Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Un écran suppresseur pour la caractérisation des liens génétiques régulant la durée de vie chronologique dans Saccharomyces cerevisiae

Published: September 17, 2020 doi: 10.3791/61506
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biology, William Paterson University

Summary

Voici un protocole pour identifier les interactions génétiques grâce à un écran suppresseur de nombre de copie accru dans Saccharomyces cerevisiae. Cette méthode permet aux chercheurs d’identifier, cloner et tester les suppresseurs chez les mutants de levure de courte durée. Nous testons l’effet de l’augmentation du nombre de copie de SIR2 sur la durée de vie dans un mutant null autophagie.

Abstract

Le vieillissement est la détérioration dépendante du temps des processus biologiques normaux d’un organisme qui augmente la probabilité de décès. De nombreux facteurs génétiques contribuent à des altérations du processus normal de vieillissement. Ces facteurs se croisent de façon complexe, comme en témoigne la richesse des liens documentés identifiés et conservés chez de nombreux organismes. La plupart de ces études se concentrent sur la perte de fonction, mutants null qui permettent un dépistage rapide de nombreux gènes simultanément. Il ya beaucoup moins de travail qui se concentre sur la caractérisation du rôle que la surexpression d’un gène dans ce processus. Dans le présent travail, nous présentons une méthodologie simple pour identifier et cloner des gènes dans la levure en herbe, Saccharomyces cerevisiae, pour l’étude dans la suppression du phénotype chronologique de durée de vie de courte durée vu dans beaucoup de milieux génétiques. Ce protocole est conçu pour être accessible aux chercheurs d’horizons variés et à divers stades universitaires. Le gène SIR2, qui code pour un daitone deacetylase, a été sélectionné pour le clonage dans le vecteur pRS315, car il ya eu des rapports contradictoires sur son effet sur la durée de vie chronologique. SIR2 joue également un rôle dans l’autophagie, qui résulte lorsqu’il est perturbé par la suppression de plusieurs gènes, y compris le facteur de transcription ATG1. Comme preuve de principe, nous cloneons le gène SIR2 pour effectuer un écran suppresseur sur le phénotype raccourci de durée de vie caractéristique du mutant atg1Δ déficient d’autophagie et le comparons à un fond génétique autrement isogène, de type sauvage.

Introduction

Le vieillissement est la perte d’intégrité dépendante du temps dans une myriade de processus biologiques qui augmente finalement la probabilité de mort organisationnelle. Le vieillissement est presque inévitable pour toutes les espèces. Au niveau cellulaire, il existe plusieurs caractéristiques bien caractérisées qui sont associées au vieillissement, y compris: instabilité génomique, altérations épigénétiques, perte de protéostase, dysfonctionnement mitochondrial, détection des nutriments dérégulé, sénescence cellulaire, et attrition télomère1,2. Dans les organismes unicellulaires, tels que les levures, cela conduit à une réduction du potentiel réplictif et de la durée de vie chronologique3,4. Ces changements cellulaires se manifestent dans des organismes plus complexes, comme les humains, comme des pathologies qui comprennent les cancers, l’insuffisance cardiaque, la neurodégénérescence, le diabète et l’ostéoporose5,6,7. Malgré les nombreuses complexités qui caractérisent le processus de vieillissement, il existe la conservation de ces caractéristiques moléculaires sous-jacentes à ce processus à travers des organismes très divergents8,9,10. L’identification des altérations de ces voies pendant le vieillissement a conduit à la réalisation qu’ils peuvent être manipulés par des changements de mode de vie - restriction alimentaire est montré pour prolonger considérablement la durée de vie dans de nombreux organismes11. Ces voies convergent et se croisent les unes avec les autres et de nombreuses autres voies, de manière complexe. L’élucidation et la caractérisation de ces interactions offrent un potentiel d’interventions thérapeutiques pour prolonger la durée de vie et la durée de vie12,13,14.

La conservation des fondements moléculaires du vieillissement permet la dissection fonctionnelle des interactions génétiques sous-jacentes au processus par l’utilisation d’organismes modèles plus simples – y compris dans la levure en herbe, Saccharomyces cerevisiae15,16. Il existe deux types établis de vieillissement modélisés par la levure en herbe: le vieillissement chronologique (la durée de vie chronologique, CLS) et le vieillissement réplictif (la durée de vie réplicative, RLS)17. Le vieillissement chronologique mesure le temps qu’une cellule peut survivre dans un état non divisant. Ceci est analogue au vieillissement qui est vu dans les cellules qui passent la majorité de leur vie dans G0, tels que les neurones4. Alternativement, la durée de vie réplicative est le nombre de fois qu’une cellule peut diviser avant l’épuisement et est un modèle pour les types de cellules mitotically actives (par exemple, le nombre de cellules filles qu’une cellule peut avoir)18.

L’objectif global de cette méthode est de présenter un protocole qui permet la dissection fonctionnelle de la génétique du vieillissement en utilisant S. cerevisiae. Bien qu’il y ait eu beaucoup d’excellentes études réalisées par de nombreux chercheurs qui ont mené à notre compréhension actuelle, il reste de nombreuses occasions disponibles pour les chercheurs en herbe de contribuer au domaine du vieillissement dès le début de leur carrière universitaire. Nous présentons une méthodologie claire qui permettra aux chercheurs de faire progresser davantage le domaine du vieillissement. Ce protocole est conçu pour être accessible à tous les chercheurs, quel que soit le stade de leur carrière universitaire, en fournissant les outils nécessaires pour formuler et tester leurs propres hypothèses nouvelles. L’avantage de notre approche est qu’il s’agit d’une méthode rentable facilement accessible à tous les chercheurs, quel que soit leur établissement – et qu’elle ne nécessite pas d’équipement coûteux et spécialisé nécessaire à certains protocoles19. Il existe plusieurs façons différentes de concevoir ce type d’écran, l’approche décrite dans ce travail est particulièrement susceptible de dépistage mutants null de gènes non essentiels qui présentent une réduction sévère de la durée de vie chronologique par rapport à une souche isogène de type sauvage de levure.

Comme preuve de principe, nous cloner SIR2, une désacétylase de lysine rapportée comme présentant à la fois un CLS prolongé et raccourci lorsqu’il est surexprimé. Sir2 surexpression a été récemment trouvé pour augmenter CLS dans les levures de vinification; cependant, plusieurs groupes n’ont signalé aucun lien entre sir2 et l’extension CLS, laissant son rôle sous la rubrique20,21,22. En raison de ces rapports contradictoires dans la littérature, nous avons choisi ce gène pour ajouter des recherches indépendantes pour aider à clarifier le rôle de SIR2 dans le vieillissement chronologique, le cas échéant. En outre, l’augmentation du nombre de copies d’un homologue SIR2 prolonge la durée de vie dans un système de modèle de ver nématode23.

