Isolamento e coltivazione di cellule staminali mesenchimali del midollo osseo mandibolare nei ratti
Summary
Questo articolo presenta un metodo che combina l’aderenza al midollo osseo intero e lo smistamento della citometria del flusso per isolare, coltivare, smistare e identificare le cellule staminali mesenchimali del midollo osseo dalle mattidi di ratto.
Abstract
Qui presentiamo un metodo efficace per isolare e coltivare in vitro cellule staminali mesenchimali del midollo osseo mandibolare (mBMSC) per ottenere rapidamente numerose cellule di alta qualità per esigenze sperimentali. Gli mBMSC potrebbero essere ampiamente utilizzati in applicazioni terapeutiche come cellule di ingegneria tissutale in caso di malattie craniofacciali e rigenerazione cranio-maxillo-facciale in futuro grazie all’eccellente capacità di autorinnoto e al potenziale di differenziazione multi-lignaggio. Pertanto, è importante ottenere mBMSC in gran numero.
In questo studio, il midollo osseo è stato lavato dalla mattiere e i mBMSC primari sono stati isolati attraverso la coltivazione aderente al midollo osseo intero. Inoltre, CD29+CD90+CD45− mBMSC sono stati purificati attraverso lo smistamento delle celle fluorescenti. La seconda generazione di mBMSC purificati è stata utilizzata per ulteriori studi e ha mostrato un potenziale nella differenziazione in osteoblasti, adipociti e condrociti. Utilizzando questo modello in vitro, si può ottenere un elevato numero di mBMSC proliferativi, che possono facilitare lo studio delle caratteristiche biologiche, la successiva reazione al microambiente e altre applicazioni degli mBMSC.
Introduction
Le cellule staminali mesenchimali del midollo osseo (BMSC) sono cellule staminali non ematopoietiche derivate dal midollo osseo che manifestano una forte capacità di proliferazione e un potenziale di differenziazione multi-lignaggio1,2,3,4. In effetti, i BMSC sono stati considerati un candidato ideale per l’ingegneria e la rigenerazione dei tessuti ossei sin dalla loro scoperta. Per anni, la cresta iliaca o ossa lunghe come la tibia e il femore sono state la fonte più comune di BMSC per la rigenerazione craniofacciale. Tuttavia, i BMSC orofacciali, come i BMSC mandibolari (mBMSC), mostrano alcune differenze rispetto ai BMSC ossei lunghi, come la diversa origine embrionale e il modello di sviluppo. Le manzibole derivano da cellule di cresta neurale dello strato germinale del neuroectoderma e subiscono ossificazione intramembranosa, mentre gli scheletri assiali e appendicolari provengono dal mesoderma e subiscono ossificazione endocondrale. Inoltre, osservazioni cliniche e studi sperimentali su animali hanno costantemente indicato che esistono differenze funzionali tra BMSC a cresta orofacciale e iliaca5,6,7,8. I rapporti hanno dimostrato che i BMSC derivati da ossa craniofacciali come manzibola, osso mascellare e osso alveolare mostravano una capacità di proliferazione, durata della vita e differenziazione superiore rispetto a quelle delle ossa assiali e appendicolari9. Gli mBMSC, quindi, sono considerati le risorse preferite per future applicazioni terapeutiche di malattie craniofacciali come cherubismo, tumore della mascella, osteoporosi dell’osso mascellare e difetto del tessuto parodontale10,11,12. Per comprendere il potenziale di trattamento negli esperimenti preclinici, è essenziale stabilire un metodo per isolare e coltivare rapidamente i mBMSC in vitro.
In questo studio, l’obiettivo era quello di ottenere mBMSC purificati mediante aderenza al midollo osseo intero e smistamento della citometria del flusso. La morfologia anatomica della mavibola del ratto, chiaramente osservata attraverso la microtomografia computerizzata (Micro-CT) e le sezioni istologiche, ha mostrato che l’osso trabecolare della manzibola era tra lo spazio midollare incisivo e l’osso alveolare. Il midollo osseo dall’osso trabecolare è stato lavato per ottenere cellule mandibolari del midollo, ma le cellule coltivate in questo modo non erano mBMSC puri ed erano suscettibili di consistere in più tipi di cellule con potenze incerte e diversi lignaggi come cellule da ossa, grassi e cellule endoteliali13,14. Il passo successivo della purificazione cellulare è stato particolarmente importante. La citometria a flusso filtra le cellule riconoscendo una combinazione di proteine della superficie cellulare ed è stata ampiamente adottata nell’arricchimento delle cellule staminali mesenchimali. L’omogeneità cellulare è il principale vantaggio della citometria del flusso, ma il processo non determina la vitalità cellulare e può comportare una resa cellulare limitata. In questo studio, i MBMSC P0 ottenuti dall’aderenza al midollo osseo intero sono stati ordinati per citometria di flusso per ottenere mBMSC ad alta purezza e forte capacità di proliferazione.
Questo studio introduce un protocollo riproducibile e affidabile per l’isolamento, la coltura e la differenziazione dei BMSC mandibolari del ratto utilizzando una combinazione di aderenza al midollo osseo intero e smistamento della citometria del flusso. È un metodo affidabile e conveniente da utilizzare per i ricercatori nei campi correlati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive un metodo per isolare i BMSC dalle mantidi di ratto in vitro combinando l’aderenza al midollo osseo intero e lo smistamento delle cellule fluorescenti, che è un modo semplice e affidabile per ottenere mBMSC proliferativi con una forte capacità di differenziazione. Questo metodo potrebbe purificare preventivamente gli mBMSC mediante smistamento delle celle di flusso, ma se ci sono requisiti più elevati per l’omogeneità cellulare, possono essere necessari metodi di purificazione più precisi….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo per l’assistenza del Laboratorio per la Stomatologia Digitalizzata e il Centro di Ricerca per anomalie craniofacciali dell’ospedale nono popolo di Shanghai. Il lavoro di questo manoscritto è supportato da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (NSFC) [81570950,81870740,81800949], Shanghai Summit & Plateau Disciplines, il fondo SHIPM-mu dello Shanghai Institute of Precision Medicine, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine [JC201809], il Progetto incentive del team di innovazione di alto livello per la Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. E L.J. è uno studioso dell’Outstanding Youth Medical Talents, del programma di sviluppo giovanile “Rising Stars of Medical Talent” di Shanghai e del progetto “Chen Xing” della Shanghai Jiaotong University.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA（1X） | Gibco | 25200072 | |
| 10cm culture dish | Corning | ||
| acutenaculum | |||
| Adipogenic differentiation medium | Cyagen biosciences inc. | MUBMX-90031 | |
| Alcian Blue | Beyotime Biotechnology | ||
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Alkaline Phosphatase Color Development Kit | Beyotime Biotechnology | C3206 | |
| alpha-Minimum essential medium | GE Healthcare HyClone Cell Culture | SH30265.01B | |
| Anti -CollagenII Rabbit pAb | Abcam | ab34712 | |
| Antibodies against CD16/CD32 | |||
| Antifade Mounting Medium with DAPI | Beyotime Biotechnology | P0131 | |
| APC anti-mouse/rat CD29 Antibody | biolegend inc | 102215 | |
| Biosafety cabinet | Esco | AC2-4S8-CN | |
| CD45 Monoclonal Antibody (OX1), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0461-82 | |
| CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), FITC, eBioscience | Invitrogen | 11-0900-85 | |
| Centrifuge | cence | L500 | |
| Chondrogenesis differentiation medium | cyagen biosciences inc. | ||
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM880 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| Crystal Violet Staining Solution | Beyotime Biotechnology | C0121 | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare HyClone Cell Culture | SH30084.03 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | abcam | ab150077 | |
| Incubator | Esco | CCL-170B-8 | |
| Inverted microscope | olympus | CKX53 | |
| Magzol reagent(Trizol reagent) | Magen | ||
| micropipettor | Eppendorf | ||
| Oil Red O | |||
| Osteogenic differentiation medium | cyagen biosciences inc. | MUBMX-90021 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Phosphate-buffered saline（1X） | Gibco | 20012027 | |
| PrimeScript RT Master Kit | TakaRa Bio Inc | RR036A | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P6556 | |
| QuickBlock Blocking Buffer | Beyotime Biotechnology | P0260 | |
| scissor | |||
| SYBR1 Premix | TakaRa Bio Inc | ||
| Toluidine Blue | Beyotime Biotechnology | ||
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 |
References
- Jin, C., et al. Stem cell education for medical students at Tongji University: Primary cell culture and directional differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells. Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (2), 151-154 (2018).
- Chu, D. T., et al. An Update on the Progress of Isolation, Culture, Storage, and Clinical Application of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem/Stromal Cells. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 708 (2020).
- Jin, Z., Chen, J., Shu, B., Xiao, Y., Tang, D. Bone mesenchymal stem cell therapy for ovariectomized osteoporotic rats: a systematic review and meta-analysis. BMC Musculoskeleton Disorder. 20 (1), 556 (2019).
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- Musina, R. A., Bekchanova, E. S., Belyavskii, A. V., Sukhikh, G. T. Differentiation potential of mesenchymal stem cells of different origin. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 141 (1), 147-151 (2006).
- Lloyd, B., et al. Similarities and differences between porcine mandibular and limb bone marrow mesenchymal stem cells. Archives in Oral Biology. 77, 1-11 (2017).
- Zhang, W., et al. Comparison of the use of adipose tissue-derived and bone marrow-derived stem cells for rapid bone regeneration. Journal of Dental Research. 92 (12), 1136-1141 (2013).
- Stefanik, D., et al. Disparate osteogenic response of mandible and iliac crest bone marrow stromal cells to pamidronate. Oral Disorders. 14 (5), 465-471 (2008).
- Aghaloo, T. L., et al. Osteogenic potential of mandibular vs. long-bone marrow stromal cells. Journal of Dental Research. 89 (11), 1293-1298 (2010).
- Kaigler, D., et al. Stem cell therapy for craniofacial bone regeneration: a randomized, controlled feasibility trial. Cell Transplantation. 22 (5), 767-777 (2013).
- Li, C., Wang, F., Zhang, R., Qiao, P., Liu, H. Comparison of proliferation and osteogenic differentiation potential of rat mandibular and femoral bone marrow mesenchymal stem cells in vitro. Stem Cells Development. 2020, 1941629 (2020).
- Matsubara, T., et al. Alveolar bone marrow as a cell source for regenerative medicine: differences between alveolar and iliac bone marrow stromal cells. Journal of Bone and Mineral Research. 20 (3), 399-409 (2005).
- Chan, C. K. F., et al. Identification of the Human Skeletal Stem Cell. Cell. 175 (1), 43-56 (2018).
- Bianco, P., Riminucci, M., Gronthos, S., Robey, P. G. Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential applications. Stem Cells. 19 (3), 180-192 (2001).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocol. 1 (5), 2315-2319 (2006).
- Xu, H., et al. Icariin prevents oestrogen deficiency-induced alveolar bone loss through promoting osteogenesis via STAT3. Cell Proliferation. 53 (2), 12743 (2020).
- Zhang, P., Wu, Y., Jiang, Z., Jiang, L., Fang, B. Osteogenic response of mesenchymal stem cells to continuous mechanical strain is dependent on ERK1/2-Runx2 signaling. Internation Journal of Molecular Medicine. 29 (6), 1083-1089 (2012).
- Zhu, H., et al. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone. Nature Protocol. 5 (3), 550-560 (2010).
- Lach, M. S., et al. Chondrogenic Differentiation of Pluripotent Stem Cells under Controllable Serum-Free Conditions. International Journal of Molecular Sciences. 20 (11), 2711 (2019).
- Huang, X., Zhong, L., Hendriks, J., Post, J. N., Karperien, M. The Effects of the WNT-Signaling Modulators BIO and PKF118-310 on the Chondrogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 561 (2018).
- Gale, A. L., Linardi, R. L., McClung, G., Mammone, R. M., Ortved, K. F. Comparison of the Chondrogenic Differentiation Potential of Equine Synovial Membrane-Derived and Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Frontiers in Veterinary Sciences. 6, 178 (2019).
- Li, X., Zhang, Y., Qi, G. Evaluation of isolation methods and culture conditions for rat bone marrow mesenchymal stem cells. Cytotechnology. 65 (3), 323-334 (2013).
- Kagami, H., Agata, H., Tojo, A. Bone marrow stromal cells (bone marrow-derived multipotent mesenchymal stromal cells) for bone tissue engineering: basic science to clinical translation. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 43 (3), 286-289 (2011).
- Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
- Abdallah, B. M., Alzahrani, A. M., Abdel-Moneim, A. M., Ditzel, N., Kassem, M. A simple and reliable protocol for long-term culture of murine bone marrow stromal(mesenchymal) stem cells that retained their in vitro and in vivo stemness in long-term culture. Biology Proceedings Online. 21, 3 (2019).
