ラットにおける骨髄間葉系幹細胞の単離と培養
Summary
本稿では、ラット下顎骨から骨髄間葉幹細胞を単離、栽培、選別、同定するための骨髄付着とフローサイトメトリーの選別を組み合わせた方法を紹介する。
Abstract
ここでは、実験要件に対して多数の高品質細胞を迅速に得るために、インビトロで下顎骨髄間葉系幹細胞(mBMSC)を単離・培養するための効率的な方法を紹介します。mBMSCは、優れた自己再生能力と多系統分化能力により、将来的に頭蓋顔面疾患や頭蓋顎顔面再生の場合の組織工学細胞としての治療用途に広く使用される可能性があります。したがって、mBMSCs を大量に取得することが重要です。
本研究では、骨髄を下顎骨から洗い流し、原発mBMSCを骨髄付着栽培全体で単離した。さらに、CD29+CD90+CD45−mBMSCを蛍光細胞選別により精製した。第2世代の精製mBMSCは、骨芽細胞、有形細胞、軟骨細胞への分化においてさらなる研究と潜在能力を示す目的で使用された。このin vitroモデルを利用して、多くの増殖性mBMSCsを得ることができ、生物学的特性の研究、その後の微小環境への反応、およびmBMSCsの他の用途を促進することができる。
Introduction
骨髄間葉系幹細胞(BMC)は、強い増殖能力および多系統分化電位1、2、3、4を示す骨髄由来の非造血幹細胞である。確かに、BMCは発見されて以来、骨組織工学と再生の理想的な候補と考えられてきました。何年もの間、腸骨の紋章や脛骨や大腿骨などの長い骨は、頭蓋顔面再生のためのBMSCの最も一般的な供給源であった。しかし、下顎骨BMC(mBMSC)などの顔面BMSCsは、異なる胚起源および発達パターンなどの長い骨BMSCとのいくつかの違いを示す。下顎骨は神経摘出胚層の神経堤細胞から生じ、内在性骨軟化を受け、軸および付加的骨格は中胚体からであり、内因性骨化を受ける。さらに、臨床観察および実験動物研究は、一貫して、オロフェイシャルと腸骨紋BMC5、6、7、8の間に機能的な違いがあることを示している。報告によると、下顎骨、上顎骨、歯槽骨などの頭蓋顔面骨に由来するBmSCは、軸骨および付属骨からのものよりも優れた増殖、寿命、および分化能力を示した。mBMSCは、したがって、ケルビズム、顎腫瘍、顎骨の骨粗鬆症、および歯周組織欠損10、11、12などの頭蓋顔面疾患の将来の治療用途に好まれるリソースであると考えられる。前臨床実験における治療の可能性を理解するためには、インビトロでmBMSCを迅速に単離・培養する方法を確立することが不可欠である。
本研究では、骨髄全体の付着とフローサイトメトリー選別により精製mBMSCsを得ることを目的とした。ラット下顎骨の解剖学的形態は、マイクロコンピュータ断層撮影(マイクロCT)および組織学的切片を通して明確に観察され、下顎骨の骨膜骨が切歯髄腔と歯槽骨の間であることを示した。骨蓋骨から骨髄を洗い流して下顎骨細胞を得たが、この方法で培養した細胞は純粋なmBMSCではなく、骨、脂肪および内皮細胞13、14の細胞のような不確実なポテンシーおよび多様な系統を有する複数のタイプの細胞から成る可能性が高い。細胞浄化の次のステップは特に重要であった。フローサイトメトリーは、細胞表面タンパク質の組み合わせを認識して細胞をフィルターし、間葉系幹細胞の濃縮に広く採用されています。細胞の均質性はフローサイトメトリーの主な利点であるが、プロセスは細胞の生存率を決定せず、細胞収量が制限される可能性がある。本研究では、骨髄全体の付着から得られたP0 mBMSCをフローサイトメトリーで選別し、高純度で増殖能力の高いmBMSCsを得た。
本研究では、骨髄付着とフローサイトメトリーの選別を組み合わせて、ラット下顎骨BMSCの分離、培養、分化のための再現性と信頼性の高いプロトコルを紹介する。関連分野の研究者が利用できる、信頼できる便利な方法です。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、骨髄付着と蛍光細胞選別を組み合わせることによって、ラット下顎骨からBMCを分離する方法を説明する。この方法は、フローセルソーティングによってmBMSCを予備的に精製することができますが、細胞の均質性に対してより高い要件がある場合は、より正確な精製方法が必要になる可能性があります。
現在、mBMSCsの単離に使用される4つの主要な技術?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
上海第9人民病院頭蓋顔面異常研究センターのデジタル化された病頭学研究センターの支援に感謝します。本稿の研究は中国国立自然科学財団(NSFC)からの助成金によって支えられている[81570950、81870740、81800949]、 上海サミット&高原分野、上海精密医学研究所、上海九人民病院、上海交通大学医学部[JC201809]、上海交通大学医学部の高レベルイノベーションチームインセンティブプロジェクト。L.J.は、優れた青少年医療人材、上海「医療人材の新星」青少年育成プログラム、上海交通大学の「陳興」プロジェクトの学者です。
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA（1X） | Gibco | 25200072 | |
| 10cm culture dish | Corning | ||
| acutenaculum | |||
| Adipogenic differentiation medium | Cyagen biosciences inc. | MUBMX-90031 | |
| Alcian Blue | Beyotime Biotechnology | ||
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Alkaline Phosphatase Color Development Kit | Beyotime Biotechnology | C3206 | |
| alpha-Minimum essential medium | GE Healthcare HyClone Cell Culture | SH30265.01B | |
| Anti -CollagenII Rabbit pAb | Abcam | ab34712 | |
| Antibodies against CD16/CD32 | |||
| Antifade Mounting Medium with DAPI | Beyotime Biotechnology | P0131 | |
| APC anti-mouse/rat CD29 Antibody | biolegend inc | 102215 | |
| Biosafety cabinet | Esco | AC2-4S8-CN | |
| CD45 Monoclonal Antibody (OX1), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0461-82 | |
| CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), FITC, eBioscience | Invitrogen | 11-0900-85 | |
| Centrifuge | cence | L500 | |
| Chondrogenesis differentiation medium | cyagen biosciences inc. | ||
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM880 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| Crystal Violet Staining Solution | Beyotime Biotechnology | C0121 | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare HyClone Cell Culture | SH30084.03 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | abcam | ab150077 | |
| Incubator | Esco | CCL-170B-8 | |
| Inverted microscope | olympus | CKX53 | |
| Magzol reagent(Trizol reagent) | Magen | ||
| micropipettor | Eppendorf | ||
| Oil Red O | |||
| Osteogenic differentiation medium | cyagen biosciences inc. | MUBMX-90021 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Phosphate-buffered saline（1X） | Gibco | 20012027 | |
| PrimeScript RT Master Kit | TakaRa Bio Inc | RR036A | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P6556 | |
| QuickBlock Blocking Buffer | Beyotime Biotechnology | P0260 | |
| scissor | |||
| SYBR1 Premix | TakaRa Bio Inc | ||
| Toluidine Blue | Beyotime Biotechnology | ||
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 |
References
- Jin, C., et al. Stem cell education for medical students at Tongji University: Primary cell culture and directional differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells. Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (2), 151-154 (2018).
- Chu, D. T., et al. An Update on the Progress of Isolation, Culture, Storage, and Clinical Application of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem/Stromal Cells. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 708 (2020).
- Jin, Z., Chen, J., Shu, B., Xiao, Y., Tang, D. Bone mesenchymal stem cell therapy for ovariectomized osteoporotic rats: a systematic review and meta-analysis. BMC Musculoskeleton Disorder. 20 (1), 556 (2019).
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- Musina, R. A., Bekchanova, E. S., Belyavskii, A. V., Sukhikh, G. T. Differentiation potential of mesenchymal stem cells of different origin. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 141 (1), 147-151 (2006).
- Lloyd, B., et al. Similarities and differences between porcine mandibular and limb bone marrow mesenchymal stem cells. Archives in Oral Biology. 77, 1-11 (2017).
- Zhang, W., et al. Comparison of the use of adipose tissue-derived and bone marrow-derived stem cells for rapid bone regeneration. Journal of Dental Research. 92 (12), 1136-1141 (2013).
- Stefanik, D., et al. Disparate osteogenic response of mandible and iliac crest bone marrow stromal cells to pamidronate. Oral Disorders. 14 (5), 465-471 (2008).
- Aghaloo, T. L., et al. Osteogenic potential of mandibular vs. long-bone marrow stromal cells. Journal of Dental Research. 89 (11), 1293-1298 (2010).
- Kaigler, D., et al. Stem cell therapy for craniofacial bone regeneration: a randomized, controlled feasibility trial. Cell Transplantation. 22 (5), 767-777 (2013).
- Li, C., Wang, F., Zhang, R., Qiao, P., Liu, H. Comparison of proliferation and osteogenic differentiation potential of rat mandibular and femoral bone marrow mesenchymal stem cells in vitro. Stem Cells Development. 2020, 1941629 (2020).
- Matsubara, T., et al. Alveolar bone marrow as a cell source for regenerative medicine: differences between alveolar and iliac bone marrow stromal cells. Journal of Bone and Mineral Research. 20 (3), 399-409 (2005).
- Chan, C. K. F., et al. Identification of the Human Skeletal Stem Cell. Cell. 175 (1), 43-56 (2018).
- Bianco, P., Riminucci, M., Gronthos, S., Robey, P. G. Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential applications. Stem Cells. 19 (3), 180-192 (2001).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocol. 1 (5), 2315-2319 (2006).
- Xu, H., et al. Icariin prevents oestrogen deficiency-induced alveolar bone loss through promoting osteogenesis via STAT3. Cell Proliferation. 53 (2), 12743 (2020).
- Zhang, P., Wu, Y., Jiang, Z., Jiang, L., Fang, B. Osteogenic response of mesenchymal stem cells to continuous mechanical strain is dependent on ERK1/2-Runx2 signaling. Internation Journal of Molecular Medicine. 29 (6), 1083-1089 (2012).
- Zhu, H., et al. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone. Nature Protocol. 5 (3), 550-560 (2010).
- Lach, M. S., et al. Chondrogenic Differentiation of Pluripotent Stem Cells under Controllable Serum-Free Conditions. International Journal of Molecular Sciences. 20 (11), 2711 (2019).
- Huang, X., Zhong, L., Hendriks, J., Post, J. N., Karperien, M. The Effects of the WNT-Signaling Modulators BIO and PKF118-310 on the Chondrogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 561 (2018).
- Gale, A. L., Linardi, R. L., McClung, G., Mammone, R. M., Ortved, K. F. Comparison of the Chondrogenic Differentiation Potential of Equine Synovial Membrane-Derived and Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Frontiers in Veterinary Sciences. 6, 178 (2019).
- Li, X., Zhang, Y., Qi, G. Evaluation of isolation methods and culture conditions for rat bone marrow mesenchymal stem cells. Cytotechnology. 65 (3), 323-334 (2013).
- Kagami, H., Agata, H., Tojo, A. Bone marrow stromal cells (bone marrow-derived multipotent mesenchymal stromal cells) for bone tissue engineering: basic science to clinical translation. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 43 (3), 286-289 (2011).
- Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
- Abdallah, B. M., Alzahrani, A. M., Abdel-Moneim, A. M., Ditzel, N., Kassem, M. A simple and reliable protocol for long-term culture of murine bone marrow stromal(mesenchymal) stem cells that retained their in vitro and in vivo stemness in long-term culture. Biology Proceedings Online. 21, 3 (2019).