L’autophagie est un système de dégradation intracellulaire pour fournir des produits cytosoliques, tels que les protéines et les organites, au lysosome24. L’autophagie est intimement liée à la longévité par son rôle dans la dégradation des protéines endommagées et des organites pour maintenir l’homéostasie cellulaire25. L’induction de l’autophagie dépend de l’orchestration de l’expression de nombreux gènes, et la suppression du gène ATG1 entraîne un CLS anormalement court dans la levure en herbe26. Codes ATG1 pour une protéine sérine/thréonine kinase qui est nécessaire pour la formation de vésicule dans l’autophagie et le cytoplasme-à-vacuole (l’équivalent lysosomal fongique) voie27,28. Ici, nous présentons notre méthode pour un écran de numéro de copie accru, testant l’effet de l’augmentation de la copie SIR2 sur le CLS dans un type sauvage et un fond atg1-null. Cette méthode s’adresse particulièrement aux jeunes chercheurs et aux groupes de recherche des établissements principalement de premier cycle, dont bon nombre des collectivités sous-représentées dans les sciences et disposent de ressources limitées.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Identifier les interactions génétiques potentielles pour le dépistage

  1. Identifier le ou les antécédents génétiques pour la caractérisation, qui se traduit par une durée de vie chronologique anormalement court (CLS) dans Saccharomyces cerevisiae à l’aide de la base de données sur le génome de Saccharomyces (sgd, https://www.yeastgenome.org29,30), qui compile des informations phénotypiques connues pour cet organisme.
    1. Sélectionnez l’onglet Fonction dans les options en haut de la page Web.
    2. Sélectionnez Phénotype suivi de la sélection Parcourir tous les phénotypes.
    3. Des options d’ontologie du phénotype de levure défilent jusqu’à la sous-position Développement et sélectionnez Durée de vie chronologique, trouvée sous la sous-position durée de vie.
    4. Sélectionnez le qualificatif pour la diminution, qui permet l’identification des gènes qui présentent un phénotype qui se traduit par une diminution de la durée de vie chronologique phénotype lorsqu’il est supprimé. Pour cette preuve de méthode atg1Δ a été sélectionné, ce qui se traduit par un phénotype CLS de courte durée et est perturbé pour l’autophagie26.
  2. Identifier les gènes cibles pour dépister les interactions génétiques qui peuvent supprimer le phénotype, basé sur les attributs ontologiques rapportés ou prédits, du mutant identifié dans la partie 1.2. Répétez la recherche phénotype telle qu’elle est trouvée aux étapes 1.1.1-1.1.4 ci-dessus, en interrogeant les gènes qui entraînent un CLS plus long lorsqu’il est surexprimé dans un fond de type sauvage. SIR2 a été sélectionné en fonction du phénotype CLS rapporté et des interactions rapportées avec l’autophagie31,32.

2. Préparer les réactifs

REMARQUE : Sauf indication automatique spécifiée de l’autre, chaque solution à 121 °C pendant 20 min doit stériliser avant l’utilisation.

  1. YPAD liquide : Ajouter 1 % d’extrait de levure, 2 % de peptone, 2 % de dextrose (glucose) et 40 mg d’adénine (comme déshydratation du sulfate d’adénine) par litre d’eau distillée double. Bien mélanger avec un agitateur magnétique.
  2. Support liquide LB : Ajouter la tryptone (10 g), l’extrait de levure (5 g) et le chlorure de sodium (10 g) par litre d’eau double distillée. Bien mélanger avec un agitateur magnétique.
  3. Préparer un stock d’ampicilline 1000x (100 mg/mL), dans de l’eau double distillée. Bien mélanger et filtrer la stérilisation.
  4. Synthétique complet – Leucine (SC-LEU) milieux liquides : Ajouter 1,7 g d’acides aminés de base d’azote de levure, 2 % glucose, 1,92 g de mélange sc-LEU Dropout, 5 g de sulfate d’ammonium par litre d’eau distillée double. Bien mélanger avec un agitateur magnétique.
  5. Tampon TE : Mélanger les Tris (concentration finale de 10 mM), l’EDTA (concentration finale de 1 mM) dans la solution avec de l’eau distillée double. Bien mélanger avec un agitateur magnétique.
  6. Préparer 50% PEG 3350 en solution avec de l’eau double distillée. Bien mélanger avec un agitateur magnétique.
  7. Préparer une solution d’acétate au lithium de 1 M et 100 mM avec de l’eau double distillée. Bien mélanger avec un agitateur magnétique.
    NOTE: Pour faire des plaques d’agar solide ajouter 20 g d’agar (par litre avec de l’eau distillée double) aux médias préparés en 2.1 et 2.2 ci-dessus avant l’autoclaving. Si la préparation des plaques d’ampicilline ajouter 1mL de l’ampicilline au support en 2.2 ci-dessus après qu’il a refroidi à environ 60 °C. Verser dans des assiettes stériles et laisser reposer de 48 à 72 h avant l’utilisation. Conserver les plaques à 4 °C pour un stockage plus long.

3. Concevoir la stratégie de clonage pour cloner SIR2 dans le vecteur pRS315

  1. Concevoir des amorces PCR pour amplifier le gène SIR2 pour le clonage dans le vecteur pRS315.
    1. Concevoir manuellement des amorces pour avoir une complémentarité nucléotide de 21 à 22 pour les régions intergéniques en amont et en aval du SIR2. Assurez-vous que l’ensemble du gène, ainsi que les régions non traduites de l’ARNm est cloné en cartographiant ces fonctionnalités à partir des jeux de données disponibles33,34.
    2. Assurez-vous que la conception de l’amorce PCR donne des amorces avant et inverses dont la température de fusion (Tm) est supérieure à 53 °C et inférieure à 60 °C.
      REMARQUE : Idéalement, les deux amorces devraient avoir un Tm aussi proche l’un de l’autre que la séquence le permettra, avec une teneur approximative en GC comprise entre 40 et 50 %, en veillant à éviter les répétitions de dinucleotide et l’équilibrage de la distribution gc et at tout au long de la séquence.
    3. Après la conception des amorces PCR qui permettront la génération de l’amplicon pour le clonage, ajouter la digestion enzymatique de restriction (R.E.D.) sites cibles à l’extrémité 5' de chaque amorce qui sont compatibles avec le vecteur de clonage plasmide. Dans cette méthode, un site de digestion enzymatique de restriction HindIII (5'-AAGCTT-3') est ajouté à l’amorce en amont, à l’avant et à un site de digestion enzymatique de restriction SacII (5'-CCGCGG-3') est ajouté à l’amorce inverse en aval.
      REMARQUE : L’utilisation des sites SacII et HindIII exige que le site de coupe consensuelle pour chaque endonuclease ne soit pas présent dans le gène cible. Si l’une ou l’autre enzyme cible le gène cible, d’autres enzymes de restriction doivent être choisies. Il y en a beaucoup qui sont compatibles avec la région polylinker sur le vecteur pRS315.
    4. Enfin, ajoutez un surplomb de séquence de quatre nucléotides (5'-NNNN-3') à l’extrémité 5' de chaque amorce pour permettre à l’enzyme de restriction de lier et de digérer l’amiplicon. Une fois les amorces ont été conçues, faites synthétiser commercialement les oligonucléotides pour le clonage du gène SIR2.
    5. Resuspension des amorces PCR : Centrifuge les amorces PCR à l’aide d’un microfuge de table à vitesse maximale pendant 4 min. Ajouter la solution TE pour faire une concentration de stock de 100 μM. Stocker la concentration du stock à -20 °C et diluer 1/10 pour une utilisation dans les applications PCR.
      REMARQUE : Pour faire un stock de 100 μM, dissoudre les amorces dans un volume de tampon TE stérile qui est de 10 fois la quantité de nmoles dans le tube d’amorce, à l’aide de microlitres de TE. Par exemple, si le tube contient 15,6 nmoles d’amorce, ajoutez 156 μL de tampon TE.
  2. Isoler la levure de type sauvage gDNA pour l’amplification PCR de la construction de clonage SIR2.
    REMARQUE : Plusieurs options de haute qualité sont disponibles dans le commerce pour isoler la levure gDNA. L’utilisation d’un kit qui comprend la digestion de la paroi cellulaire fongique avec la zymolyase se traduit par une meilleure qualité gDNA (rendement plus élevé, moins d’impuretés). Le protocole ci-dessous renvoie constamment une forte concentration et pureté. Les détails d’un kit que nous recommandons peuvent être trouvés dans la Table des matériaux.
    1. Cultivez 5 mL de levure de type sauvage pendant 48-72 h à la phase post-log dans des supports enrichis, tels que YPAD. Pelleter les cellules de levure à >800 x g pendant 3 min à température ambiante, enlever le milieu de croissance, et resuspend dans 120 μL de tampon de digestion zymolyase complétée par 5 μL de zymolyase (2 unités enzyme/μL). Mélanger l’échantillon en vortexant et incuber à 37 °C pendant 40 min.
    2. Ajouter 120 μL d’un tampon de lyse chaotrope (p. ex., chlorure de guanidinium), 250 μL de chloroforme et vortex de l’échantillon pendant 60 s.
    3. Centrifugeuse à >8 000 x g pendant 2 min et transférer le supernatant dans une colonne de purification dans un tube de collecte stérile.
    4. Centrifugeuse à >8 000 x g pour 60 s et jeter le débit à travers. L’ADG g sera lié à la matrice de colonne.
    5. Laver la colonne deux fois avec 300 μL d’un tampon de lavage à base d’éthanol, en répétant l’étape de centrifugation d’en haut (3.2.4). Jetez le flux après chaque rotation. Transférer la colonne dans un tube de microfuge de 1,5 mL, ajouter 60 μL de tampon TE et incuber à température ambiante pendant 60 s. Flash tourner l’échantillon pendant 30 s pour elute l’ADN.
      REMARQUE : Déterminer la concentration de l’ADN dans l’échantillon (Absorption à 260nm) et la qualité (Absorption 260nm/280nm). Un rendement typique sera de 100 à 200 ng/μL d’ADG avec un rapport d’absorption à 260nm/280nm aussi proche que possible de 1,8.
  3. Amplifier et isoler le vecteur de plasmide pRS315 pour le clonage.
    REMARQUE : Plusieurs options de haute qualité sont disponibles dans le commerce pour la purification des vecteurs plasmides. Une chimie de colonne à base de silice est recommandée pour cette étape. Les changements mentionnés ci-dessous ont conduit à la plus grande concentration et la pureté. Les détails se trouvent dans le Tableau des matériaux.
    1. Cultiver un 5 mL de culture d’E. coli contenant le vecteur pRS315 pendant la nuit dans les milieux d’ampicilline LB+ (80 μg/mL). Pelleter la culture par centrifugation à >8.000 x g pendant 2 min à RT (15–25 °C).
    2. Re-suspendre les cellules bactériennes granulées dans 250 μL de tampon TE avec RNase A (100 μg/mL) et transférer à un tube de microcentrifuge. Assurez-vous qu’il ne reste pas d’amas de cellules.
    3. Ajouter 250 μL de tampon de lyse et mélanger en inversant le tube 6 à 8 fois. Incuber pendant 5 min à température ambiante. Ne laissez pas la lyse se dérouler pendant plus de 5 min – un peu moins est préférable.
    4. Ajouter 350 μL de tampon de neutralisation et mélanger immédiatement et soigneusement en inversant le tube 10 fois. Centrifugeuse pendant 10 min à >8 000 x g.
    5. Transférer soigneusement le supernatant d’en haut à une colonne de spin de silice par pipetage. Centrifugeuse pour 30 s et jeter le flux à travers.
    6. Ajouter 500 μL d’un tampon de lavage de sel élevé et une centrifugeuse comme à l’étape 3.3.5. Jetez le flux à travers. Laver la colonne de rotation de liaison d’ADN en ajoutant 750 μL d’un tampon de lavage à base d’éthanol, pour enlever les sels résiduels, et la centrifugeuse comme à l’étape 3.3.5.
    7. Jetez le débit à travers et la centrifugeuse pendant 2 minutes supplémentaires à >8,000 x g pour enlever la mémoire tampon de lavage résiduelle. Placez la colonne de rotation dans un tube de microcentrifuge propre et étiqueté de 1,5 m L. Pour éliter l’ADN, ajoutez 20 μL de tampon TE au centre de la colonne de rotation, incuber pendant 1 min à température ambiante et centrifuger pendant 1 min à >8 000 x g.
    8. Utilisez un spectrophotomètre pour déterminer la quantité (Absorption à 260nm) et la qualité (Absorption 260 nm/280 nm) de l’ADN. Un rendement typique sera de 1 à 2 μg/μL.
  4. Amplification pcr du gène candidat, SIR2, à partir d’ADN génomique de type sauvage
    1. Pour produire un amplicon qui convient au clonage, utilisez une polymérase PCR haute fidélité (HF) pour éviter que la génération involontaire de mutations dans la séquence ne soit amplifiée.
      REMARQUE : De nombreuses options PCR à haute fidélité sont disponibles dans le commerce. Pour faciliter l’optimisation des conditions de réaction PCR, utilisez une combinaison à deux tampons : une combinaison standard HF et une optimisée pour les images GC élevées et complexes. Les détails peuvent être trouvés dans la Table des Matériaux.
    2. PcR amplifier la construction SIR2 pour le clonage tel que décrit dans le tableau 1.
      REMARQUE : Pour maximiser le succès dans les étapes de clonage, plusieurs 50 μL identiques peuvent être configurés et concentrés par une étape de nettoyage de colonne PCR. Assurez-vous de configurer une réaction de contrôle de modèle gDNA (contrôle négatif).
    3. Mettre en place les conditions cyclables pcr décrites au tableau 2.
      REMARQUE : Les différentes paires d’amorces varient en fonction de leur température d’antealisation et différentes polymérases fonctionnent à des vitesses différentes. Assurez-vous d’optimiser les conditions d’amplification en fonction de l’enzyme sélectionnée et des spécifications de la combinaison d’amorces telles que conçues.
    4. Vérifiez le succès de la réaction pcr en visualisant la réaction pcr, qui produirait un fragment d’ADN d’environ 2,5 kb, sur un gel TAE-agarose de 1,0 % (avec 0,5 μg/mL de bromure d’éthidium pour la visualisation).
  5. Digestion et ligature du gène candidat, SIR2, dans le vecteur de plasmide pRS315.
    1. Effectuer la digestion de restriction du vecteur et de l’insert : 625 ng d’ADN (soit le vecteur ou l’insertion), q.s. eau pour porter le volume de réaction finale à 50 μL, 5 μL de tampon, 1 μL SacII, et 1 μL HindIII. Incuber les digestions de restriction à 37 °C pendant 3 h, suivie de 80 °C pendant 20 min pour chauffer les enzymes. Les digests peuvent être stockés à 4 °C avant de passer à l’étape suivante.
    2. Mettre en place une réaction de ligature de 15 μL pour créer le plasmide souhaité : 6 μL d’eau stérile, 2 μL de vecteur digéré (50 ng d’ADN), 4 μL d’insertion digérée (100 ng d’ADN), 2 tampon de réaction T4 de μL et 1 μL de Ligase d’ADN T4. Incuber les réactions de ligature pendant la nuit à 16 °C, suivie de 80 °C pendant 20 min pour chauffer l’enzyme.
      REMARQUE : Mettre en place un contrôle sans insertion, en remplaçant 4 μL supplémentaires d’eau stérile (10 μL au total) au lieu de l’insert.
    3. Transformer les réactions de ligature en E. coli.
      REMARQUE : Il existe de nombreuses options pour les cellules compétentes qui sont disponibles. Ce protocole utilise des cellules chimiquement compétentes qui sont stockées à -80 °C avant l’utilisation.
      1. Décongeler un tube de 50 μL de cellules E. coli congelées et compétentes sur la glace jusqu’à ce qu’il soit juste décongelé et ajouter immédiatement 15 μL de la réaction de ligature. Feuilletez le tube plusieurs fois. Remettre immédiatement les tubes sur la glace et incuber pendant 30 min.
      2. Choquez les cellules pendant 20 s dans un bain d’eau à exactement 42 °C, et remettez immédiatement les tubes à la glace pour une incubation de 2 min. Ajouter 450 μL de milieu de récupération de température ambiante (p. ex., SOC ou LB) à chaque réaction de transformation et incuber pendant 60 min à 37 °C avec tremblement.
      3. Pour chaque réaction de transformation, faire une dilution 1:10 des cellules. En utilisant une technique stérile, plaque 150 μL des cellules non diluées et les dilutions de 1:10 sur les plaques d’ampicilline LB + (80 μg/mL)35. Incuber les plaques à 37 °C pendant la nuit.
  6. Écran transformateurs potentiels pour le vecteur de surexpression.
    1. En utilisant une technique stérile, inoculer les transformateurs potentiels qui se sont développés en 5 mL LB + (80 μg/mL) d’ampicilline et se développer pendant la nuit. Suivant la procédure décrite à la section 3.3.1–3.3.7 ci-dessus, isoler les plasmides de chaque transformateur potentiel et l’écran pour l’intégration réussie de l’insert par la digestion de restriction suivie par l’électrophorèse de gel sur un gel taE-agarose de 1,0% (avec 0,5 μg/mL bromure d’éthidique pour la visualisation).

4. Transformer le vecteur en souches de levure de type atg1Δ et sauvage

REMARQUE : Ceci est effectué à l’aide d’un protocole de transformation de l’acétate de lithium modifié36.

  1. Granulé 15 mL de type sauvage et atg1-cellules de levure null cultivés pendant la nuit dans les médias YPAD à la phase de début à mi-log (O.D. 600nm = 0.4-0.9) de croissance pendant 3 min à > 800 x g à température ambiante.
  2. Décanter le supernatant, suspendre à nouveau le granulé cellulaire en 1 ml de ddHstérile 2O et transférer le contenu dans un tube de microfuge de 1,7 m L. Pelleter les cellules pendant 3 min à > 800 x g à température ambiante.
  3. Retirez le supernatant et re-suspendez les cellules dans 250 μL d’acétate de lithium de 100 mM avec pipetage doux. Divisez les cellules en tubes microfuges séparés pour chacune des transformations que vous effectuerez. Utiliser 50 μL du mélange d’acétate cellulaire-lithium par transformation.
  4. Configurer un mélange de transformation. À chacune des transformations ajouter: 240 μL de 50% PEG3350, 36 μL de 1,0 M d’acétate de lithium, et 5 μL de sperme de saumon (ou autre porteur) d’ADN, bouilli pendant 5 min et sur la glace.
    NOTE: PEG est très visqueux. Pipette et mesurez soigneusement. Mélanger par pipetage après l’ajout de chaque composant avant de passer à autre chose.
  5. Ajouter 5 μL du plasmide approprié pour chaque transformation effectuée. Vortex chaque tube pour bien mélanger. Incuber les échantillons à 30 °C pendant 45 min. Échantillons de choc thermique à 42 °C pendant 10 min.
  6. Les cellules de granulés pendant 3 min à > 800 x g à température ambiante, retirez soigneusement le mélange de transformation et re-suspendent les échantillons dans 300 μL de cellules stériles ddH2O. Pellet en répétant le spin ci-dessus, retirez soigneusement l’eau et re-suspendez vos échantillons dans 200 μL de ddHstérile 2O.
  7. Mettre en place 1/10 et 1/100 dilutions pour chaque souche transformée de levure.
  8. Utilisation de la plaque technique stérile 150 μL de chaque échantillon sur des plaques de SC-leucine à sélectionner pour les plasmides. Étendre les cellules uniformément et uniformément et laisser sécher la plaque avant l’inversion et l’incubation à 30 °C pour croître pendant 48–72 h.
    REMARQUE : Une fois la souche appropriée générée, elle peut être stockée à long terme dans 25 % de glycérol à -80 °C. La quantification du numéro de copie présent peut être déterminée par plusieurs méthodologies, y compris qPCR, ARN-FISH, ou une autre mesure appropriée37,38.

5. Déterminer la durée de vie chronologique pour tester la suppression du phénotype CLS raccourcie

  1. Tester l’effet de la surexpression du suppresseur putatif sur le CLS dans la levure de courte durée, mutant atg1Δ, en déterminant le nombre d’unités de formation de colonies (CNU) qui restent en fonction du temps39.
    REMARQUE : Il est nécessaire de configurer cette partie de l’expérience avec les contrôles appropriés. Une expérience typique comparera une souche de levure de type sauvage (WT) avec le vecteur vide, WT avec le vecteur suppresseur, le mutant de suppression avec le vecteur vide, et le mutant de suppression avec le vecteur suppresseur.
    1. Prenez une seule colonie de la souche pour l’étudier et l’inoculer dans les médias SC-LEU. Faire pousser la culture à 30 °C pendant 72 h, en secouant.
    2. À l’aide d’un hémocytomètre, déterminer la concentration des cellules qui sont présentes dans la culture40.
    3. Diluer un aliquot de la culture, de sorte que le résultat est un nombre uniforme de cellules dans un volume de 150 μL d’eau stérile. Plaquez la culture à l’aide d’une technique stérile sur des plaques SC-LEU et poussez à 30 °C pendant 72 h. Ces plaques sont le jour trois temps-point et l’expérience sera normalisée à ce point de temps comme 100% viabilité39.
      REMARQUE : Le nombre de cellules doit être de 200 à 500, suffisamment grand pour l’analyse et un nombre gérable pour le comptage. Dans cette étude, nous avons utilisé 200 cellules pour notre quantité de placage.
    4. Continuer à incuber les cultures de levure à 30 °C, en prenant des aliquots réguliers et le placage comme indiqué dans 5.1.3. Continuez ce processus jusqu’à ce que les souches ne soient plus viables, puis compilez et analysez les résultats.
      REMARQUE : La liste complète des souches utilisées dans cette étude se trouve dans le tableau 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Comme il existe des rapports contradictoires sur le rôle de SIR2 pendant le vieillissement, nous avons choisi ce gène pour l’étude comme un suppresseur potentiel de l’atg1Δ mutant raccourci cls phénotype26. Le rôle de SIR2 est quelque peu controversé, avec des rapports contradictoires sur son rôle dans l’extension de CLS, mais il a été clairement lié à l’augmentation cls dans au moins un fond de levure, avec un rôle à la fois dans l’autophagie et la mitophagie22,31,32,41.

Notre choix de vecteur plasmide est le vecteur de la navette pRS315, qui a été construit pour faciliter la manipulation génétique, la propagation et l’entretien à la fois dans la levure en herbe et les bactéries42. Ce vecteur contient le marqueur nutritionnel LEU2, les promoteurs T7 et T3, et est un vecteur centromérique (CEN) pour le passage stable pendant la division cellulaire42. La stabilité de ce vecteur dans les divisions mitotiques était plus souhaitable par rapport aux vecteurs isogéniques qui différaient par le marqueur nutritionnel42. Le vecteur pRS315 contient également une séquence de reproduction autonome, qui, combinée avec le CEN maintient des niveaux de plasmide faibles et cohérents à l’intérieur (et à travers) une population cellulaire43.

Le gène SIR2 et la séquence d’ADN de la région génomique en amont (5' UTR) et en aval (3' UTR) ont étéobtenus 33. Pour s’assurer que le gène transcrit contenait les composants nécessaires UTRs pour la stabilité et la traduction du produit protéique, notre fenêtre initiale était +/- 400 bp. Cette fenêtre s’est étendue à +/- 500bp en fonction de la composition des nucléotides dans cette région, car notre fenêtre initiale n’a pas abouti à une région propice au clonage. Nous avons conçu des amorces PCR qui permettent l’amplification du gène et des régions réglementaires correspondantes, intégrant des sites de digestion de restriction et un surplomb de quatre nucléotides ajouté à l’extrémité de 5' de chaque amorce (Figure 1A). L’amplification réussie de cette région par PCR donne lieu à un fragment d’ADN de 2.469 kb de longueur (figure 1B).

SIR2 a été amplifié par PCR, et les produits de cette réaction ont été visualisés par l’électrophorèse de gel agarose et comparés à une réaction de contrôle de modèle sans modèle (Figure 2). L’amplification de SIR2 a été vue dans les deux voies avec le modèle d’ADN génomique ; les deux réactions ont été mises en commun et concentrées. La purification plasmide de pRS315 de E. coli a été effectuée, qui ont été visualisées par l’électrophorèse de gel agarose (figure 3). Les échantillons ont été quantifiés par spectrophotométrie, et la préparation plasmide du transformateur #2 a été sélectionnée pour le clonage, qui avait une concentration de 256 ng/μL (OD260/280 = 1,87).

Le plasmide et l’insert ont été digérés avec HindIII et SacII, ligatés ensemble, et transformés en E. coli pour l’amplification et le criblage. Le choix de ces sites de digestion de restriction a exigé la vérification qu’aucun des deux sites n’est présent dans la région pour être cloné. La présence d’un (ou des deux) sites nécessiterait l’utilisation d’enzymes de restriction alternatives pour cloner le gène SIR2, et il y en a plusieurs à sélectionner dans la région de polylinker pRS31542.

Nous avons examiné les transformateurs pour la création réussie du vecteur pRS315-SIR2 par excision de l’insert par double digestion avec HindIII et SacII suivie de la visualisation sur le gel agarose (Figure 4). le vecteur pRS315-SIR2 a été transformé en mutant de type sauvage et en mutant atg1Δ pour générer les souches utilisées pour la caractérisation cls. Le vecteur pRS315 est un vecteur classique qui a été largement utilisé et caractérisé, ce qui est l’un des avantages de ce système particulier. Le numéro de copie relatif a été déterminé par qPCR (Figure 5) comme décrit précédemment37. Cela a entraîné une augmentation modeste du nombre de copies, qui est passée d’une copie moyenne par cellule à une moyenne de 2,5 copies par cellule, ce qui correspond aux rapports précédents42.

La durée de vie chronologique d’atg1Δ+pRS315-SIR2 a été comparée à une souche isogène de levure contenant un vecteur vide au lieu d’un insert(atg1Δ+pRS315). Les cultures vieillissantes ont été plaquées à des dilutions constantes et équivalentes et ont été cultivées pendant 72 h à 30 °C avant l’imagerie et la quantification (figure 6A). Le nombre de colonies formant des unités qui se sont développées a été déterminé et normalisé au jour 3 temps -point (le premier pris) et tracé (figure 6B). Nous rapportons qu’il n’y a aucun effet statistiquement significatif de notre construction de SIR2 sur le CLS dans le fond atg1Δ. En outre, nous n’avons pas vu d’extension du CLS dans le fond de type sauvage – où notre modeste surexpression SIR2 a effectivement produit une diminution du CLS par rapport à la commande vectorielle vide (figure 6B).

Figure 1
Figure 1 : Conception de la construction pour cloner SIR2. La région génomique qui flanque le gène SIR2 a été utilisée pour concevoir des amorces PCR pour l’amplification et le clonage du gène. Les amorces contiennent 21 nt de complémentarité à la région 419 paires de base en amont du gène (FP) et 351 paires de base en aval du gène (RP), soit le site de digestion de restriction HindIII ou SacII, et un surplomb à quatre nucléotides (A). Le schéma de l’amplicon créé par PCR à l’aide des amorces conçues pour le clonage de la région génique SIR2, ainsi que les tailles correspondantes (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Amplification pcr du gène SIR2 visualisé par électrophorèse de gel. Les produits d’une réaction pcr de haute fidélité pour amplifier le gène SIR2 ont été visualisés sur un gel agarose de 1% (avec bromure d’éthidium). Les réactions en double ont été effectuées à l’aide de l’ADN de levure comme modèle (+) et comparées à un contrôle sans modèle (-). La taille d’amplicon prévue est de 2.469 kb. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Visualisation du vecteur pRS315 par électrophorèse de gel. Des réactions de plasmide purifiées dupliquées ont été exécutées et visualisées sur un gel agarose de 1 % (avec bromure d’éthidium). La taille du vecteur pRS315 est de 6,018 ko. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Dépistage du vecteur pRS315-SIR2 par électrophorèse de gel. Les transformateurs potentiels qui contiennent le vecteur pRS315-SIR2 ont été digérés avec HindIII et SacII, puis visualisés sur un gel agarose de 1% (avec bromure d’éthidium). La création réussie du vecteur donnera une bande à 5.963 kb (l’épine dorsale de pRS315) et 2.461 kb (le gène SIR2). Deux transformateurs potentiels ont été comparés à un contrôle vectoriel vide. Transformer #1 montre le modèle attendu par le vecteur pRS315-SIR2. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Le vecteur pRS315-SIR2 augmente le nombre de copies SIR2 dans un arrière-plan de levure de type sauvage. Le nombre d’exemplaires SIR2 présents dans le contexte génétique de type sauvage a été déterminé par pcr quantitatif. Les valeurs ont été calculées à l’aide de la méthode2 -ΔCt avec ACT1 sélectionné comme contrôle interne44. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Durée de vie chronologique de l’atg1Δ+pRS315-SIR2. Le CLS a été déterminé par la quantification du nombre d’unités de formation de colonies viables en fonction du temps. Les cultures vieillissantes de levure ont été diluées à 500 cellules/plaques et cultivées pendant 72 h à 30 °C avant l’imagerie (A). Les données ont été normalisées au troisième jour et tracées pour la visualisation (B). EV est un vecteur vide (pRS315 sans insertion) et SIR2O/E contient l’insert (pRS315-SIR2). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Composant Concentration finale
Eau sans nucléase Q.S. au volume final
Tampon 1X
dNTPs (conc: 10mM) 200uM
Amorce avant (conc: 10μM) 0,5 μM
Amorce inversée(conc: 10μM) 0,5 μM
Modèle gDNA 100-200ng
HF polymérase 1 unité/50μL PCR

Tableau 1 : Composants de réaction PCR.

Étape Temp Heure
Dénaturation initiale 98°C 2mins
Cyclisme 98°C Années 30
(35 cycles) 53-60°C (amorce spécifique) Années 30
72°C 30s par kB
Prolongation finale 72°C 5-10m
Tenir 10°C Indéfiniment

Tableau 2 : Conditions de vélo PCR.

Souche: Parent: Ploidy:
MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 + pRS315 (vecteur LEU) PAR4741 Haploïdes
MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 + pRS315-SIR2 O/E (vecteur LEU) PAR4741 Haploïdes
MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0avg1Δ + vecteur vide pRS315 (vecteur LEU) PAR4741 Haploïdes
MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0avg1Δ + pRS315-SIR2 O/E (vecteur LEU) PAR4741 Haploïdes

Tableau 3 : Souches utilisées.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Démêler la génétique du vieillissement est un défi difficile, avec de nombreuses possibilités d’étude plus approfondie qui peuvent potentiellement donner des informations significatives sur les interactions complexes qui existent. Il existe de nombreuses méthodes qui permettent la génération rapide de mutants de perte de fonction pour l’étude des souches nulles de levure45,46. Cette méthode présente une approche simple pour identifier et cloner les gènes sur le vecteur pRS315 pour les études suppresseurs de surexpression. Un avantage de cette approche est que cela permet une surexpression modérée d’un vecteur stable, ce qui peut éviter tout défi imprévu qui pourrait résulter de l’utilisation d’une intégration chromosomique47. Cette approche est présentée d’une manière qui encouragera le recrutement de chercheurs à différents niveaux de leur carrière scientifique, avec beaucoup d’auteurs sur cette publication contribuant par l’identification et le clonage des suppresseurs putatifs comme une composante de leur éducation.

Dans ce travail, nous montrons comment utiliser la richesse des données disponibles compilées dans la base de données du génome de Saccharomyces pour identifier un phénotype souhaité, dans ce cas des liens génétiques vers une durée de vie chronologique modifiée. Nous avons cloné SIR2 dans le vecteur pRS315 pour tester l’effet d’une surexpression modérée sur le CLS du mutant déficient en autophagie de courte durée, atg1Δ. Tout au long d’un cours de temps de vieillissement de 17 jours, il n’y avait aucun effet vu sur le CLS dans le mutant autophagie et un CLS plus accéléré vu dans le fond de type sauvage. Cela peut être interprété comme l’augmentation modeste du nombre de copies dans SIR2 n’a pas d’effet sur cls dans l’arrière-plan mutant atg1Δ. Comme ATG1 est un facteur de transcription nécessaire pour induire l’autophagie, nos conclusions se limitent à l’initiation de la voie autophagie. En outre, nous ne voyons pas une augmentation sur le CLS dans notre fond génétique de type sauvage – peut-être suggérant que cls étendre les phénotypes d’augmenter le nombre de copie de SIR2 peut être spécifique à certains milieux génétiques et ne sont pas omniprésents.

Les étapes critiques de ce protocole incluent la conception appropriée de la construction SIR2 pour cloner, et les conditions appropriées pour optimiser la ligature. Il peut être nécessaire de résoudre ces étapes pour cloner un gène pour la caractérisation par l’intermédiaire de l’essai CLS. Une limitation de cette approche est qu’elle sélectionne pour les cellules qui conservent le plasmide et qui peuvent réintégrer le cycle cellulaire. Bien qu’il s’agisse d’un marqueur de la condition physique, il est essentiel pour l’étude de suivi en utilisant des approches complémentaires pour disséquer le phénotype vieillissant. Cela peut inclure la quantification de la viabilité cellulaire par la coloration vitale de colorant ainsi que des approches qui ne dépendent pas de la rétention de plasmide. Il existe d’excellentes méthodes permettant de démontrer davantage la caractérisation du CLS par la quantification de l’excroissance des cellules âgées ou la caractérisation de la durée de vie réplicative48,49,50. En outre, notre approche se limite à l’identification des interactions qui ne sont pas létales, et il serait difficile de différencier une tentative ratée de cloner un gène avec une tentative réussie de cloner un gène qui se traduit par un phénotype mortel.

Notre approche est utile pour l’identification des interactions génétiques putatives génétiques des gènes pour une étude plus approfondie. Il est simple et simple, et jusqu’à présent, nous avons utilisé cette approche pour cloner SIR2, AIF1, UBI4, et MDH1 et sont en train de suivre les études avec chacune de ces constructions. Cette technique peut être appliquée pour caractériser n’importe quel nombre d’interactions génétiques en suivant les grandes lignes du protocole dans ce travail.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts.

Acknowledgments

James T. Arnone tient à souligner le soutien des étudiants du cours Recombinant DNA Technologies en 2017 et 2018 à l’Université William Paterson qui ont participé à ce projet dès sa création, mais dont les efforts n’ont pas franchi le seuil de la paternité : Christopher Andino, Juan Botero, Josephine Bozan, Brenda Calalpa, Brenda Cubas, Headtlove Essel Dadzie, Irvin Gamarra, Preciousgift Ibibor , Wayne Ko, Nelson Mejia, Hector Mottola, Rabya Naz, Abdullah Odeh, Pearl Paguntalan, Daniel Raza’e, Gabriella Rector, Aida Shono, et Matthew So. Vous êtes de grands scientifiques et vous me manquez tous!

Les auteurs tiennent à souligner le soutien inestimable apporté à la technologie de l’instruction et de la recherche à l’Université William Paterson pour leur aide : Greg Mattison, Peter Cannarozzi, Rob Meyer, Dante Portella et Henry Heinitsh. Les auteurs tiennent également à souligner le soutien du Bureau du prévôt pour la multithérapie, le Bureau du doyen et le Centre de recherche du Collège des sciences et de la santé leur appui à ces travaux, ainsi qu’au Département de biologie pour soutenir ce projet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fungal/Bacterial DNA kit Zymo Research D6005
HindIIIHF enzyme New England Biolabs R3104S
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0530S
Plasmid miniprep kit Qiagen 12123
SacII enzyme New England Biolabs R0157S
Salmon sperm DNA Thermofisher AM9680
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. López-Otín, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
  2. Kenyon, C. The genetics of ageing. Nature. 464 (7288), 504-512 (2010).
  3. Petralia, R. S., Mattson, M. P., Yao, P. J. Aging and longevity in the simplest animals and the quest for immortality. Ageing Research Reviews. 16, 66-82 (2014).
  4. Longo, V. D., Fabrizio, P. Aging Research in Yeast. , Springer. 101-121 (2011).
  5. Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annual Review of Physiology. 75, 685-705 (2013).
  6. Galkin, F., Zhang, B., Dmitriev, S. E., Gladyshev, V. N. Reversibility of irreversible aging. Ageing Research Reviews. 49, 104-114 (2019).
  7. Khan, S. S., Singer, B. D., Vaughan, D. E. Molecular and physiological manifestations and measurement of aging in humans. Aging Cell. 16 (4), 624-633 (2017).
  8. Riera, C. E., Merkwirth, C., De Magalhaes Filho, C. D., Dillin, A. Signaling networks determining life span. Annual Review of Biochemistry. 85, 35-64 (2016).
  9. Powers, R. W., Kaeberlein, M., Caldwell, S. D., Kennedy, B. K., Fields, S. Extension of chronological life span in yeast by decreased TOR pathway signaling. Genes & Development. 20 (2), 174-184 (2006).
  10. Lapierre, L. R., Hansen, M. Lessons from C. elegans: signaling pathways for longevity. Trends in Endocrinology & Metabolism. 23 (12), 637-644 (2012).
  11. Fontana, L., Partridge, L., Longo, V. D. Extending healthy life span-from yeast to humans. Science. 328 (5976), 321-326 (2010).
  12. Houtkooper, R. H., Pirinen, E., Auwerx, J. Sirtuins as regulators of metabolism and healthspan. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (4), 225-238 (2012).
  13. Bitto, A., et al. Transient rapamycin treatment can increase lifespan and healthspan in middle-aged mice. elife. 5, 16351 (2016).
  14. Fang, E. F., et al. NAD+ replenishment improves lifespan and healthspan in ataxia telangiectasia models via mitophagy and DNA repair. Cell Metabolism. 24 (4), 566-581 (2016).
  15. Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. Large-scale identification in yeast of conserved ageing genes. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (1), 17-21 (2005).
  16. Fabrizio, P., et al. Genome-wide screen in Saccharomyces cerevisiae identifies vacuolar protein sorting, autophagy, biosynthetic, and tRNA methylation genes involved in life span regulation. PLoS Genetics. 6 (7), (2010).
  17. Longo, V. D., Shadel, G. S., Kaeberlein, M., Kennedy, B. Replicative and chronological aging in Saccharomyces cerevisiae. Cell Metabolism. 16 (1), 18-31 (2012).
  18. He, C., Zhou, C., Kennedy, B. K. The yeast replicative aging model. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease. 1864 (9), 2690-2696 (2018).
  19. Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (13), 4916-4920 (2012).
  20. Fabrizio, P., Longo, V. D. The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae. Aging Cell. 2 (2), 73-81 (2003).
  21. Smith, J., Daniel, L., McClure, J. M., Matecic, M., Smith, J. S. Calorie restriction extends the chronological lifespan of Saccharomyces cerevisiae independently of the Sirtuins. Aging Cell. 6 (5), 649-662 (2007).
  22. Orozco, H., Matallana, E., Aranda, A. Genetic manipulation of longevity-related genes as a tool to regulate yeast life span and metabolite production during winemaking. Microbial Cell Factories. 12 (1), 1 (2013).
  23. Tissenbaum, H. A., Guarente, L. Increased dosage of a sir-2 gene extends lifespan in Caenorhabditis elegans. Nature. 410 (6825), 227-230 (2001).
  24. Huang, W. P., Klionsky, D. J. Autophagy in yeast: a review of the molecular machinery. Cell Structure and Function. 27 (6), 409-420 (2002).
  25. Barbosa, M. C., Grosso, R. A., Fader, C. M. Hallmarks of aging: an autophagic perspective. Frontiers in Endocrinology. 9, 790 (2019).
  26. Aris, J. P., et al. Autophagy and leucine promote chronological longevity and respiration proficiency during calorie restriction in yeast. Experimental Gerontology. 48 (10), 1107-1119 (2013).
  27. Cheong, H., Nair, U., Geng, J., Klionsky, D. J. The Atg1 kinase complex is involved in the regulation of protein recruitment to initiate sequestering vesicle formation for nonspecific autophagy in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 19 (2), 668-681 (2008).
  28. Matsuura, A., Tsukada, M., Wada, Y., Ohsumi, Y. Apg1p, a novel protein kinase required for the autophagic process in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 192 (2), 245-250 (1997).
  29. Cherry, J. M., et al. Saccharomyces Genome Database: the genomics resource of budding yeast. Nucleic Acids Research. 40, 700-705 (2012).
  30. Engel, S. R., et al. The reference genome sequence of Saccharomyces cerevisiae: then and now. G3: Genes, Genomes, Genetics. 4 (3), 389-398 (2014).
  31. Imai, S. I., Armstrong, C. M., Kaeberlein, M., Guarente, L. Transcriptional silencing and longevity protein Sir2 is an NAD-dependent histone deacetylase. Nature. 403 (6771), 795-800 (2000).
  32. Sampaio-Marques, B., et al. SNCA (α-synuclein)-induced toxicity in yeast cells is dependent on Sir2-mediated mitophagy. Autophagy. 8 (10), 1494-1509 (2012).
  33. Nagalakshmi, U., et al. The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing. Science. 320 (5881), 1344-1349 (2008).
  34. De Boer, C. G., Hughes, T. R. YeTFaSCo: a database of evaluated yeast transcription factor sequence specificities. Nucleic Acids Research. 40, 169-179 (2012).
  35. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiments. (63), e3064 (2012).
  36. Gietz, R. D., Woods, R. A. Methods in Enzymology. 350, Elsevier. 87-96 (2002).
  37. Salvi, S., et al. Serum and plasma copy number detection using real-time PCR. Journal of Visualized Experiments. (130), e56502 (2017).
  38. McIsaac, R. S., et al. Visualization and analysis of mRNA molecules using fluorescence in situ hybridization in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Visualized Experiments. (76), e50382 (2013).
  39. Mirisola, M. G., Braun, R. J., Petranovic, D. Approaches to study yeast cell aging and death. FEMS Yeast Research. 14 (1), 109-118 (2014).
  40. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. (16), e752 (2008).
  41. Lin, S. J., Guarente, L. Nicotinamide adenine dinucleotide, a metabolic regulator of transcription, longevity and disease. Current Opinion in Cell Biology. 15 (2), 241-246 (2003).
  42. Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).
  43. Romanos, M. A., Scorer, C. A., Clare, J. J. Foreign gene expression in yeast: a review. Yeast. 8 (6), 423-488 (1992).
  44. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research. 29 (9), 45 (2001).
  45. Storici, F., Resnick, M. A. The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast. Methods in Enzymology. 409, 329-345 (2006).
  46. DiCarlo, J. E., et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).
  47. Arnone, J. T. Genomic Considerations for the Modification of Saccharomyces cerevisiae for Biofuel and Metabolite Biosynthesis. Microorganisms. 8 (3), (2020).
  48. Murakami, C., Kaeberlein, M. Quantifying yeast chronological life span by outgrowth of aged cells. Journal of Visualized Experiments. (27), e1156 (2009).
  49. Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. Measuring replicative life span in the budding yeast. Journal of Visualized Experiments. (28), e1209 (2009).
  50. Huberts, D. H., Janssens, G. E., Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Heinemann, M. Continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast. Journal of Visualized Experiments. (78), e50143 (2013).

Tags

Génétique Numéro 163 vieillissement chronologique autophagie SIR2 lysine deacetylase écran suppresseur Saccharomyces cerevisiae copie numéro d’écran
Un écran suppresseur pour la caractérisation des liens génétiques régulant la durée de vie chronologique dans <em>Saccharomyces cerevisiae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dix, C., Sgro, S., Patel, A.,… More

Dix, C., Sgro, S., Patel, A., Perrotta, C., Eldabagh, N., Lomauro, K. L., Miguez, F. W., Chohan, P., Jariwala, C., Arnone, J. T. A Suppressor Screen for the Characterization of Genetic Links Regulating Chronological Lifespan in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (163), e61506, doi:10.3791/61506 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter