בידוד וטיפוח של תאי גזע מסנכימליים במח עצם מנדיבול בחולדות
Summary
מאמר זה מציג שיטה המשלבת דבקות של מח עצם שלם ומיון ציטומטריה זרימה לבידוד, טיפוח, מיון וזיהוי תאי גזע מזנכימליים של מח עצם מלסת חולדה.
Abstract
כאן אנו מציגים שיטה יעילה לבידוד ו culturing תאי גזע mesenchymal מח עצם mandibular (mBMSCs) במבחנה כדי להשיג במהירות תאים באיכות גבוהה רבים לדרישות ניסיוניות. mBMSCs יכול להיות בשימוש נרחב ביישומים טיפוליים כתאים הנדסת רקמות במקרה של מחלות craniofacial והתחדשות cranio-maxillofacial בעתיד בשל יכולת התחדשות עצמית מעולה ופוטנציאל בידול רב שושלת. לכן, חשוב להשיג mBMSCs במספרים גדולים.
במחקר זה, מח עצם היה סמוקה מן הלסת התחתונה mBMSCs העיקרי היו מבודדים באמצעות טיפוח מח עצם שלם דבק. יתר על כן, CD29+CD90+CD45– mBMSCs טוהרו באמצעות מיון תאים פלואורסצנטיים. הדור השני של mBMSCs מטוהרים שימשו למחקר נוסף והפגינו פוטנציאל להבדיל לתוך osteoblasts, adipocytes, וכונדרוציטים. ניצול מודל זה במבחנה, ניתן להשיג מספר גבוה של mBMSCs שגשוג, אשר עשוי להקל על חקר המאפיינים הביולוגיים, התגובה הבאה microenvironment, ויישומים אחרים של mBMSCs.
Introduction
תאי גזע mesenchymal מח עצם (BMSCs) הם תאי גזע שאינם hematopoietic נגזר מח עצם המניפסט יכולת התפשטות חזקה ובידול רבשושלתפוטנציאל 1,2,3,4. ואכן, BMSCs נחשבו כמועמד אידיאלי להנדסת רקמת עצם והתחדשות מאז שהתגלו. במשך שנים, סמל האיליאק או עצמות ארוכות כגון השוקה ועצם הירך היו המקור הנפוץ ביותר של BMSCs להתחדשות craniofacial. עם זאת, בקרי BMSC של Orofacial, כגון BMSCs מנדיבולריים (mBMSCs), מציגים כמה הבדלים מ- BMSCs של עצם ארוכה, כגון מקור עוברי שונה ותבנית פיתוח. הלסת התחתונה נובעת מתאי ציצה עצביים של שכבת הנבט הנוירוקטודרם ועוברת תולדות תוך-ממברניות, בעוד שלדים ציריים ונספחיים הם מהמסודרם ועוברים אוססיפיקציה אנדוכונדרית. יתר על כן, תצפיות קליניות ומחקרים ניסיוניים בבעלי חיים הראו באופן עקבי כי ישנם הבדלים תפקודיים בין פסגת orofacial ו iliac BMSCs5,6,7,8. דיווחים הראו כי BMSCs נגזר עצם craniofacial כגון עצם הלסת התחתונה, עצם maxillary, ועצם מכתשית הציג התפשטות מעולה, תוחלת חיים, ויכולת בידול מאלה של עצמות ציריות ונספח9. mBMSCs, אם כן, נחשבים המשאבים המועדפים עבור יישומים טיפוליים עתידיים של מחלות craniofacial כגון כרוביזם, גידול בלסת, אוסטאופורוזיס של עצם הלסת, ומפגם רקמת חניכיים10,11,12. כדי להבין את פוטנציאל הטיפול בניסויים פרה-קוליניים, חיוני לקבוע שיטה לבידוד מהיר ולבידוד mBMSCs במבחנה.
במחקר זה, המטרה הייתה להשיג mBMSCs מטוהרים על ידי דבקות מח עצם שלם ומיון cytometry זרימה. המורפולוגיה האנטומית של הלסת התחתונה של החולדה, שנצפתה בבירור באמצעות טומוגרפיה ממוחשבת מיקרו (Micro-CT) ומקטעים היסטולוגיים, הראתה כי עצם הלסת התחתונה הייתה בין החלל הטחון החותך לבין עצם מכתשית. מח העצם מעצם trabecular היה סמוק כדי להשיג תאי מח עצם, אבל התאים מתורבתים בדרך זו לא היו mBMSCs טהורים היו עשויים להיות מורכבים סוגים רבים של תאים עם עוצמות לא בטוחות ושושלת מגוונת כגון תאים מעצם, שומן ותאי אנדותל13,14. השלב הבא של טיהור התאים היה חשוב במיוחד. זרימה cytometry מסנן תאים על ידי זיהוי שילוב של חלבונים משטח התא אומץ נרחב בהעשרה של תאי גזע mesenchymal. הומוגניות התא הוא היתרון העיקרי של cytometry זרימה, אבל התהליך אינו קובע את הכדאיות של התא יכול לגרום לתפוקת תא מוגבלת. במחקר זה, P0 mBMSCs שהתקבלו הדבקות מח עצם שלם מוינו לפי cytometry זרימה כדי להשיג mBMSCs עם טוהר גבוה ויכולת התפשטות חזקה.
מחקר זה מציג פרוטוקול לשחזור ואמין לבידוד, תרבות, ובידול של BMSCs גברי עכברוש באמצעות שילוב של דבקות מח עצם שלם מיון cytometry זרימה. זוהי שיטה אמינה ונוחה לחוקרים בתחומים קשורים לשימוש.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר שיטה לבודד BMSCs מן הלסת התחתונה חולדה במבחנה על ידי שילוב של דבקות מח עצם שלם מיון תאים פלואורסצנטי, המהווה דרך פשוטה ואמינה להשיג mBMSCs התפשטות עם יכולת בידול חזקה. שיטה זו יכולה לטהר מראש mBMSCs על ידי מיון תא זרימה, אבל אם יש דרישות גבוהות יותר עבור הומוגניות התא, שיטות טיהור מד…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים על הסיוע של המעבדה עבור מרכז סטומטולוגיה דיגיטלית ומחקר עבור אנומליות Craniofacial של בית החולים העממי התשיעי של שנגחאי. עבודתו של כתב יד זה נתמכת על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (NSFC) [81570950,81870740,81800949], פסגת שנגחאי & מישור דיסציפלינות, קרן SHIPM-mu ממכון שנגחאי לרפואה מדויקת, בית החולים העממי התשיעי של שנגחאי, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת שנגחאי ג’יאו טונג [JC201809], פרויקט התמריצים של צוות חדשנות ברמה גבוהה עבור בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג’יאו טונג בשנגחאי. ואל.ג’יי הוא חוקר של כישרונות רפואיים מצטיינים לנוער, שנגחאי “כוכבים עולים של כישרון רפואי” תוכנית פיתוח נוער ופרויקט “חן שינג” מאוניברסיטת שנגחאי Jiaotong.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA（1X） | Gibco | 25200072 | |
| 10cm culture dish | Corning | ||
| acutenaculum | |||
| Adipogenic differentiation medium | Cyagen biosciences inc. | MUBMX-90031 | |
| Alcian Blue | Beyotime Biotechnology | ||
| Alizarin red | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| Alkaline Phosphatase Color Development Kit | Beyotime Biotechnology | C3206 | |
| alpha-Minimum essential medium | GE Healthcare HyClone Cell Culture | SH30265.01B | |
| Anti -CollagenII Rabbit pAb | Abcam | ab34712 | |
| Antibodies against CD16/CD32 | |||
| Antifade Mounting Medium with DAPI | Beyotime Biotechnology | P0131 | |
| APC anti-mouse/rat CD29 Antibody | biolegend inc | 102215 | |
| Biosafety cabinet | Esco | AC2-4S8-CN | |
| CD45 Monoclonal Antibody (OX1), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0461-82 | |
| CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), FITC, eBioscience | Invitrogen | 11-0900-85 | |
| Centrifuge | cence | L500 | |
| Chondrogenesis differentiation medium | cyagen biosciences inc. | ||
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM880 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| Crystal Violet Staining Solution | Beyotime Biotechnology | C0121 | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare HyClone Cell Culture | SH30084.03 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | abcam | ab150077 | |
| Incubator | Esco | CCL-170B-8 | |
| Inverted microscope | olympus | CKX53 | |
| Magzol reagent(Trizol reagent) | Magen | ||
| micropipettor | Eppendorf | ||
| Oil Red O | |||
| Osteogenic differentiation medium | cyagen biosciences inc. | MUBMX-90021 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Phosphate-buffered saline（1X） | Gibco | 20012027 | |
| PrimeScript RT Master Kit | TakaRa Bio Inc | RR036A | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P6556 | |
| QuickBlock Blocking Buffer | Beyotime Biotechnology | P0260 | |
| scissor | |||
| SYBR1 Premix | TakaRa Bio Inc | ||
| Toluidine Blue | Beyotime Biotechnology | ||
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 |
References
- Jin, C., et al. Stem cell education for medical students at Tongji University: Primary cell culture and directional differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells. Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (2), 151-154 (2018).
