Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Een in vitro single-molecule imaging assay voor de analyse van cap-afhankelijke vertaalkinetiek

Published: September 15, 2020 doi: 10.3791/61648
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Molecular Biology Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center
* These authors contributed equally

Summary

Het volgen van individuele vertaalgebeurtenissen maakt kinetische studies met hoge resolutie van cap-afhankelijke vertaalmechanismen mogelijk. Hier demonstreren we een in vitro single-molecule assay op basis van beeldvormende interacties tussen fluorescerend gelabelde antilichamen en epitoop-gelabelde ontluikende peptiden. Deze methode maakt single-molecule karakterisering van initiatie en peptide rekkinetiek mogelijk tijdens actieve in vitro cap-afhankelijke vertaling.

Abstract

Cap-afhankelijke eiwitsynthese is de overheersende vertaalroute in eukaryotische cellen. Hoewel verschillende biochemische en genetische benaderingen uitgebreide studies van cap-afhankelijke vertaling en de regulering ervan mogelijk hebben maken, ontbreekt het nog steeds aan kinetische karakterisering van deze vertaalroute met hoge resolutie. Onlangs hebben we een in vitro test ontwikkeld om cap-afhankelijke vertaalkinetiek met single-molecule resolutie te meten. De test is gebaseerd op fluorescerend gelabeld antilichaambinding aan ontluikend epitoop-gelabeld polypeptide. Door de binding en dissociatie van antilichamen van en naar ontluikende peptide-ribosoom-mRNA-complexen in beeld te brengen, kan de vertaalprogressie op individuele mRNAs worden gevolgd. Hier presenteren we een protocol voor het vaststellen van deze test, inclusief mRNA- en PEGylated-diapreparaten, realtime beeldvorming van vertaling en analyse van trajecten met één molecuul. Deze test maakt het mogelijk om individuele cap-afhankelijke vertaalgebeurtenissen te volgen en lost belangrijke vertaalkinetiek op, zoals initiatie- en reksnelheden. De test kan op grote schaal worden toegepast op verschillende vertaalsystemen en zou in grote lijnen ten goede moeten komen aan in vitro studies van cap-afhankelijke vertaalkinetiek en translationele controlemechanismen.

Introduction

Vertaling in eukaryotische systemen vindt voornamelijk plaats via 7-methylguanosine (m7G) cap-afhankelijke trajecten1. Studies tonen aan dat de initiatiestap van eukaryotische vertaling tariefbeperkend is en een gemeenschappelijk doel voor voorschrift2,3,4. Mechanismen van cap-afhankelijke vertaling zijn uitgebreid bestudeerd met behulp van genetische5,biochemische6,7,8,structurele9en genomische10 bulkbenaderingen. Hoewel deze methoden verschillende mechanismen hebben geïdentificeerd die cap-afhankelijke initiatie reguleren, beperkt hun resolutie ze tot ensemble-middeling van signalen van heterogene en asynchrone initiatiegebeurtenissen. Meer recentelijk zijn individuele in vivo vertaalgebeurtenissen gevisualiseerd door methoden die fluorescerende antilichamen meten die zich binden aan epitopen op ontluikende polypeptiden11,12,13,14. Deze nieuwe benaderingen zijn echter ook beperkt in hun vermogen om individuele initiatiegebeurtenissen op te lossen, omdat meerdere fluorescerende antilichamen een ontluikend peptide moeten binden om enkelvoudige vertaalgebeurtenissen op te lossen vanuit een hoge intracellulaire fluorescentieachtergrond. In veel biologische interacties hebben opgeloste individuele kinetische gebeurtenissen kritische inzichten opgeleverd in het begrijpen van complexe multistep en repetitieve biologische processen die niet kunnen worden gesynchroniseerd op moleculair niveau. Nieuwe methoden die de dynamiek van individuele vertaalgebeurtenissen kunnen volgen, zijn nodig voor een beter begrip van cap-afhankelijke initiatie en regulering.

We hebben onlangs een in vitro test ontwikkeld die cap-afhankelijke initiatiekinetiek meet met single-molecule resolutie15. Gezien het grote aantal bekende en onbekende eiwitfactoren die betrokken zijn bij dit initiatietraject3,16, werd de test met één molecuul ontwikkeld om compatibel te zijn met bestaande in vitro celvrije vertaalsystemen om te profiteren van hun behoud van cellulaire factoren en robuuste vertaalactiviteit17,18,19,20,21,22,23,24,25. Bovendien maakt het gebruik van celvrije vertaalsystemen meer compatibele vergelijkingen mogelijk tussen waarnemingen met één molecuul en eerdere bulkresultaten. Deze aanpak biedt een eenvoudige integratie van nieuwe kinetische inzichten met één molecuul in het bestaande mechanistische kader van cap-afhankelijke initiatie. Om de test met één molecuul vast te stellen, wordt het traditionele celvrije vertaalsysteem op drie manieren gewijzigd: een epitoopcoderingssequentie wordt ingevoegd aan het begin van het open leeskader (ORF) van een reporter mRNA; het 3′-uiteinde van het reporter-mRNA wordt gebiotinyleerd om mRNA-eindtenthering aan het detectieoppervlak met één molecuul te vergemakkelijken; en fluorescerend gelabelde antilichamen worden aangevuld met het vertaalextract. Deze modificaties vereisen alleen basismoleculaire biologietechnieken en algemeen beschikbare reagentia. Bovendien behouden deze modificaties en de beeldvormingsomstandigheden met één molecuul de vertaalkinetiek van bulkcelvrije vertaalreacties15.

In deze test(figuur 1)wordt 5′-end capped en 3′-end biotinylated reporter mRNA geïmmobiliseerd naar een met streptavidine bedekt detectieoppervlak in een flowkamer. De stromingskamer wordt vervolgens gevuld met een celvrij vertaalmengsel aangevuld met fluorescerend gelabelde antilichamen. Nadat mRNA-vertaling heeft plaatsgevonden gedurende ongeveer 30-40 codons stroomafwaarts van de epitoopsequentie26,27, komt de epitoop uit de ribosoomuitgangstunnel en wordt toegankelijk voor interactie met fluorescerend gelabeld antilichaam. Deze interactie is snel en de detectie ervan door fluorescentiebeeldvormingstechnieken met één molecuul maakt het mogelijk om vertaalkinetiek met een enkele molecuulresolutie te volgen tijdens actieve celvrije vertaling. Deze test zou in grote lijnen ten goede moeten komen aan in vitro studies van cap-afhankelijke vertaalkinetiek en de regulering ervan, met name voor systemen met een werkende bulk in-vitrotest.

Een voorwaarde voor het vaststellen van deze test met één molecuul is een werkende bulkcelvrije vertaaltest, die kan worden bereikt met behulp van vertaalextract dat in de handel verkrijgbaar is of is bereid volgens eerder beschreven methoden28. Eukaryotisch vertaalextract kan worden verkregen uit verschillende cellen, waaronder schimmel, zoogdieren en planten28. Voor beeldvorming vereist deze test een TIRF-microscoop die is uitgerust met afstembare laserintensiteit en incidenthoek, een gemotoriseerd monsterstadium, een gemotoriseerd vloeistofsysteem en een monstertemperatuurregelingsapparaat. Dergelijke vereisten zijn generiek voor moderne in vitro TIRF-experimenten met één molecuul en kunnen anders worden bereikt. Het hier gepresenteerde experiment maakt gebruik van een objectief TIRF-systeem dat bestaat uit in de handel verkrijgde microscoop, software en accessoires die allemaal in de tabel met materialenworden vermeld.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Generatie verslaggever mRNA

  1. Wijzig een DNA-transcriptiesjabloon die codeert voor een bulktest "untagged" reporter mRNA door een N-terminus epitoop tag-coderingssequentie in te voegen om een DNA-transcriptiesjabloon te genereren voor een "gelabelde" reporter mRNA (Figuur 2A).
    OPMERKING: 3xFLAG/anti-FLAG interactie wordt aanbevolen voor deze test vanwege de superieure gevoeligheid en de korte 3xFLAG tag lengte. De test is echter compatibel met andere epitoop-/antilichaamparen.
  2. Synthetiseer ongetikte en getagde RNA's met behulp van lineaire DNA-sjablonen en een in vitro transcriptiekit (zie materiaaltabel). Doorgaans is 10-20 pmol in vitro getranscribeerd RNA voldoende voor latere RNA-verwerking om een systematische studie met één molecuul mogelijk te maken.
  3. Sluit het RNA 5′ uiteinde (figuur 2B) af met een m7G afdekset (zie materiaaltabel) volgens de aanbeveling van de fabrikant.
  4. Biotinylaat het RNA 3′ uiteinde (figuur 2B) met behulp van een biotinyleringskit (zie materiaaltabel) volgens het protocol dat bij de kit is geleverd. Zuiver RNA's door fenol-chloroform extractie gevolgd door zuivering met een spinkolom. Elute RNA in 10–20 μL RNase-vrij water. Ongeveer 40-50% van de niet-geappte input RNA wordt teruggewonnen.
  5. Beoordeel de integriteit en concentratie van RNA door elektroforese van acrylamidegel en RNA-kleuring te denatureren, zoals eerder beschreven29.
  6. Voer bulkcelvrije vertaling30 uit met de 3′-end-biotinylated tagged reporter mRNA om te bevestigen dat de gewijzigde mRNA de vertaaleigenschappen behoudt die van belang zijn. Als voorbeeld kan cap-afhankelijke vertaling worden bevestigd door reporteractiviteiten in bulkcelvrije vertaalreacties te meten en te vergelijken met niet-geappte en afgetopte reporter-mRNAs (zie Representatieve resultaten).

2. Voorbereiding van de stromingskamer

  1. Selecteer een geschikte dikte van de afdeklip, zoals gespecificeerd door het specificatieblad van de microscoopdoelstelling. Selecteer een glas- of kwartsschuif voor respectievelijk objectieve of prisma-achtige totale interne reflectiefluorescentie (TIRF) beeldvormingssystemen31.
  2. Voer reiniging, verzilting, PEGylation en kamerassemblage van coverslip en slide uit volgens het protocol beschreven door Chandradoss et al.32 met de volgende wijzigingen.
    1. Was dia's met geboorde gaten in 10% alkalisch vloeibaar reinigingsmiddel (v/v) gedurende 20 minuten met sonicatie. Combineer de dia's en coverslips voor alle resterende reinigingsstappen.
    2. Sla de acetonwasstap over. Verleng de incubatietijd van de Piranha ets van 20 min naar 1 uur. Incubeer de eerste ronde PEGylation gedurende 3 uur. Incubeer de tweede ronde PEGylation met MS(PEG)4 gedurende 3 uur.

3. Voorbereiding van apparatuur

  1. Ten minste 3 uur voordat u een experiment met één molecuul uitvoert, schakelt u de microscoopincubator in en vermindert u de luchtstroom tot een lage snelheid om overmatige akoestische verstoring van experimenten te voorkomen. Stel de incubatortemperatuur in op de optimale temperatuur voor het celvrije vertaalsysteem.
    OPMERKING: Vertaling is extreem gevoelig voor temperatuur. De optimale reactietemperatuur is specifiek voor elk celextractsysteem. Reactietemperatuurkarakterisering is een essentiële stap in de ontwikkeling van een bulkcelvrij vertaalsysteem. Deze test met één molecuul moet worden uitgevoerd onder dezelfde optimale temperatuur als de overeenkomstige bulkvertalingsvoorwaarde.
  2. Ten minste 1 uur voordat u een experiment met één molecuul uitvoert, schakelt u de laser in door op de laseraan/uit-knop achter de laserbox te drukken, de laserveiligheidstoets te draaien en op de startknop te drukken; schakel de microscoop in en tik op het bedieningspaneel van het aanraakscherm om de beeldmodus, doelstelling en filterset te selecteren.
  3. Schakel de EMCCD-camera, de prior stage controller en de spuitpomp in door op hun aan/uit-knoppen te drukken. Schakel de computer in en open software Andor Solis (software 1) om de EMCCD-camera te bedienen, TirfCtrl (software 2) om de laser te bedienen, PriorTest (software 3) om de gemotoriseerde fase te regelen en Coolterm om de spuitpomp te bedienen. Laat de camera afkoelen en stabiliseren tot de aangegeven werktemperatuur voordat de gegevensverzameling begint.
  4. Controleer in software 2 of de juiste parameters zijn ingesteld voor lasergolflengte, objectief type en brekingsindex van glas en monster. Klik op de knop Verbinden. Als u de laserintensiteit wilt instellen, klikt u op de knop Controle naast de lasergolflengte en sleept u vervolgens in het pop-upvenster voor laserbesturing de schuifbalk voor intensiteit. Stel de laser in op de gewenste hoek door de schuifbalk van de vezelpositie te slepen of de bijbehorende penetratiediepte in te voeren. Zorg ervoor dat het sluitervak is ingeschakeld om de laser in de uit-modus te houden wanneer u geen beeldvorming maakt.
    OPMERKING: Open en sluit de lasersluiter door het vak Sluiter aan te vinken. Bij de eerste vaststelling van de test moeten verschillende laserintensiteiten en incidenthoeken worden getest voor optimale detectie met één molecuul. De optimale laserintensiteit balanceert heldere fluorescentie met één molecuul en snelle fotobleaching van de fluoroforen. De incidenthoek moet buiten de kritische hoek worden verhoogd om de hoge fluorescerende achtergrond van de diffuserende gelabelde antilichamen te verminderen totdat mRNA-gebonden antilichamen duidelijk zijn opgelost. Als referentie werd een laser van 532 nm ingesteld op 10 μW bij het doel, waarbij de laserincidenthoek was ingesteld op 71,5° in een studie15 met cy3-gelabelde antivlag met een etiketteringsverhouding van 2-7 kleurstoffen per antilichaam.
  5. Kies in software 1 Kinetic onder de acquisitiemodus, voer de parameters in voor belichtingstijd, kinetische serielengte en EM-versterkingswaarde. Kies de map en wijs bestandsnamen toe voor het opslaan van het gegevensbestand.
  6. Stel de spuitpomp in op een bescheiden tot snel debiet voor de volgende wasstap van de slang.
    Pipetteer een aliquot van 70% ethanol in een microfugebuis, steek het buisuiteinde van de spuitpomp in de ethanoloplossing en gebruik Coolterm om de spuitpomp drie keer tussen terugtrek- en doseermodi te schakelen om de slang te wassen. Herhaal dit met RNase-vrij water.
    OPMERKING: De buislengte moet lang genoeg zijn om de vertaalmix bij stap 5 te kunnen afgeven om alleen contact te maken met de slang, niet met de spuit. Het spoelvolume moet hier groter zijn dan het volume van de gedoseerde vertaalmix om ervoor te zorgen dat de vertaalmix bij stap 5 in contact blijft met gereinigde slangen.
  7. Nadat de laatste waterspoeling is afgegeven, verwijdert u het resterende water van de binnenkant van de slang door het uiteinde van de slang op een schoon tissuedoekje te dabben. Houd het uiteinde van de slang droog door het in een schone microfugebuis te plaatsen.

4. Immobilisatie van 3′-end biotinylated mRNA

  1. Houd het celextract en de vertaalmix bevroren op droog ijs tot vlak voor gebruik. Ontdooi de resterende bevroren reagentia en houd ze op ijs.
  2. Plaats de stromingskamer in de microscoopmonsterhouder met de afdeklipzijde naar beneden gericht en zet deze vast met tape. Gebruik tape om de in- en uitgangen van stroomkanalen die niet in gebruik zijn te bedekken.
  3. Pipetteer een 1,5x volume (ten opzichte van kanaalvolume; geldt ook voor andere stappen in stap 4 en stap 5) van 0,2 mg/ml streptavidine in het stromingskanaal en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Om ongebonden streptavidine te verwijderen, wast u het kanaal driemaal door een 3x volume T50 wasbuffer (20 mM Tris HCl, pH 7,0, 50 mM NaCl, 0,2 U/μL RNase inhibitiereagens) per wasbeurt in te pipetten.
    OPMERKING: Het is belangrijk om te voorkomen dat vloeibaar afval terugstroomt in het kanaal. Als de uitlaat van het stroomkanaal niet is aangesloten op een afvalinzamelingsbuis, plaatst u een gevouwen tissuepapier in de buurt van de uitlaat om de vloeistof te absorberen die uit het kanaal stroomt.
  5. Breng het vertaalextract over en meng van droog ijs naar ijs en laat ze ontdooien.
  6. Zet een druppel onderdompelingsolie op het doel. Plaats de microscoopmonsterhouder met de stromingskamer in het microscoopstadium. Breng het objectief dicht bij de afdeklip totdat de onderdompelingsolie op de objectieve contact maakt met de afdeklip. Verplaats de monsterfase zodat de positie van het stroomkanaal zich direct boven de objectieve lens bevindt.
  7. Open in software 2 de lasersluiter en pas het laserintensiteitsniveau aan.
  8. Selecteer op het aanraakscherm van de microscoopbediening het tabblad Scherpstellen en klik op de knop Zoeken en starten. Een pieptoon wordt gehoord wanneer een scherpstelvlak met succes wordt bereikt.
  9. Afbeelding van het stroomkanaaloppervlak in de livemodus in software 1. Optimaliseer de scherpstelling voor een scherper beeld door de objectieve positie aan te passen met de fijne stapbediening op het aanraakscherm.
  10. Verplaats in software 3 de fase om het niveau van fluorescentieachtergrond op verschillende gebieden van het detectieoppervlak van het stroomkanaal te evalueren. Als de fluorescentie laag is, gaat u verder met het experiment. Als de fluorescentieachtergrond te hoog is, kunt u overwegen het stroomkanaal weg te gooien.
  11. Sluit in software 2 de lasersluiter.
  12. Pipetteer de T50 wasbuffer uit het stromingskanaal en pipetteer onmiddellijk in een 2x volume biotinylated mRNA-oplossing naar het stroomkanaal. Incubeer gedurende 15 minuten.
    OPMERKING: Voor elke partij mRNA-preparaat moeten mRNA-concentraties en incubatietijden worden getest om de mRNA-oppervlaktedichtheid te bereiken die nodig is voor detectie met één molecuul. Geschikte mRNA-oppervlaktedichtheid bemiddelt antilichaambinding die fluorescerende vlekken vertoont met niet meer dan ~ 5% overlappende (zie representatieve resultaten). Als uitgangspunt wordt biogetinyleerd mRNA bij een concentratie van 2–20 nM aanbevolen.
  13. Was het kanaal drie keer door een 3x volume vertaalcompatibele buffer per wasbeurt te pipetten.

5. Vertaalmixassemblage en levering aan een stroomkanaal voor detectie met één molecuul

  1. Op ijs, assembleer 3x volumes van de vertaalmix30 in een microcentrifugebuis volgens het bulkvertalingsprotocol vanaf stap 1.7, behalve mRNA weglaten en aanvullen met een geoptimaliseerde concentratie fluorescerend gelabelde antilichamen. Draai de microcentrifugebuis kort om de vertaalmix aan de onderkant van de buis te verzamelen.
    OPMERKING: Bij het vaststellen van de test worden verschillende antilichaamconcentraties getest. De optimale concentratie toont lage hoeveelheden niet-specifiek antilichaam dat zich bindt aan het detectieoppervlak en snelle antilichaambinding aan het ontluikende peptide (zie respectievelijk stappen 7.1. en 7.2 voor kalibratiedetails).
  2. Breng de vertaalmix over naar de binnenkant van een 0,7 ml microfuge buisdop. Zet de spuitpomp in de terugtrekmodus. Steek het uiteinde van de pompslang in de vertaalmix. Start de spuitonttrekking om de vertaalmix in de pompslang te verzamelen. Draai de instelling van de spuitpomp terug naar de doseermodus en stel de stroom in op een optimale snelheid voor de levering van vertaalmengsels.
    OPMERKING: Vermijd het genereren van bellen in de vertaalmix wanneer u deze in de pompslang overbrengt. Vermijd het terugtrekken van de vertaalmix te diep in het deel van de slang dat niet is gereinigd en gespoeld in stap 3.6. Bij het vaststellen van de test worden verschillende leveringsdebieten getest om de optimale snelheid te bepalen (zie stap 6.2. voor meer informatie over de kalibratie van de test).
  3. Als er een opening is tussen het slangeinde en het vertaalmengsel, start u de spuitpomp en laat u het vertaalmengsel het slangeinde bereiken en stopt u de spuitpomp.
  4. Steek het uiteinde van de pompslang in de inlaat van het stromingskanaal. Vermijd het introduceren van luchtbellen in de vertaalmix bij het uitvoeren van de verbinding. Stabiliseer de verbinding door de op maat gemaakte metalen beugel op de microscoopmonsterhouderplaat te schroeven. Beoordeel de microscoopfocus en fluorescentie van het beeldgebied.
    OPMERKING: De slang kan met een aangepast onderdeel zoals eerder beschreven33aan de stromingskamer worden geklemd. Voor deze test kunnen ook andere soorten fluidics-systemen worden gebruikt34. Het gezichtsveld moet voor en na het aansluiten van de slang vergelijkbaar lijken. Als er na de aansluiting meer fluorescerende vlekken verschijnen, lekt de vertaalmix waarschijnlijk uit de aanvoerslang. Afhankelijk van de toepassing moet het kanaal met gelekte vertaalmix mogelijk worden weggegooid.
  5. Controleer of de parameters voor het verkrijgen van films correct zijn en of de juiste bestandsnaam en map zijn ingevoerd voor het opslaan van bestanden.
  6. Verplaats het werkgebied om een gebied in het midden van het detectieoppervlak van het stroomkanaal in beeld te brengen. Selecteer op het aanraakscherm van de microscoopbediening het tabblad Continue AF en klik op de knop Scherpstellen zoeken en starten om de brandpuntspositie tijdens het experiment te behouden. Een pieptoon wordt gehoord wanneer een scherpstelvlak met succes wordt bereikt.
  7. Open in software 2 de lasersluiter. Klik in software 1 op de knop Signaal nemen om de opname te starten. Voer na ongeveer 5 s opname de opdracht Uitvoeren in Coolterm in om de vertaalmix in het stroomkanaal te leveren. Neem op tot 2 uur met een tijdresolutie van 0,5-2 s/frame.
    OPMERKING: De maximale periode van gegevensverzameling hangt af van hoe snel het vertaalextract in de loop van de tijd activiteit verliest, wat gemakkelijk kan worden gekenmerkt door het uitvoeren van bulkcelvrije vertaling met luciferasereporter mRNA en het meten van luciferaseactiviteit in de vertaalreacties op verschillende tijdstippen35.
  8. Wanneer de gegevensverzameling is voltooid, schakelt u de laser uit, schakelt u de continue AF op het aanraakscherm van de microscoopbesturing uit en demonteert u de slang uit de stroomkamer.
  9. Pipetteer het vertaalmengsel uit de inlaat van het stroomkanaal, breng het over naar een microfugebuis en vries de oplossing in door de buis in vloeibare stikstof te plaatsen. Later bewaren bij -80 °C.
  10. Was de spuitpompslang drie keer met RNase-vrij water en vervolgens drie keer met 70% ethanol. Neem 70% ethanol op in de slang van de spuitpomp voor opslag.
  11. Zet de microscoop en alle accessoires uit. opschonen.

6. Gegevensanalyse

OPMERKING: Gegevensanalyse voor deze test vereist gemeenschappelijke methoden in biofysische studies met één molecuul. Alle rekenintensieve stappen kunnen worden bereikt met behulp van bestaande algoritmen en software (verwijzingen worden hieronder opgenomen in de bijbehorende stappen).

  1. Optioneel: Converteer, indien van toepassing, het verkregen bestand uit de afbeeldingsreeks naar een indeling die compatibel is met de gekozen beeldverwerkingssoftware of programmeertaal.
  2. Bepaal het beginpunt van de vertaalreactie en de uitwisselingstijd van het reagens.
    OPMERKING: Als gevolg van de diffuserende fluorescerende antilichamen in de vertaalmix zal de achtergrondfluorescentie-intensiteit van een afgebeeld gebied toenemen tijdens de in-channel reagensuitwisseling van vertaalcompatibele buffer naar vertaalmix. Het beginpunt van de vertaalreactie wordt ingesteld als het tijdstip waarop de reagensuitwisseling is voltooid. Dit voltooiingspunt wordt gevonden door de achtergrondfluorescentie-intensiteit tijdens de levering van de vertaalmix te meten en het tijdstip te identificeren waarop de toenemende fluorescentie-intensiteitplateaus 15, zoals hieronder beschreven.
    1. Bereken het totale fluorescentieaantal per afbeeldingskader en plot het bijbehorende tijdsprofiel. Identificeer de plotselinge toename van de totale fluorescentie in het tijdprofielplot.
      OPMERKING: De totale fluorescentiestijging is te wijten aan de toenemende concentratie fluorescerend gelabeld antilichaam tijdens de uitwisseling van reagentia.
    2. Identificeer het eindpunt van de totale fluorescentieverhogingsfase en stel dit tijdspunt in als het beginpunt (d.w.z. tijd 0) van de vertaalreactie. Identificeer zowel de begin- als eindpunten van de totale fluorescentieverhogingsfase en stel het tijdsverschil in als de uitwisselingstijd van het reagens.
      OPMERKING: De totale tijdspanne van de uitwisseling van reagentia is afhankelijk van de afmetingen van het stroomkanaal en het geselecteerde debiet. Het is mogelijk dat sommige vertaalfactoren zich aan mRNA binden voordat de reagensuitwisseling is voltooid, wat de resolutie van de bepaalde initiatietijd in de eerste ronde zou kunnen verminderen. Het wordt daarom aanbevolen om verschillende debieten te testen bij het instellen van de test en debieten te selecteren waarmee reagensuitwisseling binnen 3-4 s kan worden voltooid voor gegevensverwervingssnelheden van 0,5-2 s/frame.
  3. Optioneel: Film driftcorrectie uitvoeren.
    OPMERKING: De posities van gebonden antilichamen in het gegevensbeeld kunnen in de loop van de tijd veranderen als gevolg van drift van microscooponderdelen en accessoires. Drift die visueel merkbaar is in een film vereist correctie voordat verder wordt gaan met gegevensanalyse. Verschillende algoritmen en scripts voor ruimtelijke driftcorrectie zijn beschikbaar36,37,38.
    1. Zoek in elke afbeelding de lokale maxima in pixeltellingen om de posities van gebonden antilichamen in elk frame met nauwkeurigheid op pixelniveau te bepalen. Stel een drempel in voor het aantal pixels, zodat alleen vlekken worden geselecteerd die duidelijk boven de achtergrondruis liggen.
    2. Bereken de veranderingen van individuele antilichaamposities in elke richting tussen twee opeenvolgende afbeeldingskaders.
    3. Plot het histogram van antilichaampositionele veranderingen tussen twee opeenvolgende frames en doe dit afzonderlijk voor elke richting. Gaussian paste bij elk histogram en stelde de middenpositie van pieken in als de richtingsafwijking tussen twee opeenvolgende frames.
    4. Om de waargenomen drift tegen te gaan, verplaatst u elk afbeeldingskader in de tegenovergestelde richting door de berekende drifthoeveelheid.
  4. Construeren van trajecten met één molecuul.
    OPMERKING: Detectie-/trackingsoftware is beschikbaar om heldere vlekken te identificeren en hun intensiteiten te extraheren uit gegevensafbeeldingsreeksen39,40.
    1. Identificeer antilichaamposities zoals beschreven in stap 6.3.1.
      OPMERKING: Visuele inspectie wordt aanbevolen om ervoor te zorgen dat de gekozen drempelwaarde geen aanleiding geeft tot overmatige over- of onderpluk van deeltjes. Visuele inspectie kan worden bereikt door de geïdentificeerde zwaartepuntposities over elk afbeeldingskader te bedekken en hun overeenkomst visueel te beoordelen (zie Representatieve resultaten).
    2. Combineer de geplukte deeltjes uit alle frames en verwijder de overtollige deeltjesposities.
    3. Inspecteer visueel de afbeeldingen van gebonden antilichamen en selecteer een vierkant gebied dat de pixels omsluit met tellingen die duidelijk boven de achtergrond liggen en representatief zijn voor individueel gebonden antilichamen.
      OPMERKING: De puntspreidingsfunctie (d.w.z. de grootte van het vierkant voor één molecuul) wordt bepaald door de optische opstelling en de pixelgrootte van de detector.
    4. Construeer voor elke deeltjespositie een traject met één molecuul door de totale intensiteit van alle pixels in het vierkante gebied rond de deeltjespositie te berekenen. Trajecten worden geconstrueerd voor elke positie, frame voor frame en voor de hele gegevensfilm.
  5. Optioneel: Pas een niet-lineair voorwaarts-achterwaarts filter41 toe om achtergrondruis in trajecten met één molecuul te verminderen.
  6. Optioneel: Digitaliseer trajecten met bestaande stapdetectiealgoritmen42,43,44,45.
    OPMERKING: De keuze van het stapdetectiealgoritme hangt af van de complexiteit van de dynamiek met één molecuul. Voor het eenvoudigste scenario van alleen geïsoleerde ribosoomvertaling (d.w.z. geen polysoomvorming) en een goede signaal-ruisverhouding is een drempeltoepassing op de fluorescentietellingen voldoende om de timing van antilichaambindings- en dissociatiegebeurtenissen in de trajecten met één molecuul te identificeren. Visuele inspectie van ten minste 100 trajecten voor elke aandoening wordt aanbevolen om ervoor te zorgen dat trajectstappen op de juiste manier zijn geselecteerd door een stapdetectiestrategie.
  7. Bepaal het tijdstip van de eerste antilichaambindingsgebeurtenis voor elk traject (d.w.z. de eerste aankomsttijd, t1), hetzij met behulp van gedigitaliseerde trajecten, hetzij met behulp van een drempel voor niet-verontwaardigde trajecten.
    OPMERKING: De mediaanwaarde van de distributie van de eerste aankomsttijd kan worden vergeleken tussen verschillende vertaalvoorwaarden. Als alternatief kan de eerste aankomsttijdverdeling worden ingesteld op een verschoven (3-parameter) log-normal-functie om de gemiddelde waarde15 <t1> te bepalen. Omdat de verdeling van de eerste aankomsttijd meestal scheef is en een lange staart heeft, berekent u het gemiddelde niet door direct te gemiddelden over de waargenomen eerste aankomsttijden.
  8. Optioneel: Dwell tijd analyse en berekening van de gemiddelde peptide synthese snelheid.
    1. Gebruik gedigitaliseerde trajecten om monosomale (enkelvoudige ribosoom) vertaalgebeurtenissen in elk traject te identificeren en bereken de verblijftijden van één bindingsgebeurtenis als het tijdsverschil tussen overeenkomstige antilichaambindings- en dissociatiegebeurtenissen.
      OPMERKING: Stapdetectiealgoritmen voor het digitaliseren van trajecten zijn over het algemeen minder betrouwbaar wanneer meerdere moleculaire gebeurtenissen elkaar in de tijd overlappen. Het uitsluiten van polysoomgebeurtenissen uit de tijdanalyse van de verblijftijd wordt daarom aanbevolen. Voor zeer actieve vertaalsystemen die zijn verrijkt met polysoomgebeurtenissen en zelden monosomale gebeurtenissen vertonen, kan een mengsel van gelabelde en niet-gelabelde antilichamen worden gebruikt om de kans op het observeren van geïsoleerde vertaalgebeurtenissen in trajecten met één molecuul te vergroten.
    2. Pas de verdeling aan op een log-normale functie en gebruik de gemonteerde functie om de gemiddelde verblijftijd te berekenen.
      OPMERKING: Het berekenen van het gemiddelde direct door middeling van de waargenomen verblijftijden wordt niet aanbevolen omdat de verblijftijdverdelingen meestal scheef staan met lange staarten.
    3. Bepaal het aantal aminozuren dat wordt vertaald tijdens de antilichaambindingstijd door de som van de lengte van het epitoopaminozuur en 35 (de gemiddelde aminozuurlengte van ontluikend peptide in de ribosoomuitgangstunnel) af te trekken van het totale aantal ORF-codons.
    4. Om de gemiddelde peptidesynthesesnelheid te bepalen, deelt u het aantal vertaalde aminozuren door de gemiddelde verblijftijd.
  9. Optioneel: Berekening van de gemiddelde initiatietijd in de eerste ronde (<t1_I>).
    OPMERKING: Initiatie- en rekomstandigheden, zoals de context van de initiatieplaatssequentie en de coderingssequentie, worden over het algemeen opzettelijk bewaard voor studies van initiatiekinetiek. Daarom de gemiddelde eerste aankomsttijd <t1> vanaf stap 6.7. kan rechtstreeks worden gebruikt om de verandering in de initiatiekinetiek van de eerste ronde tussen verschillende omstandigheden te berekenen. De volgende correctie is alleen nodig voor het bepalen van de werkelijke waarde van de initiatietijd van de eerste ronde.
    1. Deel de som van de epitooplengte en 35 (de gemiddelde aminozuurlengte van ontluikend peptide in de ribosoomuitgangstunnel) door de gemiddelde peptidesynthesesnelheid (vanaf stap 6.8.4.) om de gemiddelde peptideverlengingstijd van dit N-terminale gebied te berekenen (<t1_tag>).
    2. Aangezien de eerste aankomsttijd de som is van de initiatietijd van de eerste ronde en t1_tag, trekt u <t1_tag> af van de gemiddelde eerste aankomsttijd <t1> om de gemiddelde initiatietijd in de eerste ronde te berekenen <t1_I>: <t1_I> = <t1> - <t1_tag>

7. Kalibratie van de test

OPMERKING: Voer de volgende kalibratiestappen uit bij het in eerste instantie vaststellen van de test.

  1. Om de specificiteit van de antilichaambinding te onderzoeken, voert u de protocolstappen in de secties 4 en 5 afzonderlijk uit voor niet-gelabelde en gelabelde mRNAs (figuur 2). De antilichaambindingsniveaus in kanalen met deze respectieve mRNAs vertegenwoordigen de mate van niet-specifieke antilichaambinding aan het detectieoppervlak en specifieke antilichaambinding aan ontluikende peptiden.
    OPMERKING: De specifieke tot niet-specifieke bindingsverhouding wordt aanbevolen om >10 te zijn en kan worden verhoogd met verschillende oppervlakte passiveringsstrategieën, lagere antilichaamconcentratie of hogere mRNA-oppervlaktedichtheid.
  2. Om de snelheid van antilichaambinding te meten, voert u het protocol uit met een extra stap tussen stap 4 en stap 5.
    1. Na stap 4, incubeer het kanaal met vertaalmengsel dat antilichaam mist om vooraf mRNA / ribosoom / peptidecomplexen te genereren.
    2. Ga vervolgens verder met stap 5 en voer het met antilichamen aangevulde vertaalmengsel in het kanaal.
    3. Kwantificeer de gemiddelde antilichaambindingssnelheid voor vooraf gegenereerd ontluikend peptide met exponentiële aanpassing aan het histogram van de eerste aankomsttijd.
      OPMERKING: Antilichaambinding aan voorgegenereerd peptide moet snel zijn, in de orde van seconden, en moet sneller zijn dan de vertaalkinetiek. Een hogere antilichaamconcentratie kan worden gebruikt om de bindingssnelheid van antilichamen te verhogen.
  3. Fotostabiliteit van fluorofoor-gelabeld antilichaam.
    1. Bereid een dia voor volgens het protocol in stap 2, maar sla de PEGylation-stap over. Monteer de debietkamer na de verziltingsstap. De silaancoating maakt een efficiënte niet-specifieke antilichaambinding aan het detectieoppervlak mogelijk.
    2. Voeg de fluorescerend gelabelde antilichamen toe aan het kanaal om een enkele molecuuldichtheid van niet-specifieke antilichamen te bereiken die zich binden aan het detectieoppervlak. Begin met het toevoegen van fluorescerend gelabeld antilichaam dat sterk wordt verdund in T50-wasbuffer en verhoog geleidelijk de antilichaamconcentratie totdat de gewenste dichtheid van één molecuul is bereikt.
    3. Beeld het detectieoppervlak in totdat het grootste deel van de fluorescentie van het antilichaam niet langer detecteerbaar is.
    4. Beraam het totale aantal zichtbare antilichamen in de loop van de tijd om de snelheid van fluorescentieverlies van antilichamen als gevolg van fluorofoorfotobleaching te beoordelen.
      OPMERKING: Antilichaametikettering levert meestal meerdere fluoroforen per antilichaam op. Individuele antilichamen blijven detecteerbaar totdat alle geconjugeerde fluoroforen fotobleach.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Volgens het beschreven protocol kunnen individuele antilichaaminteracties met ontluikende N-terminal-gelabelde polypeptiden met single-molecule resolutie worden gebeeldomd tijdens actieve celvrije vertaling van 3' end-tethered reporter mRNA (Figuur 1). Een minimaal demonstratie-experiment wordt gerapporteerd met het gebruik van drie synthetische mRNAs: LUC (codering untagged luciferase), LUCFLAG (codering 3xFLAG-gelabeld luciferase) en hp-LUCFLAG (LUCFLAG met een stabiele stamlus in de 5' leader regio) ( Figuur2C). Het gebruik van luciferase-codering mRNA maakt vergelijkingen mogelijk tussen waarnemingen met één molecuul en bulkluminescentiemetingen. De integriteit van 3' biotinylated mRNA werd beoordeeld door denaturerende polyacrylamidegelelektroforese (PAGE) en RNA-kleuring. MRNA van goede kwaliteit toont één enkele schone band en mag geen extra snellere migrerende signalen vertonen (figuur 3A). Saccharomyces cerevisiae vertaalextract werd hier gebruikt en bereid volgens een protocol dat eerder werd beschreven30 en gewijzigd15. Bulkmetingen van luciferaseactiviteit in celvrije vertaalreacties met het gistextract en biotinylated LUCFLAG mRNA dat een m7G-dop mist of bevat, tonen dopstimulatie van LUCFLAG mRNA-vertaling ( Figuur3B).

Voor beeldvorming met één molecuul werd het vertaalextract aangevuld met 67 nM cy3-gelabeld antivlagantilichaam (Cy3-αFLAG). Dit antilichaam had een hoge etiketteringsverhouding van 2-7 kleurstoffen per antilichaam. De 532 nm laser werd ingesteld op 10 μW bij het doel. De laserincidenthoek was ingesteld op 71,5°, wat groter was dan de kritische hoek van 63,8° voor onze opstelling. Er werd een laag fluorescentieniveau in beeld brengen van detectieoppervlakken die mRNA bevatten, maar geen vertaalmix hebben (figuur 4A). Voor kanaalafmetingen van ongeveer 2 mm (breedte) x 50 μm (diepte) x 24 mm (lengte) leverde een debiet van 150 μl/min een omruiltijd van het reagens op van 3 – 4 s. Binnen 5 s na de levering van de vertaalmix neemt het achtergrondfluorescentieniveau toe als gevolg van de diffuserende fluorescerende antilichamen. Ongeveer 2 min na de levering van de vertaalmix aan LUCFLAG mRNA-bevattende kanalen, begonnen Cy3-vlekken in een gezichtsveld te verschijnen en bleven zich gedurende ~ 30 minuten ophopen (figuur 4B). Niet-specifiek antilichaam dat zich aan het oppervlak bindt, gemeten met behulp van het 3xFLAG-ontbrekende LUC mRNA (figuur 2C), bleef op een zeer laag niveau15. De signalen van mRNA/ribosoom/peptide-gebonden Cy3- αFLAG waren duidelijk zichtbaar met de geoptimaliseerde laserincidenthoek, maar konden worden gemaskeerd door een hoge fluorescentieachtergrond met lagere laserincidenthoeken (figuur 4C).

Om Cy3-αFLAG bindingsgebeurtenissen te analyseren, werden de fluorescentieintensiteiten van geselecteerde Cy3-αFLAG-vlekken (figuur 5A) frame voor frame voor de hele film berekend en vervolgens verbonden om een intensiteitstraject te vormen (figuur 5B). Onbewerkte trajecten kunnen luidruchtig lijken en vereisen mogelijk verfijning met een niet-lineair achterwaarts filter om achtergrondruis te verminderen41. Verdere verfijning zou kunnen worden bereikt met behulp van stapsgewijze detectiealgoritmen om trajecten te digitaliseren42. Voor alle trajecten verschijnt een universele toename van het achtergrondfluorescentieniveau tijdens de uitwisseling van reagentia als gevolg van de diffuserende fluorescerende antilichamen in de vertaalmix (figuur 5B). Antilichaambinding aan een ontluikend polypeptide veroorzaakte een onmiddellijke toename van fluorescentie, terwijl antilichaam/polypeptide dissociatie van mRNA een onmiddellijke fluorescentiedaling veroorzaakt (Figuur 5B).

De verblijftijd van antilichaambinding kan worden gebruikt om de totale decoderingstijd van een open leeskader te meten. Het histogram van de verblijftijd voor LUCFLAG mRNA past in een log-normale verdeling ( figuur6A) en leverde een peptidesynthesesnelheid op van 2,5 ± 0,1 aminozuren per seconde15. Het histogram van de eerste aankomsttijd past in een verschoven (3-parameter) log-normal functie (Figuur 6B). De brede spreiding van het histogram van de eerste aankomsttijd toont de hoge mate van heterogeniteit in enkele mRNA-vertaalactiviteit. Het histogram gaf aan dat de eerste peptidesynthesegebeurtenis op enkele LUCFLAG mRNA-moleculen al na 2 minuten en tot 20 minuten na de levering van de vertaalmix kon beginnen (figuur 6B). In vergelijking met de vertaling met LUCFLAG mRNA vertoonde het histogram van de eerste aankomsttijd met hp-LUCFLAG mRNA-vertaling een tragere antilichaambinding ( figuur7A). Het gebruik van bulkluminescentiemetingen van celvrije vertaalreacties met dezelfde mRNAs lost echter geen verschillen in vertaalkinetiek op (figuur 7B,C). Deze resultaten tonen de hogere resolutie van onze methode aan in vergelijking met bulk kinetische luciferase activiteitsmetingen voor het detecteren van kleine veranderingen in de initiatiekinetiek.

Figure 1
Figuur 1: Protocolstroomdiagram. Schematische voorstellingen van coverslip- en diavoorbereiding, kamerassemblage met één molecuul, TIRF-beeldvorming en gegevensverzameling en stappen voor gegevensanalyse worden weergegeven. De TIRF-beeldvormingsstap omvat schematische afbeeldingen van mRNA-immobilisatie en vertaling in een stroomkanaal. Detectieoppervlakcomponenten, fluorescerend gelabeld antilichaam en celextractcomponenten zijn geïndiceerd. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: mRNA-ontwerpen voor de test met één molecuul. (A) Om een bulkvertalingstest aan te passen aan de test met één molecuul, werd de DNA-sjabloon van de bulkreporter ORF gewijzigd met een N-terminale epitooptagsequentie-invoeging om een getagde reporter-codering ORF te genereren. ORF- en N-terminal tagcoderingsgebieden worden aangegeven. (B) mRNAs waren 5′-m7G gemaximeerd om cap-afhankelijke vertaling mogelijk te maken en 3′-biotinylated voor hun immobilisatie naar single-molecule detectieoppervlak. 5′-m7G dop en 3′-biotine zijn aangegeven op niet-gelabelde en gelabelde ORF-RNA's. (C) Luciferase-coderende mRNAs werden gebruikt om de test met één molecuul aan te tonen. LUC en LUCFLAG mRNAs coderen luciferase die respectievelijk een N-terminal 3xFLAG tag mist en bevat. hp-LUCFLAG mRNA bevat een extra invoeging die een haarspeld secundaire structuur introduceert in de LUCFLAG mRNA 5′-leader. De haarspeld thermostabiliteit, 3′-poly(A) staart, en 3′-biotine zijn geïndiceerd. Alle drie de mRNAs bevatten een 30 nt 3′-poly(A) staart voor een efficiëntere cap-afhankelijke vertaling. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Single-molecule reporter mRNA integriteit en bulkvertaling. (A) Representatieve denaturering PAGE beeldvorming van single-molecule reporter mRNA. 5′-m7G afgedekt en 3′-biotinylated LUCFLAG mRNA werd geladen op een denaturering 10% polyacrylamide gel naast een RNA ladder. (B) Single-molecule reporter mRNA bewaarde 5' cap-afhankelijkheid in bulk celvrije vertaalreacties. 3′-biotinylated LUCFLAG mRNA dat ofwel ontbrak (–cap) of bevatte (+ dop) een 5′-m7G dop werd vertaald in S. cerevisiae vertaalextract gedurende 30 min bij 25 °C. Luciferase-activiteit werd gemeten aan de hand van twee onafhankelijke reacties en genormaliseerd naar de activiteit met –cap mRNA, die willekeurig is ingesteld op 1,0. Standaardafwijkingen van gemiddelde waarden worden aangegeven door foutbalken. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Beeldvorming van detectieoppervlakken met geïmmobiliseerd mRNA. (A) Achtergrondfluorescentie bij afwezigheid van vertaalmix. (B) Cy3 fluorescerende vlekken in een gezichtsveld 30 minuten na de levering van de vertaalmix en met een geoptimaliseerde laserincidenthoek. (C) Afgebeeld gezichtsveld 30 min na vertaling mix levering en met een lage laser incident hoek. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Beeldanalyse. (A) Cy3 vlekken in een gezichtsveld zonder (linkerpaneel) of met (rechterpaneel) spotselectie. (B) Voorbeeld van een traject met één molecuul voor een geselecteerde Cy3-spot. De zwarte pijl geeft de toename van achtergrondfluorescentie aan als gevolg van diffusie van antilichamen tijdens de levering van vertaalmixen. De groene pijl geeft de plotselinge toename van de fluorescentie-intensiteit aan als gevolg van Cy3-αFLAG binding. De rode pijl geeft de plotselinge afname van de fluorescentie-intensiteit aan als gevolg van Cy3-αFLAG/ontluikende peptidedissociatie van mRNA. De verblijftijd van een Cy3-αFLAG bindingsgebeurtenis wordt aangegeven met een dubbelkoppige pijl. Onbewerkte, gefilterde en gedigitaliseerde gegevens worden aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Kinetische analyse van Cy3-αFLAG binding met LUCFLAG mRNA vertaling. (A) Het Cy3-αFLAG bindingstijd histogram past in een log-normale verdeling. (B) De Cy3-αFLAG binding eerste aankomsttijd histogram past op een verschoven (3-parameter) log-normal functie. Aangepast van Wang et al.15 met toestemming. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: De test met één molecuul heeft een hogere resolutie voor initiatiekinetiek dan de bulkluminescentietest. (A) Eerste aankomsttijd histogrammen voor Cy3-αFLAG binding met vertaling van LUCFLAG en hp-LUCFLAG mRNAs onthulde langzamere initiatie veroorzaakt door een kleine haarspeldstructuur in de mRNA 5′-leider. N = 10650 trajecten (LUCFLAG), gecombineerd uit 3 datasets en N = 4079 trajecten (hp-LUCFLAG), gecombineerd uit 2 datasets. (B,C) Bulk luciferase activiteitstest kinetische metingen losten geen verschillen in initiatiekinetiek op voor LUCFLAG (N = 9 datasets) en hp-LUCFLAG (N = 6 datasets) mRNA-vertaling. (B) Bulkluminescentiekinetiek. (C) Spreidingspercelen van de eerste ronde vertaaltijden bepaald door Gaussiaans passend bij de tweede afgeleide van de luminescentiekinetiekcurven in (B), zoals beschreven door Vassilenko et al. 46. De rode cirkels en balken in (C) vertegenwoordigen respectievelijk de gemiddelde waarde en standaardafwijking van de berekende eerste ronde omrekeningstijd. Aangepast van Wang et al.15 met toestemming. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In vergelijking met typische in vitro TIRF-experimenten met één molecuul is beeldvorming met één molecuul met de hier beschreven test bovendien complex vanwege het gebruik van celextract en een hoge concentratie fluorescerend gelabeld antilichaam. In vergelijking met de meer gebruikelijke praktijk van één ronde pegylatie van het oppervlak, vermindert een tweede ronde PEGylation (stap 2) de niet-specifieke antilichaambinding aan het detectieoppervlakaanzienlijk 15. De hoge concentratie van diffuserende fluorescerende antilichamen veroorzaakt een extreem hoge fluorescerende achtergrond die de detectie van antilichaambinding met één molecuul maskeert. Om deze fluorescerende achtergrond te verminderen, wordt de laserincidenthoek ver boven de kritische hoek verhoogd (stap 3.4.). Antilichaamdetectie wordt ook verminderd door overmatige fluorofoorinstabiliteit, wat het vermogen om de verblijftijd te kwantificeren kan beperken. Wanneer u dit probleem tegenkomt, vervangt u de fluorofoor door een meer fotoseerbare fluorofoor, zoals degene die zijn vervoegd tot een triplet-state quencher47,of verlaag de laserverlichtingsintensiteit. Hoewel zuurstofopruimingssystemen vaak worden gebruikt in in vitro experimenten met één molecuul om fluorofoorfotobleaching 48,49te onderdrukken , kan de hier beschreven test een zeer genereus detectievenster bieden zonder zuurstofopruimingssystemen te implementeren15. Bovendien kunnen zuurstofopruimingssystemen de eukaryotische celvrije vertaalefficiëntie aanzienlijk verminderen. Daarom moeten zuurstofopruimingssystemen zorgvuldig worden geëvalueerd voordat ze met deze test worden gebruikt.

Het is belangrijk erop te wijzen dat kleine variaties in reagenspreparaat door de test worden gedetecteerd vanwege de resolutie van één molecuul. Replica-extractpreparaten kunnen bijvoorbeeld verschillende activiteiten weergeven die al dan niet met bulkmethoden kunnen worden gedetecteerd. Bovendien kunnen vries-dooicycli van vertaalextract en andere reagentia de vertaalactiviteit snel belemmeren. We raden aan om kleinschalige proefexperimenten uit te voeren met gemakkelijk toegankelijk materiaal om de omstandigheden te testen voordat u een systematische studie plant. Voor een systematische studie worden grootschalige preparaten van vertaalreagentia, aliquots voor eenmalig gebruik voor vries-/dooigevoelige reagentia en consistentie bij het uitvoeren van protocolstappen aanbevolen. Vertaalextract dat in vloeibare stikstof is ingevroren en bij -80 °C is opgeslagen, vertoont minimaal activiteitsverlies gedurende ten minste twee jaar. Toepassing van deze maatregelen kan experimentele variaties effectief onderdrukken en de robuustheid van de test met één molecuul verhogen.

Aangezien deze methode bestaande bulkcelvrije vertaalsystemen en in vitro beeldvormingstechnieken met één molecuul combineert, wordt hier niet gesproken over het oplossen van generieke problemen op deze twee gebieden. Voorbeelden van dergelijke generieke problemen zijn preparaten van lage kwaliteit van reporter mRNA of PEGylated coverslip en lage vertaalactiviteit van celextract. Hier zullen we ons richten op kwesties die specifiek zijn voor deze methode. Naast de verschillende technische problemen die in het protocol zijn besproken, kan een ander potentieel probleem laag zijn of geen antilichaambinding in het stroomkanaal voor een vertaalvoorwaarde die naar verwachting een goede activiteit zal hebben. Er zijn verschillende mogelijkheden om problemen op te lossen. De efficiëntie van biotinylated mRNA immobilisatie naar het detectieoppervlak kan worden beoordeeld door complementaire en fluorofoorgeconjugeerde DNA-oligomeren te gloeien naar het geïmmobiliseerde mRNA en het fluorescerende DNA: RNA duplexen in beeld te brengen. De kwaliteit van de vertaalmix en biotinylated reporter mRNAs kan worden gecontroleerd door de bulkvertalingstest uit te voeren. Bovendien kan de vertaalreactieoplossing na het uitvoeren van een vertaalreactie in een mRNA-geïmmobiliseerd stroomkanaal uit het kanaal worden gepijpt en worden gebruikt in een reporteractiviteitstest om het optreden van in-channel vertaling te bevestigen. Indien nodig kan een te hoge mRNA-oppervlaktedichtheid worden gebruikt voor de in-channel vertaalreactie om gemakkelijker te kunnen worden gedetecteerd door de activiteitstest van de verslaggever.

De belangrijkste beperking van deze test is de resolutie voor initiatiekinetiek. In deze test bevat de directe experimentele output, de eerste aankomsttijd, zowel de initiatietijd van de eerste ronde als de peptideverlengingstijd voor het vertalen van de epitoop en 35 extra codons. Hoewel de bijdrage van de peptide elongatietijd kan worden gecorrigeerd (stap 6.9.), is deze test bijgevolg het meest gevoelig voor het meten van initiatiekinetiek die optreedt in de volgorde van minuten, wat een generieke eigenschap lijkt te zijn van cap-afhankelijke initiatie15. Experimenteel is het gemakkelijk om deze test aan te passen om andere initiatiemechanismen te bestuderen. Als een initiatiemechanisme echter significant snel optreedt in de orde van seconden, is het onwaarschijnlijk dat deze test de initiatiekinetiek oplost.

De hier beschreven single-molecule benadering combineert single-molecule imaging en extract-based translation om metingen van individuele cap-afhankelijke vertaalgebeurtenissen in real-time en tijdens actieve celvrije vertaling mogelijk te maken. De test maakt een eenvoudige overgang mogelijk van een bulkvertalingstest naar een test met één molecuul, met behoud van de kinetiek van de bulkvertaling. Kinetische waarnemingen met één molecuul kunnen dus worden geïnterpreteerd onder directe verwijzing naar overeenkomstige bulkresultaten. Eerdere methoden, waaronder recent ontwikkelde in vivo benaderingen 11,12,13,14, missen de resolutie voor kinetische metingen van individuele vertaalinitiatiegebeurtenissen en vereisen aannames van vertaalmechanismen om initiatietijdgemiddelden uit experimentele observables te extraheren. De hier gepresenteerde methode met één molecuul biedt de eerste hypothesevrije benadering voor het kwantificeren van de gemiddelde initiatietijd van actieve cap-afhankelijke vertaling. Hoewel bulkkinetische metingen met een luminescentietest zijn gebruikt om de meest kwantitatieve en systematische bulkkarakteriseringen van cap-afhankelijke vertaalkinetiek tot nu toe46,50te bieden , meet de hier beschreven test met één molecuul gemiddelde initiatiekinetische veranderingen met een grotere gevoeligheid dan de bulktest ( figuur7). Bovendien behouden de gegevens met één molecuul enkele mRNA-vertaling stochastiek en heterogeniteit, eigenschappen die gemiddeld worden uitgevoerd in bulkmetingen. De single-molecule resolutie van vertaalkinetiek kan worden gebruikt voor systematische kinetische analyses om inzichten van vertaalmechanismen te onthullen die onbereikbaar zijn met andere methoden.

Deze test is compatibel met bestaande biochemische en genetische benaderingen die vaak worden gebruikt voor vertaalstudies. Bijvoorbeeld, de translationele functie van een specifieke factor kan worden bestudeerd door het genereren van factor-uitgeput extract en het aanvullen met wild-type of mutant factor. Bovendien kunnen studies, door fluorescerend gelabelde factor aan te vullen, mogelijk de kinetische relatie tussen factorbinding en de progressie van vertaling onderzoeken. Met het gebruik van twee verschillende epitoop/antilichaamparen kan dit protocol mogelijk worden uitgebreid van een eenkleurige test naar een tweekleurentest die gelijktijdige detectie van twee verschillende coderingssequenties mogelijk maakt. Deze aanpassing zou het mogelijk maken de vertaling van verschillende leeskaders te volgen en zou kunnen worden toegepast op frameshifting en het starten van siteselectiestudies. Als alternatief kan een tweekleurig systeem worden gebruikt om antilichaaminteracties te detecteren met gelabelde polypeptiden gecodeerd door upstream en downstream open leesframes om zowel upstream- als downstreamvertalingsgebeurtenissen op individuele mRNAs te volgen. Deze uitbreidingen kunnen een breed scala aan mechanistische studies mogelijk maken die cap-afhankelijke vertaling en de regulering ervan onderzoeken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health [R01GM121847]; de Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) Support Grant/Core Grant (P30 CA008748); en MSKCC Functional Genomics Initiative.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100X oil objective, N.A. 1.49 Olympus UAPON 100XOTIRF
Acryamide/bis (40%, 19:1) Bio-Rad 161-0144
Alkaline liquid detergent Decon 5332
Aminosilane (N-(2-Aminoethyl)-3-Aminopropyltrimethoxysilane) UCT Specialties, LLC A0700
Andor ixon Ultra DU 897V EMCCD Andor DU-897U-CSO-#BV
Andor Solis software Andor For controlling the Andor EMCCD
Band-pass filter Chroma 532/640/25
Band-pass filter Chroma NF03-405/488/532/635E-25
Biotin-PEG-SVA Laysan Bio Inc Biotin-PEG-SVA
Coenzyme A free acid Prolume 309-250
Coolterm software For controlling the syringe pump
Desktop computer Dell For controlling the microscope, camera, stage, and pump.
Dichroic mirror Semrock R405/488/532/635
Direct-zol RNA microprep 50RNX Fisher Scientific NC1139450
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega E1910
Epoxy Devcon 14250
Firefly luciferin D-Luciferin free acid Prolume 306-250
Glacial acetic acid Fisher Scientific BP1185500
Hydrogen perioxide Sigma-Aldrich 216763-500ML
Immersion oil Olympus Z-81226A Low auto-fluorescence
Luciferase Assay System Promega E1500
MEGASCRIPT T7 Transcription Kit Thermo fisher AM1334
Methanol Fisher Scientific MMX04751
Microscope Olympus IX83
Microscope slide Thermo Scientific 3048
Monoclonal anti-FLAG M2-Cy3 Sigma-Aldrich A9594
mPEG-SVA Laysan Bio Inc mPEG-SVA-5000
MS(PEG)4 Thermo Scientific 22341
NaCl (5M) Thermo Scientific AM9760G
No 1.5 microscope Cover glass Fisherband 12-544-C
Olympus Laser, 532nm 100mM Olympus digital Laser system CMR-LAS 532nm 100mW
Olympus TirfCtrl software Olympus For controlling the laser intensity and incident angle
Optical table TMC vibration control 63-563 With vibration isolation
Phenol chloroform isoamyl alcohol mix Sigma-Aldrich 77617-100ml
Pierce RNA 3' End Biotinylation Kit Thermo Scientific 20160
Potassium hydroxide pellets Sigma-Aldrich P1767-500G
Prior motorized XY translation stage Prior PS3J100
Prior PriorTest software Prior For controlling the Prior motorized stage
Recombinant RNasin RNase Inhibitor Promega N2515
Stage top Incubator In vivo scientific (world precision Instruments) 98710-1 With a custom built acrylic cage
Staining jar Fisher Scientific 08-817
Streptavidin Thermo Scientific 43-4301
Sulfuric acid Fisher Scientific A300212
SYBR green II Fisher Scientific S7564
Syringe Hamilton 1725RN
Syringe pump Harvard apparatus 55-3333
Tris (1M), pH = 7.0 Thermo Scientific AM9850G
Ultrasonic Bath Branson CPX1800H
Urea Sigma-Aldrich U5378-500G
Vaccinia Capping system New England Biolabs M2080S
Zymo-Spin IC Columns Zymo Research C1004

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hinnebusch, A. G. The scanning mechanism of eukaryotic translation initiation. Annual Review of Biochemistry. 83, 779-812 (2014).
  2. Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 827-835 (2004).
  3. Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 113-127 (2010).
  4. Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. Translational control in cancer. Nature Reviews Cancer. 10, 254-266 (2010).
  5. Saini, A. K., Nanda, J. S., Lorsch, J. R., Hinnebusch, A. G. Regulatory elements in eIF1A control the fidelity of start codon selection by modulating tRNA(i)(Met) binding to the ribosome. Genes and Development. 24, 97-110 (2010).
  6. Algire, M. A., et al. Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system. RNA. 8, 382-397 (2002).
  7. Amrani, N., Ghosh, S., Mangus, D. A., Jacobson, A. Translation factors promote the formation of two states of the closed-loop mRNP. Nature. 453, 1276-1280 (2008).
  8. Pisarev, A. V., Unbehaun, A., Hellen, C. U., Pestova, T. V. Assembly and analysis of eukaryotic translation initiation complexes. Methods in Enzymology. 430, 147-177 (2007).
  9. Hinnebusch, A. G. Structural insights into the mechanism of scanning and start codon recognition in eukaryotic translation initiation. Trends in Biochemical Sciences. 42, 589-611 (2017).
  10. Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The growing toolbox for protein synthesis studies. Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).
  11. Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352, 1425-1429 (2016).
  12. Wang, C., Han, B., Zhou, R., Zhuang, X. Real-time imaging of translation on single mRNA transcripts in live cells. Cell. 165, 990-1001 (2016).
  13. Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. H. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 352, 1430-1435 (2016).
  14. Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. Dynamics of translation of single mRNA molecules in vivo. Cell. 165, 976-989 (2016).
  15. Wang, H., Sun, L., Gaba, A., Qu, X. An in vitro single-molecule assay for eukaryotic cap-dependent translation initiation kinetics. Nucleic Acids Research. 48, 6 (2020).
  16. Aitken, C. E., Lorsch, J. R. A mechanistic overview of translation initiation in eukaryotes. Nature Structural & Molecular Biology. 19, 568-576 (2012).
  17. Anderson, C. W., Straus, J. W., Dudock, B. S. Preparation of a cell-free protein-synthesizing system from wheat germ. Methods in Enzymology. 101, 635-644 (1983).
  18. Erickson, A. H., Blobel, G. Cell-free translation of messenger RNA in a wheat germ system. Methods in Enzymology. 96, 38-50 (1983).
  19. Iizuka, N., Najita, L., Franzusoff, A., Sarnow, P. Cap-dependent and cap-independent translation by internal initiation of mRNAs in cell extracts prepared from Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 14, 7322-7330 (1994).
  20. Iizuka, N., Sarnow, P. Translation-competent extracts from Saccharomyces cerevisiae: effects of L-A RNA, 5' cap, and 3' poly(A) tail on translational efficiency of mRNAs. Methods. 11, 353-360 (1997).
  21. Jackson, R. J., Hunt, T. Preparation and use of nuclease-treated rabbit reticulocyte lysates for the translation of eukaryotic messenger RNA. Methods in Enzymology. 96, 50-74 (1983).
  22. Sachs, M. S., et al. Toeprint analysis of the positioning of translation apparatus components at initiation and termination codons of fungal mRNAs. Methods. 26, 105-114 (2002).
  23. Tarun, S. Z., Sachs, A. B. A common function for mRNA 5' and 3' ends in translation initiation in yeast. Genes and Development. 9, 2997-3007 (1995).
  24. Wang, Z., Sachs, M. S. Ribosome stalling is responsible for arginine-specific translational attenuation in Neurospora crassa. Molecular and Cellular Biology. 17, 4904-4913 (1997).
  25. Wang, Z., Sachs, M. S. Arginine-specific regulation mediated by the Neurospora crassa arg-2 upstream open reading frame in a homologous, cell-free in vitro translation system. Journal of Biological Chemistry. 272, 255-261 (1997).
  26. Fedyukina, D. V., Cavagnero, S. Protein folding at the exit tunnel. Annual Review of Biophysics. 40, 337-359 (2011).
  27. Jha, S., Komar, A. A. Birth, life and death of nascent polypeptide chains. Biotechnology Journal. 6, 623-640 (2011).
  28. Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2, 24 (2019).
  29. Zhovmer, A., Qu, X. Proximal disruptor aided ligation (ProDAL) of kilobase-long RNAs. RNA Biology. 13, 613-621 (2016).
  30. Wu, C., Sachs, M. S. Preparation of a Saccharomyces cerevisiae cell-free extract for in vitro translation. Methods in Enzymology. 539, 17-28 (2014).
  31. Zhao, R., Rueda, D. RNA folding dynamics by single-molecule fluorescence resonance energy transfer. Methods. 49, 112-117 (2009).
  32. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
  33. Deindl, S., Zhuang, X. Monitoring conformational dynamics with single-molecule fluorescence energy transfer: applications in nucleosome remodeling. Methods in Enzymology. 513, 59-86 (2012).
  34. Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. L. DNA curtains for high-throughput single-molecule optical imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).
  35. Gaba, A., Wang, Z., Krishnamoorthy, T., Hinnebusch, A. G., Sachs, M. S. Physical evidence for distinct mechanisms of translational control by upstream open reading frames. The EMBO Journal. 20, 6453-6463 (2001).
  36. Schaffer, B., Grogger, W., Kothleitner, G. Automated spatial drift correction for EFTEM image series. Ultramicroscopy. 102, 27-36 (2004).
  37. Wang, Y., et al. Localization events-based sample drift correction for localization microscopy with redundant cross-correlation algorithm. Optics Express. 22, 15982-15991 (2014).
  38. Sugar, J. D., Cummings, A. W., Jacobs, B. W., Robinson, B. D. A free Matlab script for spacial drift correction. Microscopy Today. 22, 40-47 (2014).
  39. Chenouard, N., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nature Methods. 11, 281-289 (2014).
  40. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
  41. Chung, S. H., Kennedy, R. A. Forward-backward non-linear filtering technique for extracting small biological signals from noise. Journal of Neuroscience Methods. 40, 71-86 (1991).
  42. Ensign, D. L., Pande, V. S. Bayesian detection of intensity changes in single molecule and molecular dynamics trajectories. Journal of Physical Chemistry B. 114, 280-292 (2010).
  43. Blanco, M., Walter, N. G. Analysis of complex single-molecule FRET time trajectories. Methods in Enzymology. 472, 153-178 (2010).
  44. Shuang, B., et al. Fast step transition and state identification (STaSI) for discrete single-molecule data analysis. The Journal of Physical Chemistry Letters. 5, 3157-3161 (2014).
  45. White, D. S., Goldschen-Ohm, M. P., Goldsmith, R. H., Chanda, B. Top-down machine learning approach for high-throughput single-molecule analysis. Elife. 9, 53357 (2020).
  46. Vassilenko, K. S., Alekhina, O. M., Dmitriev, S. E., Shatsky, I. N., Spirin, A. S. Unidirectional constant rate motion of the ribosomal scanning particle during eukaryotic translation initiation. Nucleic Acids Research. 39, 5555-5567 (2011).
  47. Zheng, Q., et al. Ultra-stable organic fluorophores for single-molecule research. Chemical Society Review. 43, 1044-1056 (2014).
  48. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).
  49. Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82, 6132-6138 (2010).
  50. Berthelot, K., Muldoon, M., Rajkowitsch, L., Hughes, J., McCarthy, J. E. Dynamics and processivity of 40S ribosome scanning on mRNA in yeast. Molecular Microbiology. 51, 987-1001 (2004).

Tags

Biochemie celvrije eukaryotische vertaling single-molecule translation kinetics in vitro fluorescentie imaging cap-dependent initiation translationele controle in vitro assay
Een <em>in vitro</em> single-molecule imaging assay voor de analyse van cap-afhankelijke vertaalkinetiek
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gaba, A., Wang, H., Qu, X. An In … More

Gaba, A., Wang, H., Qu, X. An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics. J. Vis. Exp. (163), e61648, doi:10.3791/61648 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter