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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Un saggio di imaging a singola molecola in vitro per l'analisi della cinetica di traduzione dipendente dal cappuccio

Published: September 15, 2020 doi: 10.3791/61648
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Molecular Biology Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center
* These authors contributed equally

Summary

Il monitoraggio dei singoli eventi di traduzione consente studi cinetici ad alta risoluzione sui meccanismi di traduzione dipendenti dal cappuccio. Qui dimostriamo un saggio a singola molecola in vitro basato sulle interazioni di imaging tra anticorpi etichettati fluorescentmente e peptidi nascenti etichettati epitopi. Questo metodo consente la caratterizzazione a singola molecola della cinetica di iniziazione e allungamento peptidico durante la traduzione attiva in vitro dipendente dal cappuccio.

Abstract

La sintesi proteica cap-dipendente è la via di traduzione predominante nelle cellule eucariotiche. Mentre vari approcci biochimici e genetici hanno permesso studi approfonditi sulla traduzione dipendente dal tappo e sulla sua regolazione, manca ancora la caratterizzazione cinetica ad alta risoluzione di questo percorso di traduzione. Recentemente, abbiamo sviluppato un saggio in vitro per misurare la cinetica di traduzione dipendente dal tappo con risoluzione a singola molecola. Il saggio si basa sul legame anticorpale etichettato fluorescentmente al polipeptide nascente con tag epitopo. Imaging del legame e della dissociazione degli anticorpi da e verso i nascenti complessi peptidico-ribosoma-mRNA, è possibile tracciare la progressione di traslazione sui singoli mRNA. Qui, presentiamo un protocollo per stabilire questo saggio, tra cui mRNA e preparati di scorrimento PEGylated, imaging in tempo reale della traduzione e analisi delle traiettorie di singole molecole. Questo saggio consente il monitoraggio dei singoli eventi di traduzione dipendenti dal tappo e risolve la cinetica di traduzione chiave, come i tassi di iniziazione e allungamento. Il saggio può essere ampiamente applicato a sistemi di traduzione distinti e dovrebbe ampiamente beneficiare di studi in vitro di cinetica di traduzione cap-dependent e meccanismi di controllo traslizionale.

Introduction

La traduzione nei sistemi eucarioti avviene prevalentemente attraverso vie 7-metilguanosina (m7G) cap-dipendenti1. Gli studi indicano che la fase di iniziazione della traduzione eucariota è la limitazione del tasso e un obiettivo comune perla regolamentazione 2,3,4. I meccanismi di traduzione dipendente dal tappo sono stati ampiamente studiatiutilizzando approcci genetici 5,biochimici 6,7,8,strutturali 9e genomici a 10 rinfuse. Sebbene questi metodi abbiano identificato diversi meccanismi che regolano l'iniziazione dipendente dal limite, la loro risoluzione li limita alla media dei segnali provenienti da eventi di iniziazione eterogenei e asincroni. Più recentemente, singoli eventi di traduzione in vivo sono stati visualizzati con metodi che misurano il legame degli anticorpi fluorescenti agli epitopi sui polipeptidinascenti 11,12,13,14. Tuttavia, questi nuovi approcci sono anche limitati nella loro capacità di risolvere singoli eventi di iniziazione perché più anticorpi fluorescenti devono legare un peptide nascente per consentire a singoli eventi di traduzione di essere risolti da un alto sfondo di fluorescenza intracellulare. In molte interazioni biologiche, i singoli eventi cinetici risolti hanno fornito approfondimenti critici sulla comprensione di complessi processi biologici multistep e ripetitivi che non sono possibili sincronizzare a livello molecolare. Sono necessari nuovi metodi in grado di tenere traccia delle dinamiche dei singoli eventi di traduzione per una migliore comprensione dell'avvio e della regolazione dipendenti dal limite.

Recentemente abbiamo sviluppato un saggio in vitro che misura la cinetica di iniziazione dipendente dal tappo con risoluzione a singola molecola15. Considerando il gran numero di fattori proteici noti e sconosciuti coinvolti in questa viadi iniziazione 3,16, il saggio a singola molecola è stato sviluppato per essere compatibile con i sistemi di traduzione in vitro esistenti per beneficiare della loro conservazione dei fattori cellulari e della robusta attività ditraduzione 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Inoltre, l'uso di sistemi di traduzione senza cellule consente confronti più compatibili tra osservazioni a singola molecola e risultati di massa precedenti. Questo approccio fornisce un'integrazione diretta di nuove intuizioni cinetiche a singola molecola nel quadro meccanicistico esistente di iniziazione dipendente dal tappo. Per stabilire il saggio a singola molecola, il tradizionale sistema di traduzione senza cellule viene modificato in tre modi: una sequenza di codifica epitopica viene inserita all'inizio del frame di lettura aperto (ORF) di un mRNA reporter; l'estremità 3′ dell'mRNA reporter è biotinilata per facilitare il end-tethering dell'mRNA alla superficie di rilevamento a singola molecola; e gli anticorpi con etichetta fluorescente sono integrati nell'estratto di traduzione. Queste modifiche richiedono solo tecniche di biologia molecolare di base e reagenti comunemente disponibili. Inoltre, queste modifiche e le condizioni di imaging a singola molecola preservano la cinetica di traduzione delle reazioni di traduzione senza cellule sfuse15.

In questo saggio (Figura 1), l'mRNA del reporter biotinilato 5′-end limitato e 3′-end è immobilizzato su una superficie di rilevamento rivestita di streptavidina in una camera di flusso. La camera di flusso viene quindi riempita con una miscela di traslazione priva di cellule integrata con anticorpi etichettati fluorescentmente. Dopo che la traduzione dell'mRNA si è verificata per circa 30-40 codoni a valle della sequenza epitopica26,27, l'epitopo emerge dal tunnel di uscita ribosoma e diventa accessibile per interagire con anticorpi etichettati fluorescentmente. Questa interazione è rapida e il suo rilevamento da parte di tecniche di imaging a fluorescenza a singola molecola consente il tracciamento della cinetica di traslazione con risoluzione a singola molecola durante la traduzione attiva senza cellule. Questo saggio dovrebbe ampiamente giovare agli studi in vitro sulla cinetica traslazione dipendente dal tappo e sulla sua regolazione, in particolare per i sistemi con una massa di lavoro in test in vitro.

Un prerequisito per stabilire questo saggio a singola molecola è un saggio di traduzione senza cellule sfuse funzionante, che può essere ottenuto utilizzando estratto di traduzione disponibile in commercio o preparato seguendo i metodiprecedentemente descritti 28. L'estratto di traduzione eucariotica può essere ottenuto da diverse cellule, tra cui fungino, mammifero e pianta28. Per l'imaging, questo test richiede un microscopio TIRF dotato di intensità laser tonnibile e angolo incidente, uno stadio campione motorizzato, un sistema di fluidic motorizzato e un dispositivo di controllo della temperatura del campione. Tali requisiti sono generici per i moderni esperimenti TIRF a singola molecola in vitro e possono essere raggiunti in modo diverso. L'esperimento qui presentato utilizza un sistema TIRF di tipo oggettivo composto da microscopio, software e accessori disponibili in commercio tutti elencati nella Tabella dei Materiali.

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Protocol

1. Generazione di mRNA reporter

  1. Modificare un modello di trascrizione del DNA che codifica un mRNA reporter "senza tag" di test di massa inserendo una sequenza di codifica tag epitopo N-terminale per generare un modello di trascrizione del DNA per un mRNA reporter "taggato" (Figura 2A).
    NOTA: L'interazione 3xFLAG/anti-FLAG è consigliata per questo test grazie alla sua sensibilità superiore e alla breve lunghezza dell'etichetta 3xFLAG. Tuttavia, il saggio è compatibile con altre coppie epitopo/ anticorpo.
  2. Sintetizzare RNA senza tag e tag utilizzando modelli di DNA linearizzati e un kit di trascrizione in vitro (vedi Tabella dei materiali). Tipicamente, 10-20 pmol di RNA trascritto in vitro sono sufficienti per la successiva elaborazione dell'RNA per consentire uno studio sistematico a singola molecola.
  3. Tappare l'estremità dell'RNA 5′ (Figura 2B) con un kit di tappatura m7G (vedi Tabella dei materiali) seguendo la raccomandazione del produttore.
  4. Biotinilato l'estremità RNA 3′ (Figura 2B) utilizzando un kit di biotinilazione (vedi Tabella dei Materiali) secondo il protocollo fornito con il kit. Purificare gli RNA mediante estrazione fenolo-cloroformio seguita da purificazione con una colonna di spin. Elute RNA in 10-20 μL di acqua priva di RNasi. Circa il 40-50% dell'RNA di ingresso non con chiave viene recuperato.
  5. Valutare l'integrità e la concentrazione dell'RNA denaturando l'elettroforesi del gel di acrilammide e la colorazione dell'RNA, come descrittoin precedenza 29.
  6. Eseguire la traduzione bulk senza celle30 con l'mRNA reporter taggato 3′-end per confermare che l'mRNA modificato conserva le proprietà di traduzione che sono di interesse. Ad esempio, la traduzione dipendente dal tappo può essere confermata misurando e confrontando le attività dei giornalisti nelle reazioni di traduzione senza celle in blocco con mRNA reporter non con cappuccio e limitato (vedere Risultati rappresentativi).

2. Preparazione della camera di flusso

  1. Selezionate uno spessore di copertina appropriato, come specificato dal foglio di specifiche oggettive del microscopio. Selezionare uno scivolo di vetro o quarzo per sistemi di imaging tirf (Total Internal Reflection Fluorescence) a riflessione interna totale (TIRF) di tipo obiettivo o prisma31,rispettivamente.
  2. Eseguire la pulizia, la salinizzazione, la PEGylation e l'assemblaggio a camera di coverslip e slide seguendo il protocollo descritto da Chandradoss etal.
    1. Lavare gli scivoli contenenti fori forati in detersivo liquido alcalino al 10% (v/v) per 20 minuti con sonicazione. Combinare le diapositive e le copertine per tutti i passaggi di pulizia rimanenti.
    2. Salta la fase di lavaggio dell'acetone. Estendere il tempo di incubazione dell'incisione piranha da 20 minuti a 1 h. Incubare la PEGylation al primo turno per 3 ore. Incubare la PEGylation al secondo turno con MS(PEG)4 per 3 h.

3. Preparazione delle attrezzature

  1. Almeno 3 ore prima di eseguire un esperimento a singola molecola, accendere l'incubatore del microscopio e ridurre il flusso d'aria a bassa velocità per evitare eccessivi disturbi acustici degli esperimenti. Impostare la temperatura dell'incubatore sulla temperatura ottimale per il sistema di traduzione privo di celle.
    NOTA: La traduzione è estremamente sensibile alla temperatura. La temperatura di reazione ottimale è specifica per ogni sistema di estrazione cellulare. La caratterizzazione della temperatura di reazione è un passo vitale nello sviluppo di un sistema di traduzione senza celle sfuse. Questo saggio a singola molecola deve essere condotto alla stessa temperatura ottimale della corrispondente condizione di traslazione alla rinfusa.
  2. Almeno 1 h prima di eseguire un esperimento a singola molecola accende il laser premendo il pulsante di accensione laser dietro la scatola laser, ruotare il tasto di sicurezza laser e premere il pulsante di avvio; accendere il microscopio e toccare il pannello di controllo touch screen per selezionare la modalità di imaging, l'obiettivo e il set di filtri.
  3. Accendere la fotocamera EMCCD, il controller del palco Prior e la pompa della siringa premendo i pulsanti di accensione. Accendere il computer e aprire il software Andor Solis (software 1) per controllare la fotocamera EMCCD, TirfCtrl (software 2) per controllare il laser, PriorTest (software 3) per controllare lo stadio motorizzato e Coolterm per controllare la pompa della siringa. Lasciare raffreddare e stabilizzare la fotocamera alla temperatura di lavoro designata prima dell'inizio dell'acquisizione dei dati.
  4. Nel software 2, confermare che i parametri corretti sono impostati per la lunghezza d'onda del laser, il tipo obiettivo e l'indice di rifrazione di vetro e campione. Fare clic sul pulsante Connetti. Per impostare l'intensità del laser, fare clic sul pulsante Controllo accanto alla lunghezza d'onda del laser, quindi nella finestra pop-up del controllo laser trascinare la barra di scorrimento di intensità. Impostare il laser sull'angolo desiderato trascinando la barra di scorrimento in posizione fibra o immettendo la profondità di penetrazione corrispondente. Assicurarsi che la casella Dell'otturatore sia selezionata per mantenere il laser in modalità Off quando non si verifica l'imaging.
    NOTA: aprire e chiudere l'otturatore laser selezionando la casella dell'otturatore. Quando si stabilisce inizialmente il saggio, è necessario testare diverse intensità laser e angoli di incidente per un rilevamento ottimale di singole molecole. L'intensità ottimale del laser bilancia la luminosa fluorescenza a singola molecola e il rapido fotobleaching dei fluorofori. L'angolo incidente deve essere aumentato oltre l'angolo critico per ridurre l'alto sfondo fluorescente dagli anticorpi etichettati diffusivi fino a quando gli anticorpi legati all'mRNA non sono chiaramente risolti. Come riferimento, un laser a 532 nm è stato impostato su 10 μW all'obiettivo con l'angolo incidente laser impostato a 71,5° in unostudio 15 utilizzando anti-FLAG etichettato Cy3 con un rapporto di etichettatura di 2-7 coloranti per anticorpo.
  5. Nel software 1, scegliete Kinetic in modalità acquisizione, immettete i parametri per il tempo di esposizione, la lunghezza della serie cinetica e il valore di guadagno EM. Scegliere la directory e assegnare nomi di file per salvare il file di immagine dati.
  6. Impostare la pompa della siringa su una portata da modesta a veloce per la successiva fase di lavaggio dei tubi.
    Pipettare un'aliquota del 70% di etanolo in un tubo di microfugo, inserire l'estremità del tubo della pompa della siringa nella soluzione di etanolo e utilizzare Coolterm per alternare la pompa della siringa tra le modalità di ritiro e erogazione tre volte per lavare i tubi. Ripetere utilizzando acqua priva di RNasi.
    NOTA: La lunghezza del tubo deve essere abbastanza lunga da consentire l'erogazione della miscela di traslazione al passaggio 5 per contattare solo il tubo, non la siringa. Il volume di risciacquo qui dovrebbe essere maggiore del volume della miscela di traslazione dispensata per garantire che la miscela di traduzione al passaggio 5 rimanga a contatto con tubi igienizzati.
  7. Dopo aver erogato il risciacquo finale dell'acqua, rimuovere l'acqua residua dall'interno del tubo tamponando l'estremità del tubo su una salvietta di tessuto pulita. Mantenere l'estremità del tubo asciutta impostandola in un tubo di microfugo pulito.

4. Immobilizzazione dell'mRNA biotinilato a 3′end

  1. Mantenere l'estratto cellulare e la miscela di traslazione congelati sul ghiaccio secco fino a poco prima del loro uso. Scongelare i reagenti congelati rimanenti e mantenerli sul ghiaccio.
  2. Posizionare la camera di flusso nel portacampioni del microscopio con il lato copriscivolo rivolto verso il basso e fissarlo in posizione con il nastro adesivo. Utilizzare il nastro adesivo per coprire le entrate e le uscite dei canali di flusso non in uso.
  3. Pipetta un volume di 1,5x (rispetto al volume del canale; si applica anche ad altri passaggi del passaggio 4 e del passaggio 5) di 0,2 mg/mL di streptavidina nel canale di flusso e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
  4. Per rimuovere la streptavidina non vincolata, lavare il canale tre volte convogliando in un volume 3x di tampone di lavaggio T50 (20 mM Tris HCl, pH 7.0, 50 mM NaCl, 0.2 U/μL RNasi reagente di inibizione) per lavaggio.
    NOTA: È importante evitare che i rifiuti liquidi fluiranno di nuovo nel canale. Se l'uscita del canale di flusso non è collegata a un tubo di raccolta dei rifiuti, posizionare una carta velina piegata vicino all'uscita per assorbire il liquido che fuoriesca dal canale.
  5. Trasferire l'estratto di traduzione e mescolare dal ghiaccio secco al ghiaccio e consentire loro di scongelarsi.
  6. Metti una goccia di olio ad immersione sull'obiettivo. Posizionare il portacampioni del microscopio con la camera di flusso nello stadio del microscopio. Avvicinare l'obiettivo al coverslip fino a quando l'olio di immersione sull'obiettivo contatta il coverslip. Spostare lo stadio campione in modo che la posizione del canale di flusso sia direttamente sopra l'obiettivo.
  7. Nel software 2, aprire l'otturatore laser e regolare il livello di intensità del laser.
  8. Nel touchscreen del controllo microscopio selezionare la scheda Messa a fuoco e fare clic sul pulsante Ricerca messa a fuoco e Start. Un segnale acustico viene ascoltato quando un piano di messa a fuoco viene raggiunto con successo.
  9. Immagine della superficie del canale di flusso in modalità Live nel software 1. Ottimizza la messa a fuoco per un'immagine più nitida regolando la posizione oggettiva con il controllo del passo fine sul touch screen.
  10. Nel software 3, spostare lo stadio per valutare il livello di sfondo della fluorescenza in varie aree della superficie di rilevamento del canale di flusso. Se la fluorescenza è bassa, continuare con l'esperimento. Se lo sfondo di fluorescenza è eccessivamente alto, prendere in considerazione l'eliminazione del canale di flusso.
  11. Nel software 2 chiudere l'otturatore laser.
  12. Pipettare il tampone di lavaggio T50 dal canale di flusso e pipettare immediatamente in un volume 2x di soluzione di mRNA biotinilato al canale di flusso. Incubare per 15 minuti.
    NOTA: Per ogni lotto di preparazione dell'mRNA, le concentrazioni di mRNA e i tempi di incubazione devono essere testati per ottenere la densità superficiale dell'mRNA necessaria per il rilevamento di singole molecole. L'appropriata densità superficiale dell'mRNA media il legame anticorpale che mostra macchie fluorescenti con non più del ~5% di sovrapposizione (vedere Risultati rappresentativi). Come punto di partenza, si raccomanda l'mRNA biotinilato ad una concentrazione di 2-20 nM.
  13. Lavare il canale tre volte convogliando un volume 3x di buffer compatibile di traslazione per lavaggio.

5. Assemblaggio e consegna del mix di traduzione a un canale di flusso per il rilevamento di singole molecole

  1. Sul ghiaccio, assemblare volumi 3x della miscela ditraslazione 30 in un tubo di microcentrifugo seguendo il protocollo di traduzione sfusa del passaggio 1.7, ad eccezione dell'mRNA ometti e del supplemento con una concentrazione ottimizzata di anticorpi etichettati fluorescentmente. Ruotare brevemente il tubo di microcentrifugo per raccogliere la miscela di traslazione nella parte inferiore del tubo.
    NOTA: Quando si stabilisce il saggio, vengono testate diverse concentrazioni di anticorpi. La concentrazione ottimale mostra basse quantità di anticorpi non specifici che si legano alla superficie di rilevamento e un legame rapido degli anticorpi al peptide nascente (vedere rispettivamente i passaggi 7.1. e 7.2., per i dettagli di calibrazione del saggio).
  2. Trasferire la miscela di traslazione all'interno di un tappo del tubo di microfugo da 0,7 ml. Impostare la pompa della siringa sulla modalità di ritiro. Inserire l'estremità del tubo della pompa nel mix di traslazione. Avviare il prelievo della siringa per raccogliere il mix di traslazione nel tubo della pompa. Invertire l'impostazione della pompa della siringa sulla modalità di erogazione e impostare il flusso su una velocità ottimale per l'erogazione della miscela di traslazione.
    NOTA: Evitare di generare bolle nel mix di traslazione quando lo si trasferisce nel tubo della pompa. Evitare di ritirare il mix di traduzione troppo in profondità nella parte del tubo che non è stata igienizzata e risciacquata nel passaggio 3.6. Quando si stabilisce il saggio, vengono testate diverse portate di consegna per determinare la velocità ottimale (vedere il passaggio 6.2. per i dettagli sulla calibrazione del saggio).
  3. Se c'è uno spazio tra l'estremità del tubo e la miscela di traslazione, avviare la pompa della siringa e consentire alla miscela di traslazione di raggiungere l'estremità del tubo, quindi arrestare la pompa della siringa.
  4. Inserire l'estremità del tubo della pompa nell'ingresso del canale di flusso. Evitare di introdurre bolle d'aria nel mix di traslazione quando si esegue la connessione. Stabilizzare la connessione avvitando la staffa metallica su misura sulla piastra portacampioni del microscopio. Valutare la messa a fuoco del microscopio e la fluorescenza dell'area di imaging.
    NOTA: Il tubo può essere bloccato alla camera di flusso con una parte personalizzata come descritto in precedenza33. Altri tipi di sistemi fluidici possono essere utilizzati anche per questo saggio34. Il campo visivo dovrebbe apparire simile prima e dopo il collegamento del tubo. Se dopo la connessione compaiono più punti fluorescenti, è probabile che il mix di traduzione perda dal tubo di consegna. A seconda dell'applicazione, potrebbe essere necessario scartare il canale con mix di traduzione trapelato.
  5. Verificare che i parametri di acquisizione del filmato siano corretti e che siano stati immessi il nome file e la directory appropriati per il salvataggio dei file.
  6. Spostare lo stage per creare un'immagine di un'area al centro della superficie di rilevamento del canale di flusso. Nel touch screen di controllo del microscopio selezionare la scheda AF continuo e fare clic sul pulsante Ricerca messa a fuoco e Start per mantenere la posizione focale durante l'esperimento. Un segnale acustico viene ascoltato quando un piano di messa a fuoco viene raggiunto con successo.
  7. Nel software 2 aprire l'otturatore laser. Nel software 1 fare clic sul pulsante Prendi segnale per avviare la registrazione. Dopo circa 5 s di registrazione, immettere il comando Esegui in Coolterm per distribuire il mix di traslazione nel canale di flusso. Registrare fino a 2 ore con una risoluzione del tempo di 0,5-2 s/frame.
    NOTA: L'intervallo massimo di acquisizione dei dati dipende dalla velocità con cui l'estratto di traduzione perde attività nel tempo, che può essere convenientemente caratterizzato dall'esecuzione di traduzioni in blocco senza celle con mRNA del reporter luciferasi e misurando l'attività della luciferasi nelle reazioni di traduzione in diversi puntidi tempo 35.
  8. Al termine dell'acquisizione dei dati, spegnere il laser, spegnere l'AF continuo sul touch screen di controllo del microscopio e smontare il tubo dalla camera di flusso.
  9. Pipettare la miscela di traslazione dall'ingresso del canale di flusso, trasferirla in un tubo di microfugo e congelare la soluzione posizionando il tubo in azoto liquido. Conservare successivamente a -80 °C.
  10. Lavare il tubo della pompa della siringa tre volte con acqua priva di RNasi, quindi tre volte con il 70% di etanolo. Prelevare il 70% di etanolo nei tubi della pompa della siringa per lo stoccaggio.
  11. Spegnere il microscopio e tutti gli accessori. pulire.

6. Analisi dei dati

NOTA: L'analisi dei dati per questo saggio richiede metodi comuni negli studi biofisici a singola molecola. Tutti i passaggi ad alta intensità di calcolo possono essere ottenuti utilizzando algoritmi e software esistenti (i riferimenti sono inclusi di seguito ai passaggi corrispondenti).

  1. Facoltativo: se applicabile, convertire il file della serie di immagini acquisita in un formato compatibile con il software di elaborazione delle immagini o il linguaggio di programmazione scelto.
  2. Determinare il punto iniziale della reazione di traslazione e il tempo di scambio dei reagenti.
    NOTA: A causa della diffusione di anticorpi fluorescenti nel mix di traslazione, l'intensità di fluorescenza di fondo di un'area di immagine aumenterà durante lo scambio di reagenti nel canale dal buffer compatibile di traslazione al mix di traslazione. Il punto iniziale della reazione di traslazione viene impostato come punto di tempo al termine dello scambio di reagenti. Questo punto di completamento si trova misurando l'intensità della fluorescenza di fondo durante la consegna della miscela di traslazione e identificando il punto di tempo in cui l'intensità di fluorescenzacrescente si altizza 15, come descritto di seguito.
    1. Calcola il conteggio totale della fluorescenza per fotogramma dell'immagine e traccia il profilo di tempo corrispondente. Identificare l'improvviso aumento della fluorescenza totale nel grafico del profilo del tempo.
      NOTA: L'aumento totale della fluorescenza è dovuto alla crescente concentrazione di anticorpi etichettati fluorescentmente durante lo scambio di reagenti.
    2. Identificare il punto finale della fase di aumento della fluorescenza totale e impostare questo punto di tempo come punto di partenza (cioè il tempo 0) della reazione di traslazione. Identificare sia i punti iniziale che finale della fase di aumento della fluorescenza totale e impostare la differenza di tempo come tempo di scambio del reagente.
      NOTA: L'intervallo di tempo totale dello scambio di reagenti dipende dalle dimensioni del canale di flusso e dalla portata selezionata. È possibile che alcuni fattori di traduzione possano iniziare a legarsi all'mRNA prima del completamento dello scambio di reagenti, il che potrebbe ridurre la risoluzione del tempo di iniziazione determinato al primo turno. Si consiglia pertanto di testare diverse portate quando si imposta il saggio e selezionare le portate che consentono il completamento dello scambio di reagenti entro 3-4 s per velocità di acquisizione dati di 0,5-2 s/frame.
  3. Facoltativo: eseguire la correzione della deriva del filmato.
    NOTA: Le posizioni degli anticorpi legati nell'immagine dei dati potrebbero cambiare nel tempo a causa della deriva di parti e accessori del microscopio. La deriva visivamente evidente in un filmato richiede una correzione prima di procedere ulteriormente con l'analisi dei dati. Diversi algoritmi e script di correzione della deriva spaziale sonodisponibili 36,37,38.
    1. In ogni immagine, trova i massimi locali nel numero di pixel per determinare le posizioni degli anticorpi legati in ogni fotogramma con precisione a livello di pixel. Impostare una soglia per il conteggio dei pixel in modo che siano selezionati solo i punti chiaramente al di sopra del rumore di fondo.
    2. Calcola le variazioni delle singole posizioni degli anticorpi in ogni direzione tra due fotogrammi immagine consecutivi.
    3. Tracciare l'istogramma dei cambiamenti posizionali degli anticorpi tra due fotogrammi consecutivi e farlo separatamente per ogni direzione. Gaussiano si adatta ad ogni istogramma e imposta la posizione centrale dei picchi come deriva direzionale tra due fotogrammi consecutivi.
    4. Per contrastare la deriva osservata, spostare ogni fotogramma dell'immagine nella direzione opposta in base alla quantità di deriva calcolata.
  4. Costruisci traiettorie a singola molecola.
    NOTA: È disponibile un software di rilevamento/tracciamento per identificare i punti luminosi ed estrarne l'intensità dalla seriedi immagini dati 39,40.
    1. Identificare le posizioni degli anticorpi come descritto nel passaggio 6.3.1.
      NOTA: Si raccomanda l'ispezione visiva per garantire che la soglia scelta non dia luogo a un eccessivo sovrasezione o sottosezione delle particelle. L'ispezione visiva può essere ottenuta sovrapponendo le posizioni baricentre identificate su ogni fotogramma dell'immagine e valutando visivamente il loro accordo (vedere Risultati rappresentativi).
    2. Combinare le particelle raccolte da tutti i fotogrammi e rimuovere le posizioni delle particelle ridondanti.
    3. Ispezionare visivamente le immagini degli anticorpi legati e selezionare un'area quadrata che racchiude i pixel con conteggi chiaramente superiori allo sfondo e rappresentativi degli anticorpi legati individualmente.
      NOTA: La funzione di diffusione del punto (cioè la dimensione del quadrato per una singola molecola) è determinata dalla configurazione ottica e dalla dimensione dei pixel del rivelatore.
    4. Per ogni posizione di particella, costruire una traiettoria a singola molecola calcolando l'intensità totale di tutti i pixel nell'area quadrata intorno alla posizione delle particelle. Le traiettorie vengono costruite per ogni posizione, fotogramma per fotogramma e per l'intero filmato dei dati.
  5. Facoltativo: applicare un filtro forward-backward non lineare41 per ridurre il rumore di fondo nelle traiettorie a singola molecola.
  6. Facoltativo: digitalizzare le traiettorie con gli algoritmi di rilevamento deigradini esistenti 42,43,44,45.
    NOTA: La scelta dell'algoritmo di rilevamento a gradini dipende dalla complessità della dinamica a singola molecola. Per lo scenario più semplice di una sola traduzione ribosoma isolata (cioè nessuna formazione polisoma) e di un buon rapporto segnale/rumore, un'applicazione di soglia ai conteggi della fluorescenza è sufficiente per identificare la tempistica degli eventi di legame e dissociazione degli anticorpi nelle traiettorie a singola molecola. Si consiglia l'ispezione visiva di almeno 100 traiettorie per ogni condizione per garantire che i passaggi di traiettoria siano stati selezionati in modo appropriato da una strategia di rilevamento dei passaggi.
  7. Determinare l'ora del primo evento di legame anticorpale per ogni traiettoria (ad esempio, prima ora di arrivo, t1), utilizzando traiettorie digitalizzate o applicando una soglia a traiettorie nongitate.
    NOTA: il valore mediano della distribuzione dell'orario di primo arrivo può essere confrontato tra diverse condizioni di traduzione. In alternativa, la distribuzione dell'orario di primo arrivo può essere adattata a una funzione log-normale spostata (3 parametri) per determinare ilvalore medio 15 <t1>. Poiché la distribuzione dell'orario di primo arrivo è in genere distorta e ha una coda lunga, non calcolare la media calcolando direttamente la media rispetto ai primi tempi di arrivo osservati.
  8. Facoltativo: analisi del tempo di dimora e calcolo del tasso medio di sintesi peptidica.
    1. Utilizzare traiettorie digitalizzate per identificare eventi di traslazione mononomi (singolo ribosoma) in ogni traiettoria e calcolare i tempi di rigonfiamento del singolo evento di legame come differenza di tempo tra i corrispondenti eventi di legame e dissociazione degli anticorpi.
      NOTA: gli algoritmi di rilevamento dei gradini per la digitalizzazione delle traiettorie sono generalmente meno affidabili quando più eventi molecolari si sovrappongono nel tempo. Si raccomanda pertanto di escludere gli eventi polisome dall'analisi del tempo di dimora. Per sistemi di traduzione altamente attivi che sono arricchiti con eventi polisomeri e raramente mostrano eventi monosome, una miscela di anticorpi etichettati e senza etichetta può essere utilizzata per aumentare la possibilità di osservare eventi di traduzione isolati in traiettorie a singola molecola.
    2. Adattare la distribuzione a una funzione log-normale e utilizzare la funzione adattata per calcolare il tempo medio di dimora.
      NOTA: Calcolare direttamente la media calcolando i tempi di permanenza osservati non è raccomandato perché le distribuzioni del tempo di permanenza sono tipicamente inclinate con lunghe code.
    3. Determinare il numero di amminoacidi che vengono tradotti durante il tempo di rilegatura dell'anticorpo sottraendo la somma della lunghezza dell'amminoacido epitopo e 35 (la lunghezza media degli amminoacidi del peptide nascente all'interno del tunnel di uscita ribosoma) dal numero totale di codoni ORF.
    4. Per determinare il tasso medio di sintesi peptidica, dividere il numero di amminoacidi tradotti per il tempo medio di dimora.
  9. Facoltativo: calcolo del tempo medio di avvio del primo turno (<t1_I>).
    NOTA: Le condizioni di iniziazione e allungamento, come il contesto della sequenza del sito di iniziazione e la sequenza di codifica, sono generalmente conservate deliberatamente per gli studi sulla cinetica di iniziazione. Pertanto, il primo orario medio di arrivo <t1> dal passaggio 6.7. può essere utilizzato direttamente per calcolare la variazione della cinetica di iniziazione del primo turno tra diverse condizioni. La seguente correzione è necessaria solo per determinare il valore effettivo del tempo di avvio del primo turno.
    1. Dividere la somma della lunghezza dell'epitopo e 35 (la lunghezza media degli amminoacidi del peptide nascente all'interno del tunnel di uscita ribosoma) per il tasso medio di sintesi peptidica (dal passaggio 6.8.4.) per calcolare il tempo medio di allungamento peptidico di questa regione N-terminale (<t1_tag>).
    2. Poiché la prima ora di arrivo è la somma del tempo di avvio del primo turno e t1_tag, sottrarre <t1_tag> dall'ora media di primo arrivo <t1> per calcolare il tempo medio di avvio del primo turno <t1_I>: <t1_I> = <t1> - <t1_tag>

7. Calibrazione del saggio

NOTA: Eseguire le seguenti fasi di calibrazione quando si stabilisce inizialmente il saggio.

  1. Per esaminare la specificità del legame anticorpale, eseguire separatamente i passaggi del protocollo nelle sezioni 4 e 5 per gli mRNA non taggati e taggati (Figura 2). I livelli di legame anticorpale nei canali con questi rispettivi mRNA rappresentano l'estensione dell'anticorpo non specifico che si lega alla superficie di rivelazione e l'anticorpo specifico che si lega al peptide nascente.
    NOTA: Si raccomanda che il rapporto di legame specifico o non specifico sia >10 e può essere aumentato con diverse strategie di passivazione superficiale, minore concentrazione di anticorpi o maggiore densità superficiale dell'mRNA.
  2. Per misurare la velocità di legame degli anticorpi, eseguire il protocollo con un passaggio aggiuntivo tra il passaggio 4 e il passaggio 5.
    1. Dopo il passaggio 4, incubare il canale con una miscela di traslazione priva di anticorpi per pre-generare complessi mRNA/ ribosoma / peptidici.
    2. Quindi procedere al passaggio 5 e scorrere la miscela di traslazione integrata con anticorpi nel canale.
    3. Quantificare il tasso medio di legame anticorpale con peptide nascente pregenerato con adattamento esponenziale all'istogramma della prima volta di arrivo.
      NOTA: Il legame anticorpale con peptide pregenerato deve essere rapido, nell'ordine dei secondi, e deve essere più veloce della cinetica di traduzione. Una maggiore concentrazione di anticorpi può essere utilizzata per aumentare il tasso di legame anticorpale.
  3. Fotostabilità dell'anticorpo con etichetta fluoroforo.
    1. Preparare una diapositiva in base al protocollo nel passaggio 2, ma ignorare il passaggio PEGylation. Assemblate la camera di flusso dopo la fase di salinizzazione. Il rivestimento in silane consente un efficace legame anticorpale non specifico alla superficie di rilevamento.
    2. Aggiungere gli anticorpi con etichetta fluorescente nel canale per ottenere una densità a singola molecola di anticorpi non specifici che si legano alla superficie di rilevamento. Inizia aggiungendo anticorpi con etichetta fluorescente che è altamente diluito nel tampone di lavaggio T50 e aumenta gradualmente la concentrazione di anticorpi fino a raggiungere la densità a singola molecola desiderata.
    3. Immagini la superficie di rilevamento fino a quando la maggior parte della fluorescenza dell'anticorpo non è più rilevabile.
    4. Tracciare il numero totale di anticorpi visibili nel tempo per valutare il tasso di perdita di fluorescenza degli anticorpi a causa del fotobleaching del fluoroforo.
      NOTA: L'etichettatura degli anticorpi produce tipicamente fluorofori multipli per anticorpo. I singoli anticorpi rimangono rilevabili fino a quando tutti i fluorofori coniugati non sono fotolici.

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Representative Results

Seguendo il protocollo descritto si consente l'imaging di singole interazioni anticorpali con i nascenti polipeptidi con tag N-terminale con risoluzione a singola molecola durante la traduzione attiva senza cellule dell'mRNA reporter con reticolo finale 3' (Figura 1). Un esperimento dimostrativo minimo è riportato con l'uso di tre mRNA sintetici: LUC (codifica luciferasi non taggata), LUCFLAG (codifica 3xFLAG-tagged luciferase) e hp-LUCFLAG (LUCFLAG con un anello di stelo stabile nella regione leader 5')(Figura 2C). L'uso dell'mRNA di codifica luciferasi consente confronti tra osservazioni a singola molecola e misurazioni della luminescenza sfusa. L'integrità dell'mRNA biotinilato da 3' è stata valutata denaturando l'elettroforesi del gel di poliacrilammide (PAGE) e la colorazione dell'RNA. L'mRNA di buona qualità mostra una singola banda pulita e non deve mostrare ulteriori segnali di migrazione più rapidi (Figura 3A). Saccharomyces cerevisiae estratto di traduzione è stato utilizzato qui e preparato seguendo un protocollo che è statoprecedentemente descritto 30 e modificato15. Misurazioni alla rinfusa dell'attività della luciferasi nelle reazioni di traduzione prive di cellule con l'estratto di lievito e l'mRNA LUCFLAG biotinilato che manca o contiene un tappo m7G mostra la stimolazione del tappo della traduzionedi mRNA LUCFLAG (Figura 3B).

Per l'imaging a singola molecola, l'estratto di traduzione è stato integrato con 67 nM di anticorpi anti-FLAG con etichetta Cy3 (Cy3-αFLAG). Questo anticorpo aveva un alto rapporto di etichettatura di 2-7 coloranti per anticorpo. Il laser a 532 nm è stato impostato su 10 μW all'obiettivo. L'angolo di incidente laser è stato impostato su 71,5°, che era maggiore dell'angolo critico di 63,8° per il nostro set up. Un basso livello di fluorescenza è stato immaginato da superfici di rilevamento che contengono mRNA ma mancano di mix di traslazione (Figura 4A). Per dimensioni del canale di circa 2 mm (larghezza) x 50 μm (profondità) x 24 mm (lunghezza), una portata di 150 μl/min ha prodotto un tempo di scambio del reagente di 3 - 4 s. Entro 5 s dalla consegna della miscela di traslazione, il livello di fluorescenza di fondo aumenta a causa della diffusione degli anticorpi fluorescenti. Circa 2 minuti dopo la consegna del mix di traduzione ai canali contenenti mRNA LUCFLAG, i punti Cy3 hanno iniziato ad apparire in un campo visivo e hanno continuato ad accumularsi per ~ 30 minuti(Figura 4B). L'anticorpo non specifico che si lega alla superficie, misurato utilizzando l'mRNA LUC privo di 3xFLAG(Figura 2C),è rimasto ad un livellomolto basso 15. I segnali da mRNA/ribosoma/peptide-bound Cy3- αFLAG erano chiaramente visibili con l'angolo di incidente laser ottimizzato, ma potevano essere mascherati da un alto sfondo a fluorescenza con angoli di incidente laser inferiori (Figura 4C).

Per analizzare gli eventi di associazione Cy3-αFLAG, le intensità di fluorescenza dei punti Cy3-αFLAG selezionati (Figura 5A) sono state calcolate fotogramma per fotogramma per l'intero filmato e quindi collegate per formare una traiettoria di intensità (Figura 5B). Le traiettorie non elaborati possono apparire rumorose e possono richiedere un perfezionamento con un filtro forward-backward non lineare per ridurre il rumore di fondo41. Un ulteriore perfezionamento potrebbe essere ottenuto utilizzando algoritmi di rilevamento dei gradini per digitalizzare letraiettorie 42. Per tutte le traiettorie, durante lo scambio di reagenti appare un aumento universale del livello di fluorescenza di fondo a causa della diffusione degli anticorpi fluorescenti nel mix di traslazione (Figura 5B). Il legame anticorpale con un polipeptide nascente ha causato un aumento istantaneo della fluorescenza, mentre la dissociazione anticorpo/polipeptide dall'mRNA provoca una diminuzione istantanea della fluorescenza (Figura 5B).

Il tempo di rigonfiamento degli anticorpi può essere utilizzato per misurare il tempo totale di decodifica di un fotogramma di lettura aperto. L'istogramma del tempo di dimora per l'mRNA LUCFLAG si adatta a una distribuzione log-normale (Figura 6A) e ha prodotto un tasso di sintesi peptidica di 2,5 ± 0,1 amminoacidi al secondo15. La prima volta di arrivo l'istogramma si adatta a una funzione log-normale spostata (3 parametri) (Figura 6B). L'ampia diffusione dell'istogramma della prima volta di arrivo mostra l'alto grado di eterogeneità nell'attività di traduzione di singoli mRNA. L'istogramma indicava che il primo evento di sintesi peptidica su singolemolecole di mRNA LUCFLAG poteva iniziare già 2 minuti, e fino a 20 minuti, dopo la consegna del mix di traduzione (Figura 6B). Rispetto alla traduzione con mRNA LUCFLAG, il primo istogramma dell'ora di arrivo con traduzione dell'mRNA HP-LUCFLAG ha mostrato un legame anticorpale più lento (Figura 7A). L'uso di misurazioni di luminescenza di massa da reazioni di traslazione senza cellule con questi stessi mRNA, tuttavia, non risolve le differenze nella cinetica di traduzione (Figura 7B,C). Questi risultati dimostrano la maggiore risoluzione del nostro metodo rispetto alle misurazioni dell'attività della luciferasi cinetica sfusa per rilevare piccoli cambiamenti nella cinetica di iniziazione.

Figure 1
Figura 1: Diagramma di flusso del protocollo. Vengono mostrate rappresentazioni schematiche di preparazione di coverlip e diapositive, assemblaggio a camera a singola molecola, imaging TIRF e acquisizione dati e fasi di analisi dei dati. La fase di imaging TIRF include rappresentazioni schematiche dell'immobilizzazione dell'mRNA e della traslazione in un canale di flusso. Sono indicati i componenti di superficie di rilevamento, gli anticorpi etichettati fluorescentmente e i componenti dell'estratto cellulare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: progetti di mRNA per il saggio a singola molecola. (A) Per adattare un saggio di traduzione in blocco al saggio a singola molecola, il modello di DNA del reporter di massa ORF è stato modificato con un inserimento della sequenza di tag epitopi N-terminale per generare un ORF taggato che codifica reporter. Sono indicate le regioni di codifica dei tag ORF e N-terminal. (B) gli mRNA erano 5′-m7G limitati per consentire la traduzione dipendente dal tappo e 3′-biotinilati per la loro immobilizzazione alla superficie di rilevamento a singola molecola. 5′-m7G cap e 3′-biotina sono indicati su ORFA non taggati e taggati. (C) Gli mRNA di codifica luciferasi sono stati utilizzati per dimostrare il saggio a singola molecola. Gli mRNA LUC e LUCFLAG codificano luciferasi che manca e contiene rispettivamente un tag N-terminal 3xFLAG. l'mRNA HP-LUCFLAG contiene un ulteriore inserimento che introduce una struttura secondaria a tornanti nelleader di LUCFLAG mRNA 5′. Sono indicati la termostabilità dei tornanti, la coda 3′-poly(A) e la biotina 3′-biotina. Tutti e tre gli mRNA includevano una coda da 30 nt 3′-poly(A) per una traduzione più efficiente dipendente dal cappuccio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Integrità dell'mRNA reporter a singola molecola e traduzione in blocco. (A) Imaging rappresentante della pagina di denaturazione dell'mRNA reporter a singola molecola. 5′-m7G limitato e 3′-biotinilato LUCFLAG mRNA è stato caricato su un gel di poliacrilammide al 10% denaturante vicino a una scala di RNA. (B) L'mRNA reporter a singola molecola ha conservato la dipendenza da 5' cap nelle reazioni di traduzione senza cellule sfuse. 3′-biotinilato LUCFLAG mRNA che mancava (–cap) o conteneva (+ tappo) un tappo da 5′-m7G è stato tradotto in estratto di traduzione S. cerevisiae per 30 min a 25 °C. L'attività della luciferasi è stata misurata da due reazioni indipendenti e normalizzata all'attività con mRNA –cap, che è arbitrariamente impostato su 1,0. Le deviazioni standard dai valori medi sono indicate dalle barre di errore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Imaging di superfici di rilevamento contenenti mRNA immobilizzato. (A) Fluorescenza di fondo in assenza di mix di traduzione. (B) Punti fluorescenti Cy3 in un campo visivo 30 min dopo la consegna del mix di traslazione e con un angolo di incidente laser ottimizzato. (C) Campo visivo immagine 30 minuti dopo la consegna del mix di traslazione e con un basso angolo di incidente laser. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Analisi delle immagini. (A) Punti Cy3 in un campo visivo senza (pannello sinistro) o con selezione spot (pannello destro). (B) Esempio di traiettoria a singola molecola per un punto Cy3 selezionato. La freccia nera indica l'aumento della fluorescenza di fondo dovuto alla diffusione degli anticorpi durante la consegna della miscela di traduzione. La freccia verde indica l'improvviso aumento dell'intensità di fluorescenza dovuto al legame Cy3-αFLAG. La freccia rossa indica l'improvvisa diminuzione dell'intensità di fluorescenza dovuta alla dissociazione da peptide Cy3-αFLAG/nascente dall'mRNA. Il tempo di dimora di un evento di associazione Cy3-αFLAG è indicato con una freccia a due punte. Vengono indicati i dati non elaborati, filtrati e digitalizzati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Analisi cinetica dell'associazione Cy3-αFLAG con traduzione mRNA LUCFLAG.  (A) L'istogramma del tempo di rigonfiamento Cy3-αFLAG si adatta a una distribuzione log-normale. (B) L'istogramma di primo arrivo dell'associazione Cy3-αFLAG si adatta a una funzione log-normale spostata (3 parametri). Adattato da Wang etal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Il saggio a singola molecola ha una risoluzione più alta per la cinetica di iniziazione rispetto al saggio di luminescenza sfusa. (A) Gli istogrammi della prima ora di arrivo per l'associazione Cy3-αFLAG con traduzione di LUCFLAG e hp-LUCFLAG mRNA hanno rivelato un'iniziazione più lenta causata da una piccola struttura a tornanti nel leader dell'mRNA 5′. N = traiettorie 10650 (LUCFLAG), combinate da 3 set di dati e N = 4079 traiettorie (hp-LUCFLAG), combinate da 2 set di dati. (B,C) Le misurazioni cinetiche di analisi delle luciferasi di massa non risolvevano le differenze nella cinetica di iniziazione per la traduzionedi mRNA LUCFLAG (N = 9 set didati) e hp-LUCFLAG (N = 6 set di dati). (B) Cinetica a luminescenza sfusa. (C) Grafici a dispersione dei tempi di traslazione del primo turno determinati dal raccordo gaussiano alla seconda derivata delle curve cinetiche di luminescenza in (B), come descritto da Vassilenko et al. 46. I cerchi rossi e le barre di (C) rappresentano rispettivamente il valore medio e la deviazione standard del tempo calcolato di traslazione del primo turno. Adattato da Wang etal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Rispetto ai tipici esperimenti tirf a singola molecola in vitro, l'imaging a singola molecola con il saggio qui descritto è inoltre complesso a causa dell'uso di estratto cellulare e di un'alta concentrazione di anticorpi etichettati fluorescentmente. Rispetto alla pratica più comune di un ciclo di PEGylation superficiale, un secondo ciclo di PEGylation (fase 2) riduce notevolmente il legame anticorpale non specifico alla superficiedi rilevamento 15. L'alta concentrazione di anticorpi fluorescenti diffusivi provoca uno sfondo fluorescente estremamente elevato che maschera il rilevamento a singola molecola del legame anticorpale. Per ridurre questo sfondo fluorescente, l'angolo incidente laser viene aumentato ben al di sopra dell'angolo critico (passaggio 3.4.). Il rilevamento degli anticorpi è anche diminuito dall'eccessiva instabilità del fluoroforo, che può limitare la capacità di quantificare il tempo di dimora. Quando si verifica questo problema, sostituire il fluoroforo con un fluoroforo più fotostabile, come quelli coniugati a un quencher a stato di tripletta47, o abbassare l'intensità dell'illuminazione laser. Sebbene i sistemi di scavenging dell'ossigeno siano comunemente utilizzati in esperimenti a singola molecola in vitro per sopprimere il fotolibleaching al fluoroforo48,49, il saggio qui descritto può fornire una finestra di rilevamento molto generosa senza implementare alcun sistema di scavengingdell'ossigeno 15. Inoltre, i sistemi di scavenging dell'ossigeno possono ridurre notevolmente l'efficienza di traslazione senza cellule eucariotiche. Pertanto, i sistemi di scavenging dell'ossigeno devono essere attentamente valutati prima del loro uso con questo saggio.

È importante sottolineare che piccole variazioni nella preparazione dei reagenti vengono rilevate dal saggio a causa della sua risoluzione a singola molecola. Ad esempio, replicare i preparativi per l'estrazione della traduzione può visualizzare diverse attività che possono essere rilevabili o meno con metodi di massa. Inoltre, i cicli di congelamento-scongelamento dell'estratto di traduzione e di altri reagenti possono compromettere rapidamente l'attività di traduzione. Si consiglia di eseguire esperimenti pilota su piccola scala con materiale facilmente accessibile per testare le condizioni prima di pianificare uno studio sistematico. Per uno studio sistematico, si raccomandano preparazioni su larga scala di reagenti di traduzione, aliquote per uso singolo per reagenti sensibili al congelamento/disgelo e coerenza nell'esecuzione delle fasi del protocollo. L'estratto di traduzione che viene congelato a lampo in azoto liquido e conservato a -80 °C mostra una perdita di attività minima per almeno due anni. L'applicazione di queste misure può sopprimere efficacemente le variazioni sperimentali e aumentare la robustezza del saggio a singola molecola.

Poiché questo metodo combina i sistemi di traduzione senza cellule sfuse esistenti e le tecniche di imaging a singola molecola in vitro, la risoluzione dei problemi generici in queste due aree non viene discussa in questa sede. Esempi di tali problemi generici includono preparazioni di bassa qualità di mRNA reporter o coverlip PEGylated e bassa attività di traduzione dell'estratto cellulare. Qui, ci concentreremo su questioni specifiche per questo metodo. Oltre ai diversi problemi tecnici che sono stati discussi nel protocollo, un altro potenziale problema può essere il legame anticorpale basso o nessun legame anticorpale nel canale di flusso per una condizione di traduzione che dovrebbe avere una buona attività. Esistono diverse possibilità di risoluzione dei problemi. L'efficienza dell'immobilizzazione dell'mRNA biotinilato sulla superficie di rilevamento può essere valutata ricottura di oligomeri di DNA complementari e coniugati al dna immobilizzato e imaging dei duplex DNA:RNA fluorescenti. La qualità del mix di traduzione e degli mRNA dei reporter biotinilati può essere controllata eseguendo il test di traduzione in blocco. Inoltre, dopo aver effettuato una reazione di traslazione in un canale di flusso immobilizzato dall'mRNA, la soluzione di reazione di traslazione può essere pipettata fuori dal canale e utilizzata in un saggio di attività del reporter per confermare il verificarsi della traduzione in-channel. Se necessario, una densità superficiale dell'mRNA eccessivamente elevata può essere utilizzata per la reazione di traslazione in canale per consentire un più facile rilevamento da parte del saggio di attività del reporter.

La principale limitazione di questo saggio è la sua risoluzione per la cinetica di iniziazione. In questo saggio, l'uscita sperimentale diretta, prima volta di arrivo, contiene sia il tempo di iniziazione del primo round che il tempo di allungamento peptidico per tradurre l'epitopo e altri 35 codoni. Sebbene il contributo del tempo di allungamento peptidico possa essere corretto (fase 6.9.), questo saggio di conseguenza è più sensibile per misurare la cinetica di iniziazione che si verifica nell'ordine dei minuti, che sembra essere una proprietà generica di iniziazione dipendente dal tappo15. Sperimentalmente, è facile adattare questo saggio per studiare altri meccanismi di iniziazione. Tuttavia, se un meccanismo di iniziazione si verifica significativamente velocemente nell'ordine dei secondi, è improbabile che questo saggio risolva la cinetica di iniziazione.

L'approccio a singola molecola qui descritto combina l'imaging a singola molecola e la traduzione basata su estratti per consentire misurazioni di singoli eventi di traduzione dipendenti dal tappo in tempo reale e durante la traduzione attiva senza cellule. Il saggio consente una facile transizione da un saggio di traduzione alla rinfusa a un saggio a singola molecola, preservando al contempo la cinetica di traduzione sfusa. Pertanto, le osservazioni cinetiche a singola molecola possono essere interpretate in riferimento diretto ai corrispondenti risultati alla rinfusa. I metodi precedenti, compresi gli approcci in vivo recentemente sviluppati 11,12,13,14, mancano della risoluzione per le misurazioni cinetiche dei singoli eventi di iniziazione della traduzione e richiedono ipotesi di meccanismi di traduzione per estrarre le medie del tempo di iniziazione da osservabili sperimentali. Il metodo a singola molecola qui presentato fornisce il primo approccio privo di ipotesi per quantificare il tempo medio di iniziazione della traduzione attiva dipendente dal cappuccio. Inoltre, sebbene siano state utilizzate misurazioni cinetiche sfuse con un saggio di luminescenza per fornire le caratterizzazioni di massa più quantitative e sistematiche della cinetica di traduzione dipendente dal tappo fino adoggi 46,50, il saggio a singola molecola qui descritto misura i cambiamenti cinetici di iniziazione medi con una sensibilità maggiore rispetto al saggio alla rinfusa(figura 7). Inoltre, i dati a singola molecola preservano la stocasticità e l'eterogeneità della traduzione di mRNA, proprietà medie nelle misurazioni alla rinfusa. La risoluzione a singola molecola della cinetica traslazione può essere utilizzata per analisi cinetiche sistematiche per rivelare intuizioni dei meccanismi di traduzione irraggiungibili con altri metodi.

Questo saggio è compatibile con gli approcci biochimici e genetici esistenti che sono comunemente usati per gli studi di traduzione. Ad esempio, la funzione traslazionale di un fattore specifico può essere studiata generando estratto impoverito da fattori e integrarlo con un fattore di tipo selvaggio o mutante. Inoltre, integrando il fattore etichettato fluorescentmente, gli studi possono potenzialmente indagare la relazione cinetica tra il legame fattoriale e la progressione della traduzione. Con l'uso di due distinte coppie epitopo/anticorpo, questo protocollo potrebbe potenzialmente essere espanso da un saggio monocolore a un saggio a due colori che consente il rilevamento simultaneo di due sequenze di codifica distinte. Questo adattamento consentirebbe di tracciare la traduzione di diversi fotogrammi di lettura e potrebbe essere applicato agli studi di frameshifting e di selezione del sito iniziale. In alternativa, un sistema a due colori potrebbe essere utilizzato per rilevare interazioni anticorpali con polipeptidi taggati codificati da frame di lettura aperti a monte e a valle per monitorare sia gli eventi di traduzione a monte che a valle sui singoli mRNA. Queste espansioni possono consentire una vasta gamma di studi meccanicistici che indagano la traduzione dipendente dal tappo e la sua regolazione.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dai National Institutes of Health [R01GM121847]; il Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) Support Grant/Core Grant (P30 CA008748); e MSKCC Functional Genomics Initiative.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100X oil objective, N.A. 1.49 Olympus UAPON 100XOTIRF
Acryamide/bis (40%, 19:1) Bio-Rad 161-0144
Alkaline liquid detergent Decon 5332
Aminosilane (N-(2-Aminoethyl)-3-Aminopropyltrimethoxysilane) UCT Specialties, LLC A0700
Andor ixon Ultra DU 897V EMCCD Andor DU-897U-CSO-#BV
Andor Solis software Andor For controlling the Andor EMCCD
Band-pass filter Chroma 532/640/25
Band-pass filter Chroma NF03-405/488/532/635E-25
Biotin-PEG-SVA Laysan Bio Inc Biotin-PEG-SVA
Coenzyme A free acid Prolume 309-250
Coolterm software For controlling the syringe pump
Desktop computer Dell For controlling the microscope, camera, stage, and pump.
Dichroic mirror Semrock R405/488/532/635
Direct-zol RNA microprep 50RNX Fisher Scientific NC1139450
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega E1910
Epoxy Devcon 14250
Firefly luciferin D-Luciferin free acid Prolume 306-250
Glacial acetic acid Fisher Scientific BP1185500
Hydrogen perioxide Sigma-Aldrich 216763-500ML
Immersion oil Olympus Z-81226A Low auto-fluorescence
Luciferase Assay System Promega E1500
MEGASCRIPT T7 Transcription Kit Thermo fisher AM1334
Methanol Fisher Scientific MMX04751
Microscope Olympus IX83
Microscope slide Thermo Scientific 3048
Monoclonal anti-FLAG M2-Cy3 Sigma-Aldrich A9594
mPEG-SVA Laysan Bio Inc mPEG-SVA-5000
MS(PEG)4 Thermo Scientific 22341
NaCl (5M) Thermo Scientific AM9760G
No 1.5 microscope Cover glass Fisherband 12-544-C
Olympus Laser, 532nm 100mM Olympus digital Laser system CMR-LAS 532nm 100mW
Olympus TirfCtrl software Olympus For controlling the laser intensity and incident angle
Optical table TMC vibration control 63-563 With vibration isolation
Phenol chloroform isoamyl alcohol mix Sigma-Aldrich 77617-100ml
Pierce RNA 3' End Biotinylation Kit Thermo Scientific 20160
Potassium hydroxide pellets Sigma-Aldrich P1767-500G
Prior motorized XY translation stage Prior PS3J100
Prior PriorTest software Prior For controlling the Prior motorized stage
Recombinant RNasin RNase Inhibitor Promega N2515
Stage top Incubator In vivo scientific (world precision Instruments) 98710-1 With a custom built acrylic cage
Staining jar Fisher Scientific 08-817
Streptavidin Thermo Scientific 43-4301
Sulfuric acid Fisher Scientific A300212
SYBR green II Fisher Scientific S7564
Syringe Hamilton 1725RN
Syringe pump Harvard apparatus 55-3333
Tris (1M), pH = 7.0 Thermo Scientific AM9850G
Ultrasonic Bath Branson CPX1800H
Urea Sigma-Aldrich U5378-500G
Vaccinia Capping system New England Biolabs M2080S
Zymo-Spin IC Columns Zymo Research C1004

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Biochimica Numero 163 traduzione eucariotica senza cellule cinetica di traduzione a singola molecola imaging a fluorescenza in vitro iniziazione dipendente dal cappuccio controllo traslizionale saggio in vitro
Un <em>saggio di imaging</em> a singola molecola in vitro per l'analisi della cinetica di traduzione dipendente dal cappuccio
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Gaba, A., Wang, H., Qu, X. An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics. J. Vis. Exp. (163), e61648, doi:10.3791/61648 (2020).

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