometria, e a preparação plasmóide de #2 transformador foi selecionada para clonagem, que teve uma concentração de 256 ng/μL (OD260/280 = 1,87).

O plasmídeo e a inserção foram digeridos com hindiii e SacII, ligados juntos, e transformados em E. coli para amplificação e triagem. A escolha desses locais de digestão de restrição exigiu a verificação de que nenhum dos locais está presente na região a ser clonado. A presença de um (ou ambos) locais exigiria o uso de enzimas de restrição alternativa para clonar o gene SIR2, e há várias para selecionar na região pRS315 polylinker42.

Nós examinamos transformadores para criação bem sucedida do vetor pRS315-SIR2 por excisão da inserção por dupla digestão com HindIII e SacII seguido pela visualização em gel de agarose(Figura 4). o vetor pRS315-SIR2 foi transformado em tipo selvagem e mutante atg1Δ para gerar as cepas usadas para caracterização cls. O vetor pRS315 é um vetor clássico que tem sido amplamente utilizado e caracterizado, que é uma das vantagens deste sistema em particular. O número da cópia relativa foi determinado por qPCR (Figura 5)como descrito anteriormente37. Isso resultou em um aumento modesto no número de cópias de uma média de uma cópia por célula para uma média de 2,5 cópias por célula, consistente com relatórios anteriores42.

A vida útil cronológica de atg1Δ+pRS315-SIR2 foi comparada a uma cepa isogênica de levedura contendo um vetor vazio em vez de uma inserção (atg1Δ+pRS315). As culturas de envelhecimento foram banhadas em diluições consistentes e equivalentes e foram cultivadas por 72h a 30 °C antes da imagem e quantificação(Figura 6A). O número de colônias formando unidades que cresceram foi determinado e normalizado até o dia 3 ponto de tempo (o primeiro tomado) e traçado(Figura 6B). Informamos que não há efeito estatisticamente significativo da nossa construção SIR2 sobre o CLS no fundo atg1Δ. Além disso, não vimos nenhuma extensão do CLS no fundo do tipo selvagem – onde nossa modesta superexpressão SIR2 realmente produziu uma diminuição no CLS em comparação com o controle de vetor vazio(Figura 6B).

Figure 1
Figura 1: Projeto da construção para clonar SIR2. A região genômica que flanqueava o gene SIR2 foi utilizada para projetar primers PCR para amplificação e clonagem do gene. Os primers contêm 21nt de complementaridade à região 419 pares de base a montante do gene (FP) e 351 pares base a jusante do gene (RP), tanto o local de digestão de restrição hindiii ou sacii, e uma sobressidência de quatro nucleotídeos(A). O esquema do amplicon criado pelo PCR utilizando os primers projetados para clonagem da região gênica SIR2, juntamente com os tamanhos correspondentes(B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Amplificação pcr do gene SIR2 visualizado por eletroforese de gel. Os produtos de uma reação pcr de alta fidelidade para amplificar o gene SIR2 foram visualizados em um gel de 1% de agarose (com brometo de etídio). As reações duplicadas foram realizadas usando o gDNA de levedura como modelo (+) e comparado a um controle sem modelo (-). O tamanho esperado de amplicon é de 2.469 kb. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Visualização do vetor pRS315 por eletroforese de gel. Reações plasmóides purificadas duplicadas foram realizadas e visualizadas em um gel de 1% de agarose (com brometo de etídio). O tamanho do vetor pRS315 é de 6.018 kb. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Triagem para o vetor pRS315-SIR2 por eletroforese de gel. Os potenciais transformadores que contêm o vetor pRS315-SIR2 foram digeridos com hindiii e SacII, e depois visualizados em um gel de 1% de agarose (com brometo de etídio). A criação bem sucedida do vetor renderá uma banda a 5.963 kb (a espinha dorsal pRS315) e 2.461 kb (o gene SIR2). Dois potenciais transformadores foram comparados a um controle de vetores vazios. Transformante #1 exibe o padrão esperado pelo vetor pRS315-SIR2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: O vetor pRS315-SIR2 aumenta o número de cópia SIR2 em um fundo de levedura tipo selvagem. O número de cópias SIR2 presentes no fundo genético do tipo selvagem foi determinado por PCR quantitativo. Os valores foram calculados utilizando-se o método2 -ΔΔCt com ACT1 selecionado como controle interno44. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: A vida útil cronológica de atg1Δ+pRS315-SIR2. O CLS foi determinado pela quantificação do número de unidades formadoras de colônias viáveis em função do tempo. As culturas de envelhecimento da levedura foram diluídas para 500 células/placas e cultivadas por 72 h a 30 °C antes da imagem(A). Os dados foram normalizados até o terceiro dia e traçados para visualização (B). EV é vetor vazio (pRS315 sem inserção) e SIR2O/E contém a inserção (pRS315-SIR2). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Componente Concentração Final
Água sem nuclease Q.S. para volume final
Buffer 1X
dNTPs (conc: 10mM) 200uM
Primer forward (conc: 10μM) 0,5μM
Primer reverso (conc: 10μM) 0,5μM
Modelo gDNA 100-200ng
Polimerase HF 1 unidade/50μL PCR

Tabela 1: Componentes de reação do PCR.

Passo Temp Hora
Denaturação Inicial 98°C 2mins
Ciclismo 98°C 30 anos
(35 ciclos) 53-60°C (primer específico) 30 anos
72°C 30s por kB
Extensão Final 72°C 5-10m
Segurar 10°C Indefinidamente

Tabela 2: Condições de ciclismo PCR.

Tensão: Pai: Ploidy:
MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 + pRS315 (leu vetor) BY4741 Haploid
MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 + pRS315-SIR2 O/E (vetor LEU) BY4741 Haploid
MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0atg1Δ + pRS315 vetor vazio (vetor LEU) BY4741 Haploid
MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0atg1Δ + pRS315-SIR2 O/E (leu vetor) BY4741 Haploid

Tabela 3: Cepas utilizadas.

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Discussion

Desvendar a genética do envelhecimento é um desafio difícil, com muitas oportunidades para estudos mais aprofundado que podem potencialmente produzir insights significativos sobre as interações complexas que existem. Existem muitos métodos que permitem a rápida geração de mutantes de perda de função para o estudo de cepas nulas de levedura45,46. Este método apresenta uma abordagem simples para identificar e clonar genes no vetor pRS315 para estudos supressores de superexpressão. Uma vantagem dessa abordagem é que isso permite uma superexpressão moderada de um vetor estável, o que pode evitar quaisquer desafios imprevistos que possam surgir do uso de uma integração cromossômica47. Essa abordagem é apresentada de forma a incentivar o recrutamento de pesquisadores em diversos níveis de sua carreira científica, com muitos dos autores desta publicação contribuindo com a identificação e clonagem de supressores putativos como componente de sua formação.

Neste trabalho, demonstramos como usar a riqueza de dados disponíveis no banco de dados do genoma de Saccharomyces para identificar um fenótipo desejado, neste caso ligações genéticas a uma vida cronológica alterada. Clonamos SIR2 no vetor pRS315 para testar o efeito da superexpressão moderada no CLS do mutante deficiente de autofagia de curta duração, atg1Δ. Ao longo de um curso de tempo de envelhecimento de 17 dias não houve efeito no CLS no mutante da autofagia e um CLS mais acelerado visto no fundo do tipo selvagem. Isso pode ser interpretado como o modesto número de cópias aumento em SIR2 não tem um efeito sobre CLS no fundo mutante atg1Δ. Como o ATG1 é um fator de transcrição necessário para induzir a autofagia, nossas conclusões estão limitadas ao início da via autofagia. Além disso, não vemos um aumento do CLS em nosso fundo genético de tipo selvagem – talvez sugerindo que cls estendendo fenótipos de aumentar o número de cópias de SIR2 pode ser específico para certos antecedentes genéticos e não são onipresentes.

As etapas críticas dentro deste protocolo incluem o design adequado da construção SIR2 para clonar, e as condições adequadas para otimizar a ligadura. A solução de problemas dessas etapas pode ser necessária para clonar um gene para caracterização através do ensaio CLS. Uma limitação dessa abordagem é que ela seleciona para células que retêm o plasmídeo e que podem reentrar no ciclo celular. Embora este seja um marcador de aptidão, é essencial para o acompanhamento do estudo utilizando abordagens complementares para dissecar o fenótipo do envelhecimento. Isso pode incluir a quantificação da viabilidade celular por manchas de corante vitais, bem como abordagens que não dependem da retenção plasmida. Existem excelentes métodos disponíveis demonstrando maior caracterização do CLS através da quantificação do crescimento das células envelhecidas ou caracterização da vida replicativa48,,49,,50. Além disso, nossa abordagem está limitada à identificação de interações que não são letais, e seria desafiador diferenciar uma tentativa fracassada de clonar um gene com uma tentativa bem sucedida de clonar um gene que resulta em um fenótipo letal.

Nossa abordagem é útil para a identificação de interações genéticas putativas genéticas genéticas genéticas genéticas genéticas para estudos posteriores. É simples e simples, e até agora, usamos essa abordagem para clonar SIR2, AIF1, UBI4e MDH1 e estamos em processo de acompanhamento de estudos com cada uma dessas construções. Esta técnica pode ser aplicada para caracterizar qualquer número de interações genéticas seguindo o esboço do protocolo neste trabalho.

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Disclosures

Os autores declaram que não há conflito de interesses.

Acknowledgments

James T. Arnone gostaria de reconhecer o apoio dos alunos do curso recombinante de TECNOLOGIAS DE DNA em 2017 e 2018 na Universidade William Paterson que estavam envolvidos neste projeto desde o seu início, mas cujos esforços não cruzaram o limiar da autoria: Christopher Andino, Juan Botero, Josephine Bozan, Brenda Calalpa, Brenda Cubas, Headtlove Essel Dadzie, Irvinrra, Precious , Wayne Ko, Nelson Mejia, Hector Mottola, Rabya Naz, Abdullah Odeh, Pearl Paguntalan, Daniel Raza'e, Gabriella Rector, Aida Shono e Matthew So. Vocês são grandes cientistas e sinto falta de todos vocês!

Os autores gostariam de reconhecer o apoio inestimável da Tecnologia de Instrução e Pesquisa na Universidade William Paterson por sua ajuda: Greg Mattison, Peter Cannarozzi, Rob Meyer, Dante Portella e Henry Heinitsh. Os autores também gostariam de reconhecer o Escritório do Reitor de Apoio à ART, o Escritório do Reitor e o Centro de Pesquisa da Faculdade de Ciência e Saúde apoiando este trabalho, e o Departamento de Biologia para apoiar este projeto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fungal/Bacterial DNA kit Zymo Research D6005
HindIIIHF enzyme New England Biolabs R3104S
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0530S
Plasmid miniprep kit Qiagen 12123
SacII enzyme New England Biolabs R0157S
Salmon sperm DNA Thermofisher AM9680
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202S

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Uma tela supressora para a caracterização de links genéticos regulando a vida cronológica em <em>Saccharomyces cerevisiae</em>
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Dix, C., Sgro, S., Patel, A., Perrotta, C., Eldabagh, N., Lomauro, K. L., Miguez, F. W., Chohan, P., Jariwala, C., Arnone, J. T. A Suppressor Screen for the Characterization of Genetic Links Regulating Chronological Lifespan in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (163), e61506, doi:10.3791/61506 (2020).

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