- Chu, D. T., et al. An Update on the Progress of Isolation, Culture, Storage, and Clinical Application of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem/Stromal Cells. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 708 (2020).
- Jin, Z., Chen, J., Shu, B., Xiao, Y., Tang, D. Bone mesenchymal stem cell therapy for ovariectomized osteoporotic rats: a systematic review and meta-analysis. BMC Musculoskeleton Disorder. 20 (1), 556 (2019).
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
- Musina, R. A., Bekchanova, E. S., Belyavskii, A. V., Sukhikh, G. T. Differentiation potential of mesenchymal stem cells of different origin. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 141 (1), 147-151 (2006).
- Lloyd, B., et al. Similarities and differences between porcine mandibular and limb bone marrow mesenchymal stem cells. Archives in Oral Biology. 77, 1-11 (2017).
- Zhang, W., et al. Comparison of the use of adipose tissue-derived and bone marrow-derived stem cells for rapid bone regeneration. Journal of Dental Research. 92 (12), 1136-1141 (2013).
- Stefanik, D., et al. Disparate osteogenic response of mandible and iliac crest bone marrow stromal cells to pamidronate. Oral Disorders. 14 (5), 465-471 (2008).
- Aghaloo, T. L., et al. Osteogenic potential of mandibular vs. long-bone marrow stromal cells. Journal of Dental Research. 89 (11), 1293-1298 (2010).
- Kaigler, D., et al. Stem cell therapy for craniofacial bone regeneration: a randomized, controlled feasibility trial. Cell Transplantation. 22 (5), 767-777 (2013).
- Li, C., Wang, F., Zhang, R., Qiao, P., Liu, H. Comparison of proliferation and osteogenic differentiation potential of rat mandibular and femoral bone marrow mesenchymal stem cells in vitro. Stem Cells Development. 2020, 1941629 (2020).
- Matsubara, T., et al. Alveolar bone marrow as a cell source for regenerative medicine: differences between alveolar and iliac bone marrow stromal cells. Journal of Bone and Mineral Research. 20 (3), 399-409 (2005).
- Chan, C. K. F., et al. Identification of the Human Skeletal Stem Cell. Cell. 175 (1), 43-56 (2018).
- Bianco, P., Riminucci, M., Gronthos, S., Robey, P. G. Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential applications. Stem Cells. 19 (3), 180-192 (2001).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocol. 1 (5), 2315-2319 (2006).
- Xu, H., et al. Icariin prevents oestrogen deficiency-induced alveolar bone loss through promoting osteogenesis via STAT3. Cell Proliferation. 53 (2), 12743 (2020).
- Zhang, P., Wu, Y., Jiang, Z., Jiang, L., Fang, B. Osteogenic response of mesenchymal stem cells to continuous mechanical strain is dependent on ERK1/2-Runx2 signaling. Internation Journal of Molecular Medicine. 29 (6), 1083-1089 (2012).
- Zhu, H., et al. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone. Nature Protocol. 5 (3), 550-560 (2010).
- Lach, M. S., et al. Chondrogenic Differentiation of Pluripotent Stem Cells under Controllable Serum-Free Conditions. International Journal of Molecular Sciences. 20 (11), 2711 (2019).
- Huang, X., Zhong, L., Hendriks, J., Post, J. N., Karperien, M. The Effects of the WNT-Signaling Modulators BIO and PKF118-310 on the Chondrogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 561 (2018).
- Gale, A. L., Linardi, R. L., McClung, G., Mammone, R. M., Ortved, K. F. Comparison of the Chondrogenic Differentiation Potential of Equine Synovial Membrane-Derived and Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Frontiers in Veterinary Sciences. 6, 178 (2019).
- Li, X., Zhang, Y., Qi, G. Evaluation of isolation methods and culture conditions for rat bone marrow mesenchymal stem cells. Cytotechnology. 65 (3), 323-334 (2013).
- Kagami, H., Agata, H., Tojo, A. Bone marrow stromal cells (bone marrow-derived multipotent mesenchymal stromal cells) for bone tissue engineering: basic science to clinical translation. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 43 (3), 286-289 (2011).
- Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
- Abdallah, B. M., Alzahrani, A. M., Abdel-Moneim, A. M., Ditzel, N., Kassem, M. A simple and reliable protocol for long-term culture of murine bone marrow stromal(mesenchymal) stem cells that retained their in vitro and in vivo stemness in long-term culture. Biology Proceedings Online. 21, 3 (2019).
