Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

In Vitro одномекулярной визуализации анализ для анализа Cap-зависимых Перевод Кинетики

Published: September 15, 2020 doi: 10.3791/61648
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Molecular Biology Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center
* These authors contributed equally

Summary

Отслеживание отдельных событий перевода позволяет проводить кинетические исследования механизмов перевода с высоким разрешением. Здесь мы демонстрируем одномекулярный анализ in vitro, основанный на взаимодействии изображений между флуоресцентно помеченными антителами и эпитопными зарождающимися пептидами. Этот метод позволяет одномекулярной характеристики инициации и пептидной кинетики удлинения во время активного в пробирке крышка-зависимый перевод.

Abstract

Синтез белка, зависящий от крышки, является преобладающим переводом в эукариотических клетках. Хотя различные биохимические и генетические подходы позволили проведить обширные исследования зависящего от ограничения перевода и его регулирования, кинетической характеристики этого пути перевода с высоким разрешением по-прежнему не хватает. Недавно мы разработали анализ in vitro для измерения кинетической системы перевода, зависящей от колпачка, с разрешением одной молекулы. Анализ основан на флуоресцентно помечены антитела связывания с зарождающейся эпитоп-тегами полипептида. Путем изображения связывания и диссоциации антител к зарождающимся пептидно-рибосомно-мРНК комплексов и из них можно отслеживать прогрессию перевода на отдельных мРНК. Здесь мы представляем протокол для установления этого анализа, включая подготовку мРНК и PEGylated слайдов, визуализацию перевода в режиме реального времени и анализ траекторий одной молекулы. Этот анализ позволяет отслеживать отдельные события перевода, зависящие от ограничения, и решает ключевые кинетики перевода, такие как инициация и удлинение ставок. Анализ может быть широко применен к отдельным системам перевода и должен в целом принести пользу в пробирке исследований зависит от ограничения перевода кинетики и переводческих механизмов контроля.

Introduction

Перевод в эукариотических системах происходит преимущественно через 7-метилгуанозин(м 7G) крышка-зависимых путей1. Исследования показывают, что инициационный шаг эукариотического перевода является ограничением скорости и общей цельюдля регулирования 2,3,4. Механизмы капремонтозависимых переводов были широко изучены с использованиемгенетических 5,биохимических 6,7,8, структурных9игеномных 10 навалочных подходов. Хотя эти методы выявили различные механизмы, которые регулируют ограничения зависимых инициации, их разрешение ограничивает их ансамбль усреднение сигналов от неоднородных и асинхронных событий посвящения. Совсем недавно, отдельные события перевода in vivo были визуализированы методами, которые измеряют флуоресцентные антитела, связывающиеся с эпитопами на зарождающихсяполипептидах 11,12,13,14. Тем не менее, эти новые подходы также ограничены в их способности решать отдельные события посвящения, потому что множественные флуоресцентные антитела должны связывать зарождающийся пептид, чтобы отдельные события перевода были решены из высокого внутриклеточного фона флуоресценции. Во многих биологических взаимодействиях, решенные отдельные кинетические события предоставили критические идеи в понимании сложных многоступенчатых и повторяющихся биологических процессов, которые невозможно синхронизировать на молекулярном уровне. Необходимы новые методы, которые могут отслеживать динамику отдельных событий перевода для лучшего понимания ограничения зависимости от инициации и регулирования.

Недавно мы разработали анализ in vitro, который измеряет зависящая от крышки инициация кинетики с одномекулярнойразрешением 15. Учитывая большое количество известных и неизвестных белковых факторов, участвующихв этом пути инициации 3,16, одномекулярный анализ был разработан, чтобы быть совместимым с существующими системами перевода без клеток in vitro, чтобы извлечь выгоду из их сохранения клеточных факторов инадежной переводческой активности 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Кроме того, использование систем перевода без клеток позволяет проводить более совместимые сопоставления между одномекулярными наблюдениями и предыдущими результатами. Этот подход обеспечивает прямую интеграцию новых одномекулярных кинетических идей в существующие механистические рамки ограничения зависимой инициации. Для установления одномекулярного анализа традиционная система перевода без клеток модифицировалась тремя способами: в начале открытого считывочного кадра (ORF) репортер mRNA вставляется последовательность кодирования эпитопа; 3 "конец репортер мРНК биотинилированных для облегчения мРНК конца привязывая к одной молекулы обнаружения поверхности; и флуоресцентно помеченные антитела дополняются экстрактом перевода. Эти модификации требуют только основных методов молекулярной биологии и общедоступных реагентов. Кроме того, эти модификации и условия одномекулярной визуализации сохраняют кинетику перевода реакций перевода без навалочныхклеток 15.

В этом анализе (Рисунок 1), 5 "конец ограничен и 3"-конец биотинилированных репортер мРНК обездвижены на стрептавидин покрытием обнаружения поверхности в камере потока. Затем камера потока заполняется безклеточной переводной смесью, дополненной флуоресцентно помеченными антителами. После перевода мРНК произошло около 30-40 кодонов вниз потечению эпитопной последовательности 26,27, эпитоп выходит из рибосомного туннеля выхода и становится доступным для взаимодействия с флуоресцентно помеченными антителами. Это взаимодействие происходит быстро, и его обнаружение с помощью одномекулярных методов визуализации флуоресценции позволяет отслеживать перевод кинетики с одномекулярной разрешением во время активного перевода без клеток. Этот анализ должен в целом принести пользу в пробирке исследований кап-зависимых перевод кинетики и ее регулирования, особенно для систем с рабочей массой in vitro анализа.

Предпосылкой для создания этого одномекулярного анализа является рабочая навалом без клеток перевод анализа, который может быть достигнут с помощью перевода экстракт, который является либо коммерчески доступным или подготовлены следующие ранее описанныеметоды 28. Эукариотический перевод экстракт может быть получен из различных клеток, в том числе грибковых, млекопитающих ирастений 28. Для визуализации для этого анализа требуется микроскоп TIRF, оснащенный настраиваемой лазерной интенсивностью и углом инцидента, моторизованной стадией образца, моторизованной системой жидкости и устройством контроля температуры образца. Такие требования являются общими для современных одноямператекулярных экспериментов TIRF in vitro и могут быть достигнуты по-разному. Эксперимент, представленный здесь, использует объективную систему TIRF, состоит из коммерчески доступных микроскопов, программного обеспечения и аксессуаров, перечисленных в таблице материалов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Поколение репортеров мРНК

  1. Изменение шаблона транскрипции ДНК, который кодирует объемный анализ "untagged" репортер mRNA, вставив N-терминус эпитоп тегов кодирования последовательности для создания шаблона транскрипции ДНК для "тегами" репортер mRNA (Рисунок 2A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Взаимодействие 3xFLAG/anti-FLAG рекомендуется для этого анализа из-за его превосходной чувствительности и короткой длины тега 3xFLAG. Тем не менее, анализ совместим с другими парами эпитопа/антитела.
  2. Синтезировать нетегированные и помеченные РНК с использованием линейных шаблонов ДНК и комплекта транскрипции in vitro (см. таблицу материалов). Как правило, 10-20 пмоль в пробирке транскрибируется РНК достаточно для последующей обработки РНК, чтобы обеспечить систематическое одномолекулярное исследование.
  3. Cap РНК 5 "конец (Рисунок 2B) см 7G укупорки комплект (см.Таблицу материалов ) после рекомендации производителя.
  4. Биотинилат РНК 3 "конец(рисунок 2B) с использованием биотинилирования комплект (см. Таблицу материалов) в соответствии с протоколом, предоставленным комплектом. Очистка РНК путем извлечения фенол-хлороформа с последующим очищением с помощью спиновой колонки. Elute РНК в 10-20 йл без RNase воды. Приблизительно 40–50% необнафтенные входные РНК восстанавливаются.
  5. Оцените целостность и концентрацию РНК путем денатурации электрофореза акриламинида геля и окрашивания РНК, как описано ранее29.
  6. Выполните навалом ячейкибез перевода 30 с 3 "конец-биотинилированные помечены репортер мРНК, чтобы подтвердить, что модифицированная мРНК сохраняет свойства перевода, которые являются представляющими интерес. Например, зависящий от ограничения перевод может быть подтвержден путем измерения и сравнения деятельности репортера в массовых сотовых переводческих реакциях с необнаблённой и ограниченной репортерной mRNAs (см. результаты представителя).

2. Подготовка камеры потока

  1. Выберите соответствующую толщину крышки, как указано в микроскопе объективного листа спецификации. Выберите стеклянную или кварцевую горку для систем визуализации объективного или призмного типа общего внутреннего отражения (TIRF)31,соответственно.
  2. Выполните очистку, засолинизацию, PEGylation и камерную сборку крышки и слайда в соответствии с протоколом, описанным Chandradoss et al.32 со следующими изменениями.
    1. Вымойте слайды, содержащие просверленные отверстия в 10% щелочном жидком моющее средство (v/v) в течение 20 мин с sonication. Объедините слайды и крышки для всех оставшихся шагов очистки.
    2. Пропустите шаг мыть ацетона. Продлите время инкубации пираньи с 20 минут до 1 ч. Инкубировать первый раунд PEGylation на 3 ч. Инкубировать второй раунд PEGylation с MS (PEG)4 для 3 ч.

3. Подготовка оборудования

  1. По крайней мере, за 3 часа до проведения одномекулярного эксперимента включите инкубатор микроскопа и уменьшите поток воздуха до низкой скорости, чтобы избежать чрезмерного акустического нарушения экспериментов. Установите температуру инкубатора до оптимальной температуры для системы перевода без клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перевод чрезвычайно чувствителен к температуре. Оптимальная температура реакции специфична для каждой клеточной системы экстракта. Характеристика температуры реакции является жизненно важным шагом в развитии системы перевода без навалочных клеток. Этот одномекулярный анализ должен проводиться при той же оптимальной температуре, что и соответствующее условие массового перевода.
  2. По крайней мере 1 ч перед выполнением одномекулярного эксперимента включите лазер, нажав кнопку лазерной энергии за лазерной коробкой, включите ключ безопасности лазера и нажмите кнопку запуска; включите микроскоп и нажмите на панель управления сенсорным экраном, чтобы выбрать режим изображения, цель и набор фильтров.
  3. Включите камеру EMCCD, контроллер Prior stage и шприц-насос, нажав кнопки питания. Включите компьютер и открытое программное обеспечение Andor Solis (программное обеспечение 1) для управления камерой EMCCD, TirfCtrl (программное обеспечение 2) для управления лазером, PriorTest (программное обеспечение 3) для управления моторизованной стадии, и Coolterm для управления шприц насоса. Позвольте камере остыть и стабилизироваться до назначенной рабочей температуры до начала сбора данных.
  4. В программном обеспечении 2, подтвердите, что правильные параметры установлены для длины волны лазера, объективного типа и рефракционного индекса стекла и образца. Нажмите кнопку Connect. Чтобы установить интенсивность лазера, нажмите кнопку управления рядом с лазерной длиной волны, затем в лазерном управлении всплывающее окно, перетащите интенсивность слайд-бар. Установите лазер под нужный угол, перетащив слайд-бар положения волокна или ввода соответствующей глубины проникновения. Убедитесь, что коробка Затвора проверяется для поддержания лазера в режиме Off, когда нет изображений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Откройте и закройте лазерный затвор, проверив поле затвора. При первоначальном установлении анализа, различные интенсивности лазера и углы инцидента должны быть проверены на оптимальное обнаружение одной молекулы. Оптимальная интенсивность лазера уравновешивает яркую одноямекулярную флуоресценцию и быстрое фотоотравлив флюорофоров. Угол инцидента должен быть увеличен за критический угол, чтобы уменьшить высокий флуоресцентный фон от диффузных помеченных антител до тех пор, пока антитела, связанные с мРНК, не будут четко решены. В качестве эталона, 532 нм лазер был установлен на 10 ЗВт на цели с лазерным углом инцидента установлен на 71,5 "висследовании 15 с использованием Cy3 помечены анти-FLAG с маркировкой соотношение 2-7 красителей на антитело.
  5. В программном обеспечении 1, выберите Kinetic в режиме приобретения, ввесть параметры времени экспозиции, кинетической длины серии, и EM получить значение. Выберите каталог и назначьте имена файлов для сохранения файла изображения данных.
  6. Установите шприц насос скромный, чтобы быстро скорость потока для последующего шага мытья труб.
    Pipette aliquot 70% этанола в трубку микрофуза, вставьте шприц насос трубки конца в раствор этанола, и использовать Coolterm для переключения шприц насоса между снять и обойтись режимы три раза, чтобы мыть трубки. Повторите использование воды без RNase.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Длина труб должна быть достаточно длинной, чтобы позволить перевод смеси обойтись на шаг 5 только связаться с трубкой, а не шприц. Объем полоскания здесь должен быть больше, чем объем дозированного перевода смеси для обеспечения того, чтобы перевод смеси на этапе 5 остается в контакте с дезинфицируемой трубки.
  7. После окончательного полоскания воды была обойтись, удалить остаточную воду изнутри трубки, dabbing трубки конца на чистую ткань протрите. Поддерживайте конец тюбингов сухой, установив его в чистую трубку микрофуза.

4. Иммобилизация биотинилированной мРНК на 3 конца

  1. Поддерживайте клеточный экстракт и перевод смеси замороженных на сухом льду до незадолго до их использования. Оттепель оставшихся замороженных реагентов и поддерживать их на льду.
  2. Поместите камеру потока в держатель образца микроскопа с стороной крышки, обращенной вниз, и закрепите ее на месте лентой. Используйте ленту для покрытия входов и точек каналов потока, которые не используются.
  3. Pipette объемом 1,5x (относительно объема канала; также применяется к другим шагам в шаге 4 и шаг 5) 0,2 мг/мл стрептавидина в канал потока и инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре.
  4. Чтобы удалить несвегаемый стрептавидин, мыть канал три раза путем трубопроводов в 3x объемЕ буфера мытья T50 (20 мМ Трис HCl, рН 7,0, 50 мМм NaCl, 0,2 U /L RNase ингибирования реагента) за стирку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы жидкие отходы не текли обратно в канал. Если выход канала потока не подключен к трубке сбора отходов, поместите сложенную бумагу ткани рядом с розеткой, чтобы поглотить жидкость, которая вытекает из канала.
  5. Перенесите перевод экстракта и перемешайте из сухого льда на лед и дайте им оттаять.
  6. Положите каплю масла погружения на цель. Поместите держатель образца микроскопа с камерой потока в стадию микроскопа. Принесите цель близко к крышке до погружения нефти на объективные контакты крышки. Переместите этап выборки так, чтобы положение канала потока было прямо над объективом цели.
  7. В программном обеспечении 2 откройте лазерный затвор и отрегулируйте уровень интенсивности лазера.
  8. На сенсорном экране управления микроскопом выберите вкладку Фокус и нажмите кнопку Поиск фокусировки и запуск. Звуковой сигнал слышен, когда фокус плоскости успешно достигнута.
  9. Изображение поверхности канала потока в режиме Live в программном обеспечении 1. Оптимизируйте фокус для более четкого изображения, регулируя объективное положение с помощью тонкого управления шагом на сенсорном экране.
  10. В программном обеспечении 3, переместить этап для оценки уровня фона флуоресценции в различных областях поверхности обнаружения канала потока. Если флуоресценция низкая, продолжайте эксперимент. Если фон флуоресценции чрезмерно высок, подумайте об отказе от канала потока.
  11. В программном обеспечении 2 закройте лазерный затвор.
  12. Pipette из T50 мыть буфер из потока канала и сразу же пипетки в 2x объем биотинилированных мРНК решение канала потока. Инкубация в течение 15 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой партии подготовки мРНК, концентрации мРНК и инкубацио время должно быть проверено для достижения плотности поверхности мРНК, необходимой для обнаружения одной молекулы. Соответствующая плотность поверхности мРНК опосредует связывание антител, которое показывает флуоресцентные пятна с перекрывающимися не более чем на 5% (см. результаты представительов). В качестве отправной точки рекомендуется биотинилированная мРНК при концентрации 2-20 нм.
  13. Вымойте канал три раза, трубя 3x объем перевода совместимый буфер на стирку.

5. Сборка и доставка смеси перевода на канал потока для обнаружения одной молекулы

  1. На льду соберите 3x тома смесиперевода 30 в трубке микроцентрифуга после протокола массового перевода из шага 1.7, за исключением опустить мРНК и дополнить оптимизированной концентрацией флуоресцентно помеченных антител. Кратко закрутить трубку микроцентрифуга для того чтобы собрать смешивание перевода на дне пробки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При установлении анализа проверяются различные концентрации антител. Оптимальная концентрация показывает низкое количество неспецифических антител, связывающихся с поверхностью обнаружения, и быструю привязку антител к зарождающемуся пептиду (см. шаги 7.1. и 7.2., соответственно, для деталей калибровки анализа).
  2. Перенесите смесь перевода на внутреннюю сторону крышки трубки микрофуги 0,7 мл. Установите шприц-насос в режим снятия. Вставьте конец трубки насоса в смесь перевода. Начните снятия шприца, чтобы собрать смесь перевода в трубки насоса. Обратный параметр шприц-насоса в режим дозирования и установить поток на оптимальную скорость для доставки смеси перевода.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте генерации пузырьков в переводе смеси при передаче его в трубы насоса. Избегайте снятия перевода смесь слишком глубоко в части трубки, которая не была дезинфицирована и промыть в шаге 3.6. При установлении анализа проверяются различные скорости потока доставки для определения оптимальной скорости (см. шаг 6.2. для получения подробной информации о калибровке анализа).
  3. Если есть разрыв между окончанием трубки и перевод смеси, начать шприц насоса и позволяют перевод смеси для достижения конца трубки, а затем остановить шприц насоса.
  4. Вставьте конец трубки насоса в вход канала потока. Избегайте введения пузырьков воздуха в смесь перевода при выполнении соединения. Стабилизуем соединение путем завинчивания изготовленного на заказ металлического кронштейна на пластину держателя образца микроскопа. Оцените фокус микроскопа и область изображения флуоресценции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Трубки могут быть зажаты в камеру потока с пользовательской частью, как описано ранее33. Другие типы жидкостных систем также могут быть использованы для этого анализа34. Поле зрения должно выглядеть аналогичным до и после подключения труб. Если после подключения появляется больше флуоресцентных пятен, смесь перевода, скорее всего, вытекает из трубки доставки. В зависимости от приложения, канал с утечкой перевода смеси, возможно, потребуется отказаться.
  5. Подтвердите, что параметры приобретения фильма верны и что соответствующее имя файла и каталог были введены для сохранения файлов.
  6. Переместите сцену на изображение области в центре поверхности обнаружения канала потока. На сенсорном экране управления микроскопом выберите вкладку Continuous AF и нажмите кнопку Focus Search and Start, чтобы сохранить фокусное положение во время эксперимента. Звуковой сигнал слышен, когда фокус плоскости успешно достигнута.
  7. В программном обеспечении 2 откройте лазерный затвор. В программном обеспечении 1 нажмите кнопку Take Signal, чтобы начать запись. После примерно 5 с записи введите команду Run в Coolterm, чтобы доставить смесь перевода в канал потока. Рекорд до 2 ч с разрешением времени 0,5-2 с/кадр.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальный промежуток сбора данных зависит от того, как быстро экстракт перевода теряет активность с течением времени, что может быть удобно охарактеризовано выполнением перевода без навалочных клеток с люциферазой репортер мРНК и измерения активности люциферазы в реакции перевода в разныхточках времени 35.
  8. Когда сбор данных завершен, выключите лазер, выключите непрерывный AF на сенсорном экране управления микроскопом и разберут трубы из камеры потока.
  9. Pipette из перевода смеси из потока канала входе, передать его в трубку микрофуза, и оснастки заморозить раствор, поместив трубку в жидкий азот. Позже хранить при -80 градусов по Цельсию.
  10. Вымойте шприц насос трубки три раза с RNase свободной воды, то три раза с 70% этанола. Свями 70% этанола в трубку шприц насоса для хранения.
  11. Выключите микроскоп и все аксессуары. убирать.

6. Анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ данных для этого анализа требует распространенных методов в одномекулярных биофизических исследованиях. Все вычислительные интенсивные шаги могут быть достигнуты с помощью существующих алгоритмов и программного обеспечения (ссылки приведены ниже на соответствующих этапах).

  1. Факультативно: Если это применимо, преобразуй приобретенный файл серии изображений в формат, совместимый с выбранным программным обеспечением обработки изображений или языком программирования.
  2. Определите отправную точку реакции перевода и время обмена реагентами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за диффузии флуоресцентных антител в переводе смеси, фоновая флуоресценция интенсивности изображенной области будет увеличиваться во время обмена реагентами в канале от совместимого с переводом буфера к переводу смеси. Отправной точкой реакции перевода является точка времени завершения обмена реагентами. Эта точка завершения найдена путем измерения интенсивности фоновой флуоресценции во время доставки смеси перевода и определения точки времени, когда увеличение интенсивностифлуоресценции плато 15, как описано ниже.
    1. Рассчитайте общее количество флуоресценции на кадр изображения и свяйте соответствующий профиль времени. Определите внезапное увеличение общей флуоресценции в графике времени.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Общее увеличение флуоресценции связано с увеличением концентрации флуоресцентно помеченных антител во время обмена реагентов.
    2. Определите конечной точкой общей фазы увеличения флуоресценции и установите эту точку времени в качестве отправной точки (т.е. времени 0) реакции перевода. Определите как стартовые, так и конечные точки общей фазы увеличения флуоресценции и установите разницу во времени в качестве времени обмена реагентами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Общий промежуток времени обмена реагентами зависит от размеров канала потока и выбранной скорости потока. Вполне возможно, что некоторые факторы перевода могут начать связываться с мРНК до завершения обмена реагентами, что может уменьшить разрешение установленного времени начала первого раунда. Поэтому рекомендуется тестировать различные скорости потока при настройке анализа и выбрать скорость потока, которая позволяет завершить обмен реагентов в пределах 3-4 с для скорости сбора данных 0,5-2 с/кадр.
  3. Дополнительно: Выполните коррекцию дрейфа фильма.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Положение связанных антител в изображении данных может меняться с течением времени из-за дрейфа частей микроскопа и аксессуаров. Дрифт, визуально заметный в фильме, требует коррекции, прежде чем продолжить анализ данных. Несколько алгоритмов пространственной коррекции дрейфа и скриптовдоступны 36,37,38.
    1. На каждом изображении найдите локаляю максиму в пиксельных счетах, чтобы определить положение связанных антител в каждом кадре с точностью пиксельного уровня. Установите порог для подсчета пикселей таким образом, чтобы были выбраны только пятна, которые явно находятся выше фонового шума.
    2. Рассчитайте изменения отдельных позиций антител в каждом направлении между двумя последовательными кадрами изображения.
    3. Участок гистограммы антител позиционных изменений между двумя последовательными кадрами и сделать это отдельно для каждого направления. Гауссиан вписывается в каждую гистограмму и устанавливает центральное положение пиков как направленный дрейф между двумя последовательными кадрами.
    4. Чтобы противодействовать наблюдаемому дрейфу, переложите каждый кадр изображения в противоположном направлении на расчетную сумму дрейфа.
  4. Постройте одномекулярные траектории.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обнаружение / отслеживание программного обеспечения доступно для выявления ярких пятен и извлечь их интенсивности из серииизображений данных 39,40.
    1. Определите позиции антител, описанные в шаге 6.3.1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Визуальный осмотр рекомендуется для обеспечения того, чтобы выбранный порог не означает чрезмерного или недостаточного сбора частиц. Визуальный осмотр может быть достигнут путем наложения выявленных центроидных позиций на каждый кадр изображения и визуальной оценки их согласия (см. результаты представителя).
    2. Объедините выбранные частицы со всех кадров и удалите избыточные положения частиц.
    3. Визуально проинспектировать изображения связанных антител и выбрать квадратную площадь, в прилагая пикселей с графами, которые явно выше фона и представитель индивидуально связанных антител.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Функция распространения тоска (т.е. размер квадрата для одной молекулы) определяется оптической установкой и размером пикселя детектора.
    4. Для каждой позиции частицы создайте одномекулярную траекторию, вычислив общую интенсивность всех пикселей в квадратной области вокруг положения частицы. Траектории строятся для каждой позиции, кадра за кадром и для всего фильма данных.
  5. Дополнительно: Применить нелинейный фильтр41 вперед-назад, чтобы уменьшить фоновый шум в одномекулярных траекториях.
  6. Дополнительно: Оцифровыв траектории с существующимиалгоритмами обнаружения шагов 42,43,44,45.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор алгоритма step-detection зависит от сложности одномекулярной динамики. Для простейшего сценария только изолированного рибосомного перевода (т.е. без полисомного образования) и хорошего соотношения сигнала к шуму, пороговое применение к подсчетам флуоресценции достаточно для определения сроков связывания антител и диссоциации событий в одномекулярных траекториях. Визуальный осмотр по крайней мере 100 траекторий для каждого состояния рекомендуется для обеспечения того, чтобы шаги траектории были надлежащим образом выбраны стратегией обнаружения шагов.
  7. Определите время первого события связывания антител для каждой траектории (т.е. первого времени прибытия, t1), либо используяоцифрованные траектории, либо применяя порог к недигитизированным траекториям.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Среднее значение распределения первого времени прибытия можно сравнить между различными условиями перевода. Кроме того, распределение первого времени прибытия может быть установлено на сдвинутую (3-параметрную) функциюжурнала-нормального для определения среднего значения 15 lt; t1.gt;. Поскольку распределение первого времени прибытия обычно искажено и имеет длинный хвост, не вычисляйте среднее значение, непосредственно усредняя время первого прибытия.
  8. Необязательно: анализ времени и расчет средней скорости синтеза пептида.
    1. Используйте оцифрованные траектории для определения моносомных (одноберосных) событий перевода в каждой траектории и расчета единого связывающего события в расчете времени как разницы во времени между соответствующими событиями связывания антител и диссоциации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Алгоритмы обнаружения шагов для оцифровки траекторий, как правило, менее надежны, когда несколько молекулярных событий пересекаются во времени. Поэтому рекомендуется исключить полисомные события из анализа времени обитуемого времени. Для высокоэфирных переводческих систем, обогащенных полисомными событиями и нечасто отображающих моносомные события, смесь помеченных и необрюхаемых антител может быть использована для увеличения возможности наблюдения изолированных событий перевода на одномекулярных траекториях.
    2. Подготовь распределение к нормальной функции журнала и используйте установленную функцию для расчета среднего времени обитали.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Расчет среднего непосредственно путем усреднения наблюдаемого времени обита не рекомендуется, поскольку распределение времени обита, как правило, искажено длинными хвостами.
    3. Определите количество аминокислот, которые переводятся во время связывания антител, вычитая сумму длины аминокислоты эпитопа и 35 (средняя аминокислотная длина зарождающегося пептида в рибосомном туннеле выхода) из общего количества кодонов ORF.
    4. Чтобы определить среднюю скорость синтеза пептидов, разделите количество переведенных аминокислот на среднее время обитуемого времени.
  9. Необязательно: Расчет среднего времени начала первогораунда (lt;t1_I
    ПРИМЕЧАНИЕ: Условия посвящения и удлиниения, такие как контекст последовательности сайта посвящения и последовательность кодирования, как правило, намеренно сохраняются для изучения кинетики посвящения. Таким образом, среднее время первого прибытияLt; t1 йgt;от шага 6.7. могут быть использованы непосредственно для расчета изменения в первом раунде инициации кинетики между различными условиями. Следующая коррекция необходима только для определения фактического значения времени начала первого раунда.
    1. Разделите сумму длины эпитопа и 35 (средняя аминокислотная длина зарождающегося пептида в рибосомном туннеле выхода) на среднюю скорость синтеза пептида (от шага 6.8.4.) для расчета среднего времени удлинения пептида этой N-терминальнойобласти (Lt;t1_tag
    2. В качестве первого времени прибытия является сумма первого раунда времяинициации и т1_tag , вычестьlt;t1_tag1_I1_I1_tag

7. Калибровка анализа

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие шаги калибровки при первоначальном установлении анализа.

  1. Чтобы изучить специфичность связывания антител, выполните этапы протокола в разделах 4 и 5 отдельно для нетегов и помеченных мРНК(рисунок 2). Уровни связывания антител в каналах с этими соответствующими мРНК представляют собой степень неспецифического связывания антител с поверхностью обнаружения и специфического антитела, связывающего с зарождающимся пептидом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Специфическое к неспецифическому коэффициенту связывания рекомендуется быть Nogt;10 и может быть увеличено с различными стратегиями пассивации поверхности, более низкой концентрацией антител, или более высокой плотностью поверхности мРНК.
  2. Чтобы измерить скорость связывания антител, выполните протокол дополнительным шагом между шагом 4 и шагом 5.
    1. После шага 4, инкубировать канал с переводом смеси, которая не хватает антител для предварительного создания мРНК / рибосомы / пептидных комплексов.
    2. Затем перейти к шагу 5 и поток антител-дополненной смеси перевода в канал.
    3. Количественная оценка средней скорости связывания антител с заранее сгенерированным зарождающимся пептидом с экспоненциальной установкой к гистограмме первого времени прибытия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Связывание антител с предварительно сгенерированным пептидом должно быть быстрым, в порядке секунд, и должно быть быстрее, чем перевод кинетики. Более высокая концентрация антител может быть использована для увеличения скорости связывания антител.
  3. Фотосемь флюорофора помечены антитела.
    1. Подготовьте слайд в соответствии с протоколом в шаге 2, но пропустите шаг PEGylation. Соберите камеру потока после шага засолинизации. Силановое покрытие позволяет эффективно связывать неспецифические антитела с поверхностью обнаружения.
    2. Добавьте в канал флуоресцентно помеченные антитела для достижения одноямекулярной плотности неспецифических антител, связывающихся с поверхностью обнаружения. Начните с добавления флуоресцентно помеченных антител, которые сильно разбавляют в буфере мытья T50 и постепенно увеличивают концентрацию антител до тех пор, пока не будет достигнута желаемая плотность одной молекулы.
    3. Изображение поверхности обнаружения до тех пор, пока большая часть флуоресценции антител больше не обнаруживается.
    4. Участок общее количество видимых антител с течением времени, чтобы оценить скорость потери флуоресценции антител из-за флюорофора фотоотравливания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Маркировка антител обычно дает несколько флюорофоров на антитела. Индивидуальные антитела остаются обнаруживаемыми до тех пор, пока все конъюгированные фторфоры не будут фотоблей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

После протокола описано позволяет изображения отдельных взаимодействий антител с зарождающейся N-терминал помечены полипептидов с одной молекулы резолюции во время активного клеточного перевода 3 ' конец-tethered репортер mRNA (Рисунок 1). Минимальный демонстрационный эксперимент сообщается с использованием трех синтетических mRNAs: LUC (кодирование untagged luciferase), LUCFLAG (кодирование 3xFLAG-тегами люциферазы), и л.с.LUCFLAG(LUCFLAG со стабильной стволовой петли в 5'лидер области) (Рисунок 2C). Использование мРНК, кодирующей люциферазу, позволяет проводить сравнение между одномекулярными наблюдениями и измерениями массы люминесценции. Целостность 3' биотинилированной мРНК оценивалась путем денатурации полиакриламинидного гель-электрофореза (PAGE) и окрашивания РНК. МРНК хорошего качества показывает одну чистую полосу и не должен показывать дополнительные более быстрые мигрирующие сигналы(рисунок 3A). Saccharomyces cerevisiae перевод экстракт был использован здесь и подготовлен после протокола, который был ранее описан30 и изменены 15. Массовые измерения активности люциферазы в безклеточных реакций перевода с дрожжевой экстракт и биотинилированные LUCFLAG mRNA, что либо не хватает или содержитm 7G крышка показывает крышку стимуляции LUCFLAG mRNA перевод (Рисунок 3B).

Для одномекулярной визуализации экстракт перевода был дополнен 67 нм антитела Cy3,маркированного анти-FLAG (Cy3-'FLAG). Это антитело имело высокое коэффициент маркировки 2-7 красителей на антитело. Лазер 532 нм был установлен на 10 мкГ на цели. Угол лазерного инцидента был установлен на 71,5 ", который был больше, чем критический угол 63,8" для нашей настройки. Низкий уровень флуоресценции был изображен с поверхностей обнаружения, которые содержат мРНК, но не имеют смеси перевода(рисунок 4A). Для размеров каналов примерно 2 мм (ширина) х 50 мкм (глубина) х 24 мм (длина), скорость доставки потока 150 мкл/мин дала время обмена реагентов 3 - 4 с. В течение 5 с доставки смеси перевода, фоновый уровень флуоресценции увеличивается из-за диффузии флуоресцентных антител. Примерно через 2 минуты после доставки смеси перевода наканалы, содержащие LUCFLAG mRNA, пятна Cy3 начали появляться в поле зрения и продолжали накапливаться в течение 30 мин(рисунок 4B). Неспецифические антитела связывания с поверхностью, измеряется с помощью 3xFLAG-отсутствие LUC mRNA (рисунок 2C), остался на очень низком уровне15. Сигналы от mRNA/ribosome/peptide-bound Cy3- QFLAG были ясно видимы с оптимизированным лазерным углом случая но смогли быть замаскированы высоким фоном флуоресценции с более низкими углами случая лазера(рисунок 4C).

Для анализа событий связывания Cy3-КФЛАГ, флуоресцентные интенсивности выбранных пятен Cy3-ЗФЛАГ(рисунок 5A) были рассчитаны кадр за кадром для всего фильма, а затем подключены к форме траектории интенсивности(рисунок 5B). Сырые траектории могут показаться шумными и могут потребовать уточнения с нелинейным фильтром вперед-назад, чтобы уменьшить фоновыйшум 41. Дальнейшее уточнение может быть достигнуто с помощью алгоритмов обнаружения шагов для оцифровкитраекторий 42. Для всех траекторий, универсальное повышение уровня фоновых флуоресценций появляется во время обмена реагентами из-за диффузии флуоресцентных антител впереводе смеси (рисунок 5B). Связывание антител с зарождающимся полипептидом вызвало мгновенное увеличение флуоресценции, в то время как диссоциация антител/полипептида от мРНК вызывает мгновенное снижениефлуоресценции (рисунок 5B).

Время обития связывания антител может быть использовано для измерения общего времени декодирования открытого считывого кадра. Гистограмма времени обита для LUCFLAG mRNA подходит для нормального распределения журнала(рисунок 6A)и дает скорость синтеза пептида 2,5 ± 0,1 аминокислоты в секунду15. Первый момент прибытия гистограмма подходит к сдвинутой (3-параметр) бревенчатой нормальной функции(рисунок 6B). Широкое распространение гистограммы первого времени прибытия показывает высокую степень неоднородности в одной деятельности перевода мРНК. Гистограмма показала, что первое событие синтеза пептида на одиночных молекулах LUCFLAG mRNA может начаться уже через 2 мин, и уже через 20 минут, после доставки смеси перевода(рисунок 6B). По сравнению с переводом с LUCFLAG mRNA, первый момент прибытия гистограммы с л.с. -LUCFLAG mRNA перевод показал медленнее антител связывания (Рисунок 7A). Использование объемных измерений люминесценции от реакций перевода без клеток с этими же mRNAs, однако, не решает различия в переводе кинетики (Рисунок 7B,C). Эти результаты демонстрируют более высокое разрешение нашего метода по сравнению с объемными измерениями активности кинетической люциферазы для обнаружения небольших изменений в кинетике посвящения.

Figure 1
Рисунок 1: Диаграмма потока протокола. Показаны схематические представления обложек и слайд-препаратов, одномекулярная сборка камер, визуализация TIRF и сбор данных, а также этапы анализа данных. Этап изображения TIRF включает схематические изображения иммобилизации мРНК и перевода в канале потока. Показаны компоненты поверхности обнаружения, флуоресцентно помеченные антитела и компоненты клеточного экстракта. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: конструкции мРНК для анализа одной молекулы. (A) Чтобы адаптировать объемный анализ перевода к анализу одной молекулы, шаблон ДНК навалом репортер ORF был изменен с N-терминал эпитоп тегов последовательности вставки для создания помечены репортер кодирования ORF. Указаны регионы кодирования тегов ORF и N-терминала. (B) mRNAs были 5'-м 7G ограничен, чтобы крышка-зависимый перевод и 3 "биотинилированных для их иммобилизации на одной молекулы обнаружения поверхности. 5'-m7G крышка и 3 "биотин показаны на untagged и помечены ORF РНК. (C) Люцифераза кодирования mRNAs были использованы для демонстрации одной молекулы анализа. LUC и LUCFLAG mRNAs кодируют люциферазу, которая отсутствует и содержит тег N-терминал 3xFLAG, соответственно. HP-LUCFLAG mRNA содержит дополнительную вставку, которая вводит в лидера LUCFLAG mRNA 5. На ней указаны термостабельность шпильки, хвост 3'-поли(A) и 3"-биотин. Все три mRNAs включены 30 nt 3 "-поли (A) хвост для более эффективного ограничения зависит от перевода. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Одномекулярный репортер мРНК целостности и объемного перевода. (A)Представитель денатурации PAGE изображения одной молекулы репортер мРНК. 5'-м 7G ограничен и 3 "биотинилированных LUCFLAG mRNA был загружен на денатурации 10% полиакриламинид гель рядом с РНК-лестницы. (B)Одномекулярный репортер мРНК сохранил 5' крышка-зависимость в объемных клеток без переводных реакций. 3 "-биотинилированных LUCFLAG мРНК, что либо не хватало (-шапка) или содержащиеся (я крышка) 5"-м 7G крышка была переведена в S. cerevisiae перевод экстракт в течение 30 минут при 25 градусов по Цельсию. Активность люциферазы измерялась от двух независимых реакций и нормализовалась до активности с помощью мРНК-кап, которая произвольно устанавливается до 1,0. Стандартные отклонения от средних значений указываются барами ошибок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Изображение поверхностей обнаружения, содержащих иммобилизованную мРНК. (A)Фоновая флуоресценция при отсутствии перевода смеси. (B)Cy3 флуоресцентные пятна в поле зрения 30 минут после доставки смеси перевода и с оптимизированным лазерным углом инцидента. (C)Изображение поля зрения 30 мин после доставки смеси перевода и с низким лазерным углом инцидента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Анализ изображений. (A) Cy3 пятна в поле зрения без (левая панель) или с (правая панель) выбор места. (B)Пример одномекулярной траектории для выбранного места Cy3. Черная стрелка указывает на рост фоновой флуоресценции из-за диффузного антитела во время доставки смеси перевода. Зеленая стрелка указывает на внезапное увеличение интенсивности флуоресценции из-за связывания Cy3-'FLAG. Красная стрелка указывает на внезапное снижение интенсивности флуоресценции из-за диссоциации пептида Cy3-'FLAG/nascent от мРНК. Время обитуемого события связывания Cy3-'FLAG указывается двуглавой стрелкой. Указаны необработанные, отфильтрованные и оцифрованные данные. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6: Кинетический анализ связывания Cy3-КФЛАГ с переводом LUCFLAG mRNA. (A) Связывание Cy3-КФЛАГ обитает время гистограммы подходит для журнала нормального распределения. (B) Связывание Cy3-КФЛАГ первого времени прибытия гистограмма подходит к сдвинутой (3-параметр) журнал нормальной функции. Адаптировано от Wang et al.15 с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 7
Рисунок 7: Анализ одной молекулы имеет более высокое разрешение для кинетики посвящения, чем анализ массы люминесценции. (A) Первый момент прибытия гистограммы для Cy3-КФЛАГ связывания с переводом LUCFLAG и л.с.-LUCFLAG mRNAs показали более медленное инициирование, вызванное небольшой структурой шпильки в mRNA 5 "-лидер. Траектории N No 10650(LUCFLAG), в сочетании с 3 наборами данных и траекториями N No 4079(л.с. -LUCFLAG), в сочетании с 2 наборами данных. (B,C) Массовая активность люциферазы анализ кинетических измерений не устранить различия в инициации кинетики для LUCFLAG (N No 9 наборы данных) и л.с. -LUCFLAG (N No 6 наборы данных) мРНК-перевода. (B)Массовая кинетике люминесценции. (C)Разброс участков первого раунда перевод раз определяется Гауссиан установки на второй производной от люминесценции кинетикикривыхв ( B ), как описано Василенко и др. 46. Красные круги и бары в (C) представляют среднее значение и стандартное отклонение рассчитанного времени перевода первого раунда, соответственно. Адаптировано от Wang et al.15 с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

По сравнению с типичными в пробирке TIRF одномекулярных экспериментов, одноямекулярная визуализация с анализом, описанным здесь, дополнительно сложна из-за использования клеточного экстракта и высокой концентрации флуоресцентно помеченных антител. По сравнению с более распространенной практикой одного раунда поверхностного PEGylation, второй раунд PEGylation (шаг 2) значительно снижает неспецифические антитела связывания с поверхностьюобнаружения 15. Высокая концентрация диффузных флуоресцентных антител вызывает чрезвычайно высокий флуоресцентный фон, который маскирует одномекулярное обнаружение связывания антител. Чтобы уменьшить этот флуоресцентный фон, угол лазерного инцидента увеличивается значительно выше критического угла (шаг 3.4.). Обнаружение антител также уменьшается из-за чрезмерной нестабильности флюорофора, что может ограничить возможность количественной оценки времени жизни. При встрече с этой проблемой, заменить флюорофор с более фототаблику флюорофор, такие как те, спряженные в триплет-государство утоличить47, или снизить интенсивность лазерного освещения. Хотя системы очистки кислорода обычно используются в пробирке одноямекулярных экспериментов для подавления фторфора фотоотливания48,49, анализ, описанный здесь может обеспечить очень щедрое окно обнаружения без реализации каких-либо систем очисткикислорода 15. Кроме того, системы очистки кислорода могут значительно снизить эффективность перевода без эукариотических клеток. Таким образом, системы очистки кислорода должны быть тщательно оценены до их использования с этим анализом.

Важно отметить, что небольшие изменения в подготовке реагентов обнаруживаются анализом из-за его одномекулярного разрешения. Например, реплицировать подготовку экстракта перевода можно по-разному, которые могут быть обнаружены или не быть обнаружены объемными методами. Кроме того, циклы замораживания оттепели перевода и других реагентов могут быстро ухудшить переводскую деятельность. Мы рекомендуем проводить небольшие экспериментальные эксперименты с легкодоступным материалом для проверки условий, прежде чем планировать систематическое исследование. Для систематического исследования рекомендуется крупномасштабная подготовка реагентов перевода, одноразовых алицитов для реагентов, чувствительных к замораживанию/оттепели, и согласованность в выполнении протокольных шагов. Перевод экстракт, который вспышки заморожены в жидком азоте и хранятся при -80 градусов по Цельсию показывает минимальные потери активности, по крайней мере два года. Применение этих мер может эффективно подавлять экспериментальные вариации и повышать надежность одномекулярного анализа.

Поскольку этот метод сочетает в себе существующие системы перевода без навалочных клеток и методы визуализации одной молекулы in vitro, устранение неполадок в общих проблемах в этих двух областях здесь не обсуждается. Примерами таких общих вопросов являются низкое качество подготовки репортер мРНК или PEGylated coverslip и низкая активность перевода клеточного экстракта. Здесь мы сосредоточимся на вопросах, характерных для этого метода. В дополнение к ряду технических вопросов, которые обсуждались в протоколе, другой потенциальной проблемой может быть низкий уровень или отсутствие связывания антител в канале потока для условия перевода, которое, как ожидается, будет иметь хорошую активность. Существует несколько возможностей для устранения неполадок. Эффективность биотинилированной иммобилизации мРНК на поверхность обнаружения можно оценить путем аннальизации комплементарных и флюорофорных олигомеров ДНК для обездвиженной мРНК и визуализации флуоресцентной ДНК:РНК дуплексов. Качество перевода смеси и биотинилированных репортер mRNAs могут быть проверены путем запуска объемного анализа перевода. Кроме того, после проведения реакции перевода в мРНК-иммобилизованном канале потока, решение реакции перевода может быть выможено из канала и использовано в анализе деятельности репортера для подтверждения появления в канале перевода. При необходимости, чрезмерно высокая плотность поверхности мРНК может быть использована для реакции на перевод в канале, чтобы облегчить обнаружение анализа активности репортера.

Основным ограничением этого анализа является его разрешение для инициации кинетики. В этом анализе, прямой экспериментальный выход, первое время прибытия, содержит как время первого раунда и пептид удлинения время для перевода эпитопа и 35 дополнительных кодонов. Хотя вклад пептидного времени удлининия может быть исправлен (шаг 6.9.), этот анализ, следовательно, является наиболее чувствительным для измерения кинетики посвящения, которые происходят в порядке минут, который, как представляется, является общим свойством крышки зависимой инициации15. Экспериментально, легко адаптировать этот анализ для изучения других механизмов посвящения. Однако, если механизм посвящения происходит значительно быстро в порядке секунд, этот анализ вряд ли решит кинетику посвящения.

Описанный здесь одномекулярный подход сочетает в себе одномекулярную визуализацию и перевод на основе экстракта, позволяющий измерять отдельные события перевода, зависящие от ограничения, в режиме реального времени и во время активного перевода без клеток. Анализ позволяет легко перейти от объемного анализа перевода к анализу одной молекулы, сохраняя при этом объемную кинетику перевода. Таким образом, одномекулярные кинетические наблюдения могут быть интерпретированы в прямой ссылке на соответствующие объемные результаты. Предыдущие методы, в том числе недавно разработанные in vivo подходы 11,12,13,14, отсутствие разрешения для кинетических измерений отдельных событий инициации перевода и требуют предположения механизмов перевода для извлечения инициации средних от экспериментальных наблюдаемых. Представленный здесь метод с одной молекулой обеспечивает первый подход, свободный от гипотез, для количественной оценки среднего времени начала активного перевода, зависящего от ограничения. Кроме того, хотя объемные кинетические измерения с анализом люминесценции были использованы для обеспечения наиболее количественных и систематических массовых характеристик кап-зависимой кинетики переводана сегодняшний день 46,50, одномекулярный анализ, описанный здесь, измеряет средние кинетические изменения инициации с большей чувствительностью, чем объемный анализ (Рисунок 7). Кроме того, одномерекулярные данные сохраняют одноямявую стохастичность и неоднородность перевода мРНК, свойства, которые усреднеются в массовых измерениях. Одномекулярное разрешение переводческой кинетики может быть использовано для систематического кинетического анализа, чтобы выявить понимание механизмов перевода, недостижимых с другими методами.

Этот анализ совместим с существующими биохимическими и генетическими подходами, которые обычно используются для переводческих исследований. Например, трансляционная функция конкретного фактора может быть изучена путем генерации обедненного фактора экстракта и дополнения его фактором дикого типа или мутанта. Кроме того, дополняя флуоресцентно помеченный фактор, исследования потенциально могут исследовать кинетическую связь между связыванием факторов и прогрессированием перевода. С использованием двух различных пар эпитопов/антител этот протокол потенциально может быть расширен от одноцветного анализа до двухцветного анализа, который позволяет одновременно обнаруживать две различные последовательности кодирования. Эта адаптация позволила бы отслеживать перевод различных кадров для чтения и могла бы быть применена к изменению кадров и началу исследований по отбору сайтов. Кроме того, двухцветная система может быть использована для обнаружения взаимодействий антител с помеченными полипептидами, кодируемыми вверх по течению и вниз по течению открытыми рамками чтения для мониторинга как восходящих, так и нисходящих событий перевода на отдельных мРНК. Эти расширения могут позволить широкий спектр механистических исследований, которые исследуют ограничения зависит перевод и его регулирование.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторов нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (R01GM121847); Мемориальный онкологический центр Слоан Кеттеринг (MSKCC) Грант/Основной Грант (P30 CA008748); и Инициатива MSKCC по функциональной геномике.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100X oil objective, N.A. 1.49 Olympus UAPON 100XOTIRF
Acryamide/bis (40%, 19:1) Bio-Rad 161-0144
Alkaline liquid detergent Decon 5332
Aminosilane (N-(2-Aminoethyl)-3-Aminopropyltrimethoxysilane) UCT Specialties, LLC A0700
Andor ixon Ultra DU 897V EMCCD Andor DU-897U-CSO-#BV
Andor Solis software Andor For controlling the Andor EMCCD
Band-pass filter Chroma 532/640/25
Band-pass filter Chroma NF03-405/488/532/635E-25
Biotin-PEG-SVA Laysan Bio Inc Biotin-PEG-SVA
Coenzyme A free acid Prolume 309-250
Coolterm software For controlling the syringe pump
Desktop computer Dell For controlling the microscope, camera, stage, and pump.
Dichroic mirror Semrock R405/488/532/635
Direct-zol RNA microprep 50RNX Fisher Scientific NC1139450
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega E1910
Epoxy Devcon 14250
Firefly luciferin D-Luciferin free acid Prolume 306-250
Glacial acetic acid Fisher Scientific BP1185500
Hydrogen perioxide Sigma-Aldrich 216763-500ML
Immersion oil Olympus Z-81226A Low auto-fluorescence
Luciferase Assay System Promega E1500
MEGASCRIPT T7 Transcription Kit Thermo fisher AM1334
Methanol Fisher Scientific MMX04751
Microscope Olympus IX83
Microscope slide Thermo Scientific 3048
Monoclonal anti-FLAG M2-Cy3 Sigma-Aldrich A9594
mPEG-SVA Laysan Bio Inc mPEG-SVA-5000
MS(PEG)4 Thermo Scientific 22341
NaCl (5M) Thermo Scientific AM9760G
No 1.5 microscope Cover glass Fisherband 12-544-C
Olympus Laser, 532nm 100mM Olympus digital Laser system CMR-LAS 532nm 100mW
Olympus TirfCtrl software Olympus For controlling the laser intensity and incident angle
Optical table TMC vibration control 63-563 With vibration isolation
Phenol chloroform isoamyl alcohol mix Sigma-Aldrich 77617-100ml
Pierce RNA 3' End Biotinylation Kit Thermo Scientific 20160
Potassium hydroxide pellets Sigma-Aldrich P1767-500G
Prior motorized XY translation stage Prior PS3J100
Prior PriorTest software Prior For controlling the Prior motorized stage
Recombinant RNasin RNase Inhibitor Promega N2515
Stage top Incubator In vivo scientific (world precision Instruments) 98710-1 With a custom built acrylic cage
Staining jar Fisher Scientific 08-817
Streptavidin Thermo Scientific 43-4301
Sulfuric acid Fisher Scientific A300212
SYBR green II Fisher Scientific S7564
Syringe Hamilton 1725RN
Syringe pump Harvard apparatus 55-3333
Tris (1M), pH = 7.0 Thermo Scientific AM9850G
Ultrasonic Bath Branson CPX1800H
Urea Sigma-Aldrich U5378-500G
Vaccinia Capping system New England Biolabs M2080S
Zymo-Spin IC Columns Zymo Research C1004

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hinnebusch, A. G. The scanning mechanism of eukaryotic translation initiation. Annual Review of Biochemistry. 83, 779-812 (2014).
  2. Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 827-835 (2004).
  3. Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 113-127 (2010).
  4. Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. Translational control in cancer. Nature Reviews Cancer. 10, 254-266 (2010).
  5. Saini, A. K., Nanda, J. S., Lorsch, J. R., Hinnebusch, A. G. Regulatory elements in eIF1A control the fidelity of start codon selection by modulating tRNA(i)(Met) binding to the ribosome. Genes and Development. 24, 97-110 (2010).
  6. Algire, M. A., et al. Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system. RNA. 8, 382-397 (2002).
  7. Amrani, N., Ghosh, S., Mangus, D. A., Jacobson, A. Translation factors promote the formation of two states of the closed-loop mRNP. Nature. 453, 1276-1280 (2008).
  8. Pisarev, A. V., Unbehaun, A., Hellen, C. U., Pestova, T. V. Assembly and analysis of eukaryotic translation initiation complexes. Methods in Enzymology. 430, 147-177 (2007).
  9. Hinnebusch, A. G. Structural insights into the mechanism of scanning and start codon recognition in eukaryotic translation initiation. Trends in Biochemical Sciences. 42, 589-611 (2017).
  10. Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The growing toolbox for protein synthesis studies. Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).
  11. Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352, 1425-1429 (2016).
  12. Wang, C., Han, B., Zhou, R., Zhuang, X. Real-time imaging of translation on single mRNA transcripts in live cells. Cell. 165, 990-1001 (2016).
  13. Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. H. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 352, 1430-1435 (2016).
  14. Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. Dynamics of translation of single mRNA molecules in vivo. Cell. 165, 976-989 (2016).
  15. Wang, H., Sun, L., Gaba, A., Qu, X. An in vitro single-molecule assay for eukaryotic cap-dependent translation initiation kinetics. Nucleic Acids Research. 48, 6 (2020).
  16. Aitken, C. E., Lorsch, J. R. A mechanistic overview of translation initiation in eukaryotes. Nature Structural & Molecular Biology. 19, 568-576 (2012).
  17. Anderson, C. W., Straus, J. W., Dudock, B. S. Preparation of a cell-free protein-synthesizing system from wheat germ. Methods in Enzymology. 101, 635-644 (1983).
  18. Erickson, A. H., Blobel, G. Cell-free translation of messenger RNA in a wheat germ system. Methods in Enzymology. 96, 38-50 (1983).
  19. Iizuka, N., Najita, L., Franzusoff, A., Sarnow, P. Cap-dependent and cap-independent translation by internal initiation of mRNAs in cell extracts prepared from Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 14, 7322-7330 (1994).
  20. Iizuka, N., Sarnow, P. Translation-competent extracts from Saccharomyces cerevisiae: effects of L-A RNA, 5' cap, and 3' poly(A) tail on translational efficiency of mRNAs. Methods. 11, 353-360 (1997).
  21. Jackson, R. J., Hunt, T. Preparation and use of nuclease-treated rabbit reticulocyte lysates for the translation of eukaryotic messenger RNA. Methods in Enzymology. 96, 50-74 (1983).
  22. Sachs, M. S., et al. Toeprint analysis of the positioning of translation apparatus components at initiation and termination codons of fungal mRNAs. Methods. 26, 105-114 (2002).
  23. Tarun, S. Z., Sachs, A. B. A common function for mRNA 5' and 3' ends in translation initiation in yeast. Genes and Development. 9, 2997-3007 (1995).
  24. Wang, Z., Sachs, M. S. Ribosome stalling is responsible for arginine-specific translational attenuation in Neurospora crassa. Molecular and Cellular Biology. 17, 4904-4913 (1997).
  25. Wang, Z., Sachs, M. S. Arginine-specific regulation mediated by the Neurospora crassa arg-2 upstream open reading frame in a homologous, cell-free in vitro translation system. Journal of Biological Chemistry. 272, 255-261 (1997).
  26. Fedyukina, D. V., Cavagnero, S. Protein folding at the exit tunnel. Annual Review of Biophysics. 40, 337-359 (2011).
  27. Jha, S., Komar, A. A. Birth, life and death of nascent polypeptide chains. Biotechnology Journal. 6, 623-640 (2011).
  28. Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2, 24 (2019).
  29. Zhovmer, A., Qu, X. Proximal disruptor aided ligation (ProDAL) of kilobase-long RNAs. RNA Biology. 13, 613-621 (2016).
  30. Wu, C., Sachs, M. S. Preparation of a Saccharomyces cerevisiae cell-free extract for in vitro translation. Methods in Enzymology. 539, 17-28 (2014).
  31. Zhao, R., Rueda, D. RNA folding dynamics by single-molecule fluorescence resonance energy transfer. Methods. 49, 112-117 (2009).
  32. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
  33. Deindl, S., Zhuang, X. Monitoring conformational dynamics with single-molecule fluorescence energy transfer: applications in nucleosome remodeling. Methods in Enzymology. 513, 59-86 (2012).
  34. Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. L. DNA curtains for high-throughput single-molecule optical imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).
  35. Gaba, A., Wang, Z., Krishnamoorthy, T., Hinnebusch, A. G., Sachs, M. S. Physical evidence for distinct mechanisms of translational control by upstream open reading frames. The EMBO Journal. 20, 6453-6463 (2001).
  36. Schaffer, B., Grogger, W., Kothleitner, G. Automated spatial drift correction for EFTEM image series. Ultramicroscopy. 102, 27-36 (2004).
  37. Wang, Y., et al. Localization events-based sample drift correction for localization microscopy with redundant cross-correlation algorithm. Optics Express. 22, 15982-15991 (2014).
  38. Sugar, J. D., Cummings, A. W., Jacobs, B. W., Robinson, B. D. A free Matlab script for spacial drift correction. Microscopy Today. 22, 40-47 (2014).
  39. Chenouard, N., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nature Methods. 11, 281-289 (2014).
  40. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
  41. Chung, S. H., Kennedy, R. A. Forward-backward non-linear filtering technique for extracting small biological signals from noise. Journal of Neuroscience Methods. 40, 71-86 (1991).
  42. Ensign, D. L., Pande, V. S. Bayesian detection of intensity changes in single molecule and molecular dynamics trajectories. Journal of Physical Chemistry B. 114, 280-292 (2010).
  43. Blanco, M., Walter, N. G. Analysis of complex single-molecule FRET time trajectories. Methods in Enzymology. 472, 153-178 (2010).
  44. Shuang, B., et al. Fast step transition and state identification (STaSI) for discrete single-molecule data analysis. The Journal of Physical Chemistry Letters. 5, 3157-3161 (2014).
  45. White, D. S., Goldschen-Ohm, M. P., Goldsmith, R. H., Chanda, B. Top-down machine learning approach for high-throughput single-molecule analysis. Elife. 9, 53357 (2020).
  46. Vassilenko, K. S., Alekhina, O. M., Dmitriev, S. E., Shatsky, I. N., Spirin, A. S. Unidirectional constant rate motion of the ribosomal scanning particle during eukaryotic translation initiation. Nucleic Acids Research. 39, 5555-5567 (2011).
  47. Zheng, Q., et al. Ultra-stable organic fluorophores for single-molecule research. Chemical Society Review. 43, 1044-1056 (2014).
  48. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).
  49. Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82, 6132-6138 (2010).
  50. Berthelot, K., Muldoon, M., Rajkowitsch, L., Hughes, J., McCarthy, J. E. Dynamics and processivity of 40S ribosome scanning on mRNA in yeast. Molecular Microbiology. 51, 987-1001 (2004).

Tags

Биохимия выпуск 163 безклеточный эукариотический перевод одномекулярная кинетика перевода визуализация флуоресценции in vitro инициация зависящий от крышки трансляционный контроль анализ in vitro
In Vitro одномекулярной визуализации анализ для анализа Cap-зависимых Перевод Кинетики <em></em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gaba, A., Wang, H., Qu, X. An In … More

Gaba, A., Wang, H., Qu, X. An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics. J. Vis. Exp. (163), e61648, doi:10.3791/61648 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter