Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

En In Vitro single-molecule imaging assay for analyse av cap-avhengig oversettelse kinetikk

Published: September 15, 2020 doi: 10.3791/61648
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Molecular Biology Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center
* These authors contributed equally

Summary

Sporing av individuelle oversettelseshendelser gir mulighet for kinetiske studier med høy oppløsning av capavhengige oversettelsesmekanismer. Her demonstrerer vi en in vitro enkeltmolekylanalyse basert på bildeinteraksjoner mellom fluorescerende merkede antistoffer og epitopmerkede nascent peptider. Denne metoden muliggjør enkeltmolekyl karakterisering av initiering og peptid forlengelse kinetikk under aktiv in vitro cap-avhengig oversettelse.

Abstract

Cap-avhengig proteinsyntese er den dominerende oversettelsesveien i eukaryote celler. Mens ulike biokjemiske og genetiske tilnærminger har tillatt omfattende studier av cap-avhengig oversettelse og dens regulering, mangler fortsatt høyoppløselig kinetisk karakterisering av denne oversettelsesveien. Nylig utviklet vi en in vitro-analyse for å måle cap-avhengige oversettelseskinetikk med enkeltmolekyloppløsning. Analysen er basert på fluorescerende merket antistoffbinding til nascent epitopmerket polypeptid. Ved å forestille seg binding og dissosiasjon av antistoffer mot og fra nascent peptid-ribosom-mRNA-komplekser, kan oversettelsesprogresjonen på individuelle mRNAer spores. Her presenterer vi en protokoll for å etablere denne analysen, inkludert mRNA og PEGylated lysbildepreparater, sanntidsavbildning av oversettelse og analyse av enkeltmolekylbaner. Denne analysen gjør det mulig å spore individuelle cap-avhengige oversettelseshendelser og løser viktige oversettelseskinetikker, for eksempel initierings- og forlengelseshastigheter. Analysen kan brukes mye på distinkte oversettelsessystemer og bør i stor grad være til nytte for in vitro-studier av cap-avhengige oversettelseskinetikk og translasjonelle kontrollmekanismer.

Introduction

Oversettelse i eukaryote systemer skjer hovedsakelig gjennom 7-metylguanosin (m7G) cap-avhengige veier1. Studier indikerer at initieringstrinnet for eukaryotisk oversettelse er prisbegrensende og et felles mål for regel2,3,4. Mekanismer for cap-avhengig oversettelse har blitt grundig studert ved hjelp av genetiske5, biokjemiske6,7,8, strukturelle9og genomiske10 bulk tilnærminger. Selv om disse metodene har identifisert forskjellige mekanismer som regulerer cap-avhengig initiering, begrenser oppløsningen dem til ensemblegjennomsnitt av signaler fra heterogene og asynkrone initieringshendelser. Mer nylig har individuelle in vivo-oversettelseshendelser blitt visualisert ved hjelp av metoder som måler fluorescerende antistoffbinding til epitoper på nascent polypeptider11,12,13,14. Imidlertid er disse nye tilnærmingene også begrenset i deres evne til å løse individuelle initieringshendelser fordi flere fluorescerende antistoffer må binde et nascent peptid for å tillate at enkeltoversettelseshendelser løses fra en høy intracellulær fluorescensbakgrunn. I mange biologiske interaksjoner har løst individuelle kinetiske hendelser gitt kritisk innsikt i å forstå komplekse multistep og repeterende biologiske prosesser som ikke er mulig å synkronisere på molekylært nivå. Nye metoder som kan spore dynamikken i individuelle oversettelseshendelser er nødvendig for en bedre forståelse av cap-avhengig initiering og regulering.

Vi utviklet nylig en in vitro-analyse som måler cap-avhengig initieringskinetikk med enkeltmolekyloppløsning15. Tatt i betraktning det store antallet kjente og ukjente proteinfaktorer som er involvert i denne initieringsveien3,16, ble enkeltmolekylanalysen utviklet for å være kompatibel med eksisterende in vitro cellefrie oversettelsessystemer for å dra nytte av bevaring av cellulære faktorer og robust oversettelsesaktivitet17,18,19,20,21,22,23,24,25. Videre tillater bruk av cellefrie oversettelsessystemer mer kompatible sammenligninger mellom observasjoner av enkeltmolekyler og tidligere bulkresultater. Denne tilnærmingen gir en rett frem integrasjon av ny kinetisk innsikt i det eksisterende mekanistiske rammeverket for capavhengig initiering. For å etablere enkeltmolekylanalysen, endres det tradisjonelle cellefrie oversettelsessystemet på tre måter: en epitopkodingssekvens settes inn i begynnelsen av den åpne leserammen (ORF) til en reporter mRNA; den 3′ enden av reporter mRNA er biotinylert for å lette mRNA end-tethering til single-molekyl deteksjon overflate; fluorescerende merkede antistoffer er supplert med oversettelsesekstraktet. Disse modifikasjonene krever bare grunnleggende molekylærbiologiske teknikker og vanlige reagenser. Videre bevarer disse modifikasjonene og bildeforholdene for enkeltmolekyler oversettelseskinetikken til bulkcellefrie oversettelsesreaksjoner15.

I denne analysen (Figur 1), 5′-end capped og 3′-end biotinylated reporter mRNA er immobilisert til en streptavidin-belagt deteksjon overflate i et strømningskammer. Strømningskammeret fylles deretter med en cellefri oversettelsesblanding supplert med fluorescerende merkede antistoffer. Etter at mRNA-oversettelsen har skjedd i omtrent 30-40 codons nedstrøms epitopsekvensen26,27, kommer epitopen ut av ribosomets utgangstunnel og blir tilgjengelig for å samhandle med fluorescerende merket antistoff. Denne interaksjonen er rask og dens deteksjon av enkeltmolekylet fluorescensavbildningsteknikker muliggjør sporing av oversettelseskinetikk med enkeltmolekyloppløsning under aktiv cellefri oversettelse. Denne analysen bør i stor grad være til nytte for in vitro-studier av cap-avhengige oversettelseskinetikk og dens regulering, spesielt for systemer med en fungerende bulk in vitro-analyse.

En forutsetning for å etablere denne enkeltmolekylanalysen er en fungerende bulkcellefri oversettelsesanalyse, som kan oppnås ved hjelp av oversettelsesekstrakt som enten er kommersielt tilgjengelig eller utarbeidet etter tidligere beskrevne metoder28. Eukaryotisk oversettelsesekstrakt kan fås fra forskjellige celler, inkludert sopp, pattedyr og plante28. For avbildning krever denne analysen et TIRF-mikroskop utstyrt med justerbar laserintensitet og hendelsesvinkel, et motorisert prøvestadium, et motorisert fluidikksystem og prøvetemperaturreguleringsenhet. Slike krav er generiske for moderne in vitro-tirf-eksperimenter med ett molekyl og kan oppnås annerledes. Eksperimentet som presenteres her, bruker et objektivt TIRF-system som består av kommersielt tilgjengelig mikroskop, programvare og tilbehør som alle er oppført i Materialfortegnelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Generasjon av reporter mRNA

  1. Endre en DNA-transkripsjonsmal som koder en bulkanalyse "ukodet" reporter mRNA ved å sette inn en N-terminus epitop-tag-kodingssekvens for å generere en DNA-transkripsjonsmal for en "tagget" reporter mRNA (Figur 2A).
    MERK: 3xFLAG/anti-FLAG-interaksjon anbefales for denne analysen på grunn av dens overlegne følsomhet og den korte 3xFLAG-kodelengden. Analysen er imidlertid kompatibel med andre epitope/antistoffpar.
  2. Syntetisere ukodede og kodede RNAer ved hjelp av lineariserte DNA-maler og et in vitro transkripsjonssett (se Materialliste). Vanligvis er 10-20 pmol av in vitro transkribert RNA tilstrekkelig for etterfølgende RNA-behandling for å tillate en systematisk enkeltmolekylstudie.
  3. Cap RNA 5′ end (Figur 2B) med en m7G capping kit (se Tabell over materialer) etter produsentens anbefaling.
  4. Biotinyler RNA 3′ enden (Figur 2B) ved hjelp av et biotinyleringssett (se Materialliste) i henhold til protokollen som følger med settet. Rens RNAer ved fenol-kloroformutvinning etterfulgt av rensing med en spinnkolonne. Elute RNA i 10–20 μL RNase-fritt vann. Omtrent 40–50 % av den uappappede inngangen RNA gjenopprettes.
  5. Vurdere RNA integritet og konsentrasjon ved å denaturere akrylamidgelelektroforese og RNA-farging, som beskrevet tidligere29.
  6. Utfør bulkcellefri oversettelse30 med den 3′-end-biotinylerte tagged reporter mRNA for å bekrefte at den modifiserte mRNA bevarer oversettelsesegenskapene som er av interesse. Capavhengig oversettelse kan for eksempel bekreftes ved å måle og sammenligne reporteraktiviteter i massecellefrie oversettelsesreaksjoner med uappeterte og kappede reporter-mRNAer (se Representative Results).

2. Forberedelse av strømningskammer

  1. Velg en passende tykkelse på omslag, som angitt av det objektive arket for mikroskopet. Velg en glass- eller kvartssklie for henholdsvis objektiv- eller prismetype total intern refleksjonsfluorescens (TIRF) bildesystemer31.
  2. Utfør rengjøring, salinisering, PEGylering og kammermontering av deksler og skyv etter protokollen beskrevet av Chandradoss et al.32 med følgende modifikasjoner.
    1. Vask sklier som inneholder borede hull i 10% alkalisk flytende vaskemiddel (v / v) i 20 min med sonikering. Kombiner lysbildene og dekslene for alle gjenværende rengjøringstrinn.
    2. Hopp over acetonvasktrinnet. Utvid Piranha etsende inkubasjonstid fra 20 min til 1 t. Inkuber første runde PEGylation i 3 timer. Inkuber pegylering i andre runde med MS(PEG)4 i 3 timer.

3. Klargjøring av utstyr

  1. Minst 3 timer før du utfører et enkeltmolekyleksperiment, slå på mikroskopinkubatoren og reduser luftstrømmen til en lav hastighet for å unngå overdreven akustisk forstyrrelse av eksperimenter. Still inn inkubatortemperaturen til den optimale temperaturen for det cellefrie oversettelsessystemet.
    MERK: Oversettelsen er ekstremt følsom for temperatur. Den optimale reaksjonstemperaturen er spesifikk for hvert celleekstraktsystem. Karakterisering av reaksjonstemperatur er et viktig skritt i utviklingen av et bulkcellefritt oversettelsessystem. Denne enkeltmolekylanalysen bør utføres under samme optimale temperatur som den tilsvarende bulkoversettelsesbetingelsen.
  2. Minst 1 time før du utfører et enkeltmolekyleksperiment, slår du på laseren ved å trykke på laserstrømknappen bak laserboksen, vri på lasersikkerhetstasten og trykke på startknappen; slå på mikroskopet og trykk på kontrollpanelet på berøringsskjermen for å velge bildemodus, mål og filtersett.
  3. Slå på EMCCD-kameraet, kontrolleren for foregående stadium og sprøytepumpen ved å trykke på strømknappene. Slå på datamaskinen og åpne programvaren Andor Solis (programvare 1) for å kontrollere EMCCD-kameraet, TirfCtrl (programvare 2) for å kontrollere laseren, PriorTest (programvare 3) for å kontrollere det motoriserte stadiet, og Coolterm for å kontrollere sprøytepumpen. La kameraet avkjøles og stabilisere seg til den angitte arbeidstemperaturen før datainnsamlingen begynner.
  4. I programvare 2 bekrefter du at de riktige parametrene er angitt for laserbølgelengde, objektiv type og brytningsindeks for glass og prøve. Klikk Koble til . Hvis du vil angi laserintensiteten, klikker du kontrollknappen ved siden av laserbølgelengden, og deretter drar du glidelinjen for intensitet i popup-vinduet for laserkontrollen. Sett laseren i ønsket vinkel ved å dra glidebryteren for fiberposisjon eller legge inn den tilsvarende penetrasjonsdybden. Kontroller at det er merket av for Lukker for å opprettholde laseren i Av-modus når du ikke ser på den.
    MERK: Åpne og lukk laserlukkeren ved å merke av i lukkerboksen. Ved første etablering av analysen bør ulike laserintensiteter og hendelsesvinkler testes for optimal enkeltmolekyldeteksjon. Den optimale laserintensiteten balanserer lysstoffrør og rask fotobleaching av fluoroforene. Hendelsesvinkelen bør økes utover den kritiske vinkelen for å redusere den høye fluorescerende bakgrunnen fra de diffuserende merkede antistoffene til mRNA-bundne antistoffer er klart løst. Som referanse ble en 532 nm laser satt til 10 μW på målet med laserhendelsesvinkelen satt til 71,5° i en studie15 ved hjelp av Cy3-merket anti-FLAG med et merkeforhold på 2-7 fargestoffer per antistoff.
  5. I programvare 1 velger du Kinetic under anskaffelsesmodus, skriver inn parametrene for eksponeringstid, kinetisk serielengde og EM-forsterkningsverdi. Velg mappen, og tilordne filnavn for lagring av dataavbildningsfilen.
  6. Sett sprøytepumpen til en beskjeden til rask strømningshastighet for det påfølgende vasketrinnet.
    Pipette en aliquot på 70% etanol i et mikrofugerør, sett sprøytepumperøren inn i etanoloppløsningen, og bruk Coolterm til å veksle sprøytepumpen mellom uttrekks- og dispenseringsmodus tre ganger for å vaske slangen. Gjenta med RNase-fritt vann.
    MERK: Slangelengden må være lang nok til at oversettelsesblandingen kan dispenseres i trinn 5 for bare å kontakte slangen, ikke sprøyten. Skyllevolumet her bør være større enn volumet av dispensert oversettelsesblanding for å sikre at oversettelsesblandingen i trinn 5 forblir i kontakt med desinfiserte slanger.
  7. Etter at den endelige vannskyllingen er dispensert, fjern gjenværende vann fra innsiden av slangen ved å dabbe slangeenden på en ren vevsserviett. Hold slangeenden tørr ved å sette den inn i et rent mikrofunksjonsrør.

4. Immobilisering av 3′-end biotinylert mRNA

  1. Vedlikehold celleekstraktet og oversettelsesblandingen frosset på tørris til like før bruk. Tine de resterende frosne reagensene og vedlikehold dem på is.
  2. Plasser strømningskammeret i mikroskopets prøveholder med dekslene på siden vendt ned og fest det med tape. Bruk tape til å dekke innløp og uttak av strømningskanaler som ikke er i bruk.
  3. Pipette et volum på 1,5x (i forhold til kanalvolumet; gjelder også andre trinn i trinn 4 og trinn 5) på 0,2 mg/ml streptavidin i strømningskanalen og inkuberer i 10 minutter ved romtemperatur.
  4. For å fjerne ubundet streptavidin, vask kanalen tre ganger ved pipettering i et 3x volum T50 vaskebuffer (20 mM Tris HCl, pH 7,0, 50 mM NaCl, 0,2 U/μL RNase hemmingsreagens) per vask.
    MERK: Det er viktig å forhindre at flytende avfall strømmer tilbake til kanalen. Hvis utløpet av strømningskanalen ikke er koblet til et avfallsoppsamlingsrør, plasserer du et brettet vevspapir i nærheten av utløpet for å absorbere væsken som strømmer ut av kanalen.
  5. Overfør oversettelsesekstraktet og bland fra tørris til is og la dem tine.
  6. Sett en dråpe nedsenkningsolje på målet. Plasser mikroskopprøveholderen med strømningskammeret inn i mikroskopstadiet. Ta målet nær dekslene til nedsenkningsolje på objektive kontakter dekslene. Flytt prøvetrinnet slik at posisjonen til strømningskanalen er rett over objektivet.
  7. I programvare 2 åpner du laserlukkeren og justerer laserintensitetsnivået.
  8. Velg Fokus-fanen på berøringsskjermen for mikroskopkontrollen, og klikk fokussøk og startknappen. Et pip høres når et fokusplan oppnås.
  9. Bilde av strømningskanaloverflaten i live-modus i programvare 1. Optimaliser fokuset for et skarpere bilde ved å justere den objektive posisjonen med den fine trinnkontrollen på berøringsskjermen.
  10. I programvare 3 flytter du scenen for å evaluere nivået av fluorescensbakgrunn på ulike områder av strømningskanaldeteksjonsoverflaten. Hvis fluorescensen er lav, fortsett med eksperimentet. Hvis fluorescensbakgrunnen er for høy, bør du vurdere å kaste bort strømningskanalen.
  11. Lukk laserlukkeren i programvare 2.
  12. Rør ut T50-vaskebufferen fra strømningskanalen og rør den umiddelbart i et 2x volum biotinylert mRNA-løsning til strømningskanalen. Inkuber i 15 min.
    MERK: For hver batch av mRNA-preparatet bør mRNA-konsentrasjoner og inkubasjonstider testes for å oppnå mRNA-overflatetettheten som er nødvendig for deteksjon av enkeltmolekyler. Passende mRNA-overflatetetthet formidler antistoffbinding som viser fluorescerende flekker med ikke mer enn ~ 5% overlappende (se Representative Resultater). Som utgangspunkt anbefales biotinylert mRNA i en konsentrasjon på 2-20 nM.
  13. Vask kanalen tre ganger ved å pipettere et 3x volum oversettelseskompatibel buffer per vask.

5. Oversettelsesblanding montering og levering til en strømningskanal for enkeltmolekyldeteksjon

  1. På isen monterer du 3x volumer av oversettelsesblandingen30 i et mikrosenterrør etter bulkoversettelsesprotokollen fra trinn 1.7, unntatt utelat mRNA og supplement med en optimalisert konsentrasjon av fluorescerende merkede antistoffer. Snurr kort mikrosentrifugerøret for å samle oversettelsesblandingen nederst på røret.
    MERK: Når du etablerer analysen, testes forskjellige antistoffkonsentrasjoner. Den optimale konsentrasjonen viser lave mengder ikke-spesifikk antistoffbinding til påvisningsoverflaten og rask antistoffbinding til nascentpeptidet (se henholdsvis trinn 7.1. og 7.2., for analysekalibreringsdetaljer).
  2. Overfør oversettelsesblandingen til innsiden av en 0,7 ml mikrofunksjonsrørhette. Sett sprøytepumpen i uttrekksmodus. Sett pumperørenden inn i oversettelsesblandingen. Start sprøyteuttaket for å samle oversettelsesblandingen i pumpeslangen. Snu sprøytepumpeinnstillingen til dispenseringsmodus og sett flyten til en optimal hastighet for levering av oversettelsesblandinger.
    MERK: Unngå å generere bobler i oversettelsesblandingen når du overfører den til pumpeslangen. Unngå å trekke oversettelsesblandingen for dypt inn i den delen av slangen som ikke ble desinfisert og skyllet i trinn 3.6. Ved etablering av analysen testes ulike leveringsflythastigheter for å bestemme den optimale hastigheten (se trinn 6.2. for detaljer om analysekalibrering).
  3. Hvis det er et gap mellom slangeenden og oversettelsesblandingen, start sprøytepumpen og la oversettelsesblandingen nå slangeenden, og stopp deretter sprøytepumpen.
  4. Sett pumperørenden inn i strømningskanalens innløp. Unngå å introdusere luftbobler i oversettelsesblandingen når du utfører tilkoblingen. Stabiliser tilkoblingen ved å skru den skreddersydde metallbraketten på mikroskopets prøveholderplate. Vurder mikroskopfokus og avbildningsområdefluorescens.
    MERK: Slangen kan klemmes fast til strømningskammeret med en tilpasset del som tidligere beskrevet33. Andre typer fluidikksystemer kan også brukes til denne analysen34. Synsfeltet skal se likt ut før og etter tilkobling av slangen. Hvis det dukker opp flere fluorescerende flekker etter tilkoblingen, lekker oversettelsesblandingen sannsynligvis fra leveringsslangen. Avhengig av programmet kan det hende at kanalen med lekket oversettelsesmiks må kastes.
  5. Kontroller at parameterne for filmanskaffelse er riktige, og at riktig filnavn og mappe er angitt for lagring av filer.
  6. Flytt fasen for å bilde et område i midten av strømningskanaldeteksjonsoverflaten. På berøringsskjermen for mikroskopkontroll velger du kategorien Kontinuerlig AF og klikker fokussøk og startknappen for å opprettholde fokusposisjonen under eksperimentet. Et pip høres når et fokusplan oppnås.
  7. Åpne laserlukkeren i programvare 2. I programvare 1 klikker du på Take Signal-knappen for å starte innspillingen. Etter ca. 5 s opptak, skriver du inn Kjør-kommandoen i Coolterm for å levere oversettelsesmiksen inn i flytkanalen. Ta opp i opptil 2 timer med en tidsoppløsning på 0,5–2 s/ramme.
    MERK: Maksimal mengde datainnsamling avhenger av hvor raskt oversettelsesekstraktet mister aktivitet over tid, noe som enkelt kan karakteriseres ved å utføre bulkcellefri oversettelse med luciferase reporter mRNA og måle luciferaseaktivitet i oversettelsesreaksjonene på forskjelligetidspunkter 35.
  8. Når datainnsamlingen er fullført, slår du av laseren, slår av kontinuerlig AF på berøringsskjermen for mikroskopkontroll og demonterer slangen fra strømningskammeret.
  9. Pipette ut oversettelsesblandingen fra strømningskanalinntaket, overfør den til et mikrofugerør og frys løsningen ved å plassere røret i flytende nitrogen. Oppbevars senere ved -80 °C.
  10. Vask sprøytepumpen tre ganger med RNase-fritt vann, deretter tre ganger med 70% etanol. Trekk 70% etanol inn i sprøytepumpeslangen for lagring.
  11. Slå av mikroskopet og alt tilbehør. Rydd opp.

6. Dataanalyse

MERK: Dataanalyse for denne analysen krever vanlige metoder i biofysiske studier med ett molekyl. Alle beregningsintensive trinn kan oppnås ved hjelp av eksisterende algoritmer og programvare (referanser er inkludert nedenfor på deres tilsvarende trinn).

  1. Valgfritt: Konverter eventuelt den anskaffede bildeseriefilen til et format som er kompatibelt med den valgte bildebehandlingsprogramvaren eller programmeringsspråket.
  2. Bestem startpunktet for oversettelsesreaksjonen og reagensutvekslingstiden.
    MERK: På grunn av de diffuserende fluorescerende antistoffene i oversettelsesblandingen, vil bakgrunnsfluorescensintensiteten til et avbildet område øke under in-channel reagensutveksling fra oversettelseskompatibel buffer til oversettelsesblanding. Startpunktet for oversettelsesreaksjonen angis som tidspunkt når reagensutvekslingen er fullført. Dette fullføringspunktet er funnet ved å måle bakgrunnsfluorescensintensiteten under oversettelsesblandingen levering og identifisere tidspunktet når den økende fluorescensintensiteten platåer15, som beskrevet nedenfor.
    1. Beregn totalt antall fluorescens per bilderamme og tegn inn den tilsvarende tidsprofilen. Identifiser den plutselige økningen i total fluorescens i tidsprofilplottet.
      MERK: Den totale fluorescensøkningen skyldes den økende konsentrasjonen av fluorescerende merket antistoff under reagensutvekslingen.
    2. Identifiser sluttpunktet for den totale fluorescensøkningsfasen og angi dette tidspunktet som utgangspunkt (dvs. tid 0) for oversettelsesreaksjonen. Identifiser både start- og sluttpunktene i den totale fluorescensøkningsfasen og angi tidsforskjellen som reagensutvekslingstid.
      MERK: Den totale tidsperioden for reagensutveksling avhenger av strømningskanaldimensjonene og den valgte strømningshastigheten. Det er mulig at noen oversettelsesfaktorer kan begynne å binde seg til mRNA før reagensutvekslingen er fullført, noe som kan redusere oppløsningen av den bestemte starttiden for første runde. Det anbefales derfor å teste ulike strømningshastigheter når du setter opp analysen og velge strømningshastigheter som tillater reagensutvekslingsfullføring innen 3–4 s for datainnsamlingshastigheter på 0,5–2 s/ramme.
  3. Valgfritt: Utfør korrigering av filmdrift.
    MERK: Posisjonene til bundne antistoffer i databildet kan endres over tid på grunn av drift av mikroskopdeler og tilbehør. Drift som er visuelt merkbar i en film krever korrigering før du fortsetter videre med dataanalyse. Flere romlige drivkorrigeringsalgoritmer og skript er tilgjengelige36,37,38.
    1. I hvert bilde finner du den lokale maksimen i pikselantall for å bestemme plasseringen av bundne antistoffer i hvert delbilde med nøyaktigