Isolierung und Kultivierung von MandibularKnochenmark Mesenchymal Stammzellen bei Ratten
Summary
Dieser Artikel stellt eine Methode vor, die die vollständige Knochenmarkhaftung und die Durchflusszytometrie-Sortierung für die Isolierung, Kultivierung, Sortierung und Identifizierung von mesenchymalen Knochenmarkstammzellen aus Rattenunterkiefern kombiniert.
Abstract
Hier präsentieren wir eine effiziente Methode zur Isolierung und Kultivierung von mandibulären Knochenmarkmesenchymalstammzellen (mBMSCs) in vitro, um schnell zahlreiche hochwertige Zellen für experimentelle Anforderungen zu erhalten. mBMSCs könnten in Zukunft aufgrund der hervorragenden Selbsterneuerungsfähigkeit und des Differenzierungspotenzials mit mehreren Linien in therapeutischen Anwendungen als gewebetechnische Zellen bei craniofacial-Erkrankungen und der cranio-maxillofacial Regeneration weit verbreitet sein. Daher ist es wichtig, mBMSCs in großer Zahl zu erhalten.
In dieser Studie wurde das Knochenmark aus dem Unterkiefer gespült und primäre mBMSCs wurden durch den Anbau an ganze Knochenmark-Anhänger isoliert. Darüber hinaus wurden CD29+CD90+CD45mBMSCs durch fluoreszierende Zellsortierung gereinigt. Die zweite Generation von gereinigten mBMSCs wurde für weitere Studien verwendet und zeigte Potenzial in der Unterscheidung in Osteoblasten, Adipozyten und Chondrozyten. Mit diesem In-vitro-Modell kann man eine hohe Anzahl von proliferativen mBMSCs erhalten, was die Untersuchung der biologischen Eigenschaften, der nachfolgenden Reaktion auf die Mikroumgebung und anderer Anwendungen von mBMSCs erleichtern kann.
Introduction
Knochenmark mesenchymale Stammzellen (BMSCs) sind nicht-hämatopoetische Stammzellen aus Knochenmark abgeleitet, die starke Proliferationsfähigkeit und Multi-Lineage Differenzierungspotenzialmanifestieren 1,2,3,4. Tatsächlich gelten BMSCs seit ihrer Entdeckung als idealer Kandidat für Knochengewebetechnik und -regeneration. Seit Jahren sind der Iliaskamm oder lange Knochen wie Tibia und Oberschenkelknochen die häufigste Quelle von BMSCs für die craniofacial Regeneration. Orofaziale BMSCs, wie z. B. Unterkiefer-BMSCs (mBMSCs), weisen jedoch einige Unterschiede zu langknochenförmigen BMSCs auf, z. B. unterschiedlicheembryonale Herkunft und Entwicklungsmuster. Unterkiefer entstehen aus neuralen Kammzellen der Neuroektoderm-Keimschicht und durchlaufen eine intramembranöse Verknöcherung, während axiale und anhängliche Skelette aus dem Mesoderm stammen und endochondraler Verknöcherung unterzogen werden. Darüber hinaus haben klinische Beobachtungen und experimentelle Tierstudien immer wieder gezeigt, dass es funktionelle Unterschiede zwischen orofazialen und iliac enkchenen BMSCs5,6,7,8gibt. Berichte haben gezeigt, dass BMSCs, die aus craniofacial Knochen wie Unterkiefer, Kieferknochen und Alveolarknochen abgeleitet wurden, eine überlegene Proliferations-, Lebensdauer- und Differenzierungsfähigkeit aufwiesen als solche von axialen und anhänglichen Knochen9. mBMSCs gelten daher als bevorzugte Ressourcen für zukünftige therapeutische Anwendungen von craniofacial Erkrankungen wie Kerubism, Kiefertumor, Osteoporose des Kieferknochens und Parodontalgewebedefekt10,11,12. Um das Behandlungspotenzial in präklinischen Experimenten zu verstehen, ist es wichtig, eine Methode zur schnellen Isolierung und Kultivierung von mBMSCs in vitro zu etablieren.
In dieser Studie bestand das Ziel darin, gereinigte mBMSCs durch vollständige Knochenmarkhaftung und Durchflusszytometriesortierung zu erhalten. Die anatomische Morphologie der Rattenunterkiefer, die durch Mikro-Computertomographie (Micro-CT) und histologische Abschnitte deutlich beobachtet wurde, zeigte, dass der trabekuläre Knochen des Unterkiefers zwischen dem Schneidemittel- und dem Alveolarknochen lag. Das Knochenmark aus trabekulären Knochen wurde gespült, um Unterkiefermarkzellen zu erhalten, aber die auf diese Weise kultivierten Zellen waren keine reinen mBMSCs und waren wahrscheinlich aus mehreren Arten von Zellen mit unsicheren Potenzen und verschiedenen Linien wie Zellen aus Knochen, Fett und Endothelzellen13,14bestehen. Der nächste Schritt der Zellreinigung war besonders wichtig. Durchflusszytometrie filtert Zellen durch Erkennung einer Kombination von Zell-Oberflächen-Proteinen und wurde weithin in der Anreicherung von mesenchymalen Stammzellen angenommen. Die Zellhomogenität ist der Hauptvorteil der Durchflusszytometrie, aber der Prozess bestimmt nicht die Zelllebensfähigkeit und kann zu einer begrenzten Zellausbeute führen. In dieser Studie wurden die P0-MBMSCs, die aus der gesamten Knochenmarkhaftung gewonnen wurden, nach Durchflusszytometrie sortiert, um mBMSCs mit hoher Reinheit und starker Proliferationsfähigkeit zu erhalten.
Diese Studie führt ein reproduzierbares und zuverlässiges Protokoll für Isolierung, Kultur und Differenzierung von munterdibulären BMSCs von Ratten ein, das eine Kombination aus ganzer Knochenmarkhaftung und Durchflusszytometriesortierte verwendet. Es ist eine zuverlässige und bequeme Methode für Forscher in verwandten Bereichen zu verwenden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um BMSCs von Rattenunterkiefern in vitro zu isolieren, indem ganze Knochenmarkhaftung und fluoreszierende Zellsortierung kombiniert werden, was eine einfache und zuverlässige Möglichkeit ist, proliferative mBMSCs mit starker Differenzierungsfähigkeit zu erhalten. Diese Methode könnte mBMSCs vorläufig durch Durchflusszellensortierung reinigen, aber wenn höhere Anforderungen an die Zellhomogenität bestehen, können präzisere Reinigungsmethoden erforderlich sein.
<p clas…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken für die Unterstützung von Laboratory for Digitized Stomatology and Research Center for Craniofacial Anomalies of Shanghai Ninth People es Hospital. Die Arbeit dieses Manuskripts wird durch Stipendien der National Natural Science Foundation of China (NSFC) [81570950,81870740,81800949] unterstützt, Shanghai Summit & Plateau Disciplines, der SHIPM-mu Fonds des Shanghai Institute of Precision Medicine, Shanghai Ninth People es Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine [JC201809], das Incentive Project of High-Level Innovation Team for Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Und L.J. ist Ein Gelehrter des Outstanding Youth Medical Talents, Shanghai “Rising Stars of Medical Talent” Youth Development Program und des Projekts “Chen Xing” der Shanghai Jiaotong University.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA（1X） | Gibco | 25200072 | |
| 10cm culture dish | Corning | ||
| acutenaculum | |||
| Adipogenic differentiation medium | Cyagen biosciences inc. | MUBMX-90031 | |
| Alcian Blue | Beyotime Biotechnology | ||
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Alkaline Phosphatase Color Development Kit | Beyotime Biotechnology | C3206 | |
| alpha-Minimum essential medium | GE Healthcare HyClone Cell Culture | SH30265.01B | |
| Anti -CollagenII Rabbit pAb | Abcam | ab34712 | |
| Antibodies against CD16/CD32 | |||
| Antifade Mounting Medium with DAPI | Beyotime Biotechnology | P0131 | |
| APC anti-mouse/rat CD29 Antibody | biolegend inc | 102215 | |
| Biosafety cabinet | Esco | AC2-4S8-CN | |
| CD45 Monoclonal Antibody (OX1), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0461-82 | |
| CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), FITC, eBioscience | Invitrogen | 11-0900-85 | |
| Centrifuge | cence | L500 | |
| Chondrogenesis differentiation medium | cyagen biosciences inc. | ||
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM880 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| Crystal Violet Staining Solution | Beyotime Biotechnology | C0121 | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare HyClone Cell Culture | SH30084.03 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | abcam | ab150077 | |
| Incubator | Esco | CCL-170B-8 | |
| Inverted microscope | olympus | CKX53 | |
| Magzol reagent(Trizol reagent) | Magen | ||
| micropipettor | Eppendorf | ||
| Oil Red O | |||
| Osteogenic differentiation medium | cyagen biosciences inc. | MUBMX-90021 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Phosphate-buffered saline（1X） | Gibco | 20012027 | |
| PrimeScript RT Master Kit | TakaRa Bio Inc | RR036A | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P6556 | |
| QuickBlock Blocking Buffer | Beyotime Biotechnology | P0260 | |
| scissor | |||
| SYBR1 Premix | TakaRa Bio Inc | ||
| Toluidine Blue | Beyotime Biotechnology | ||
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 |
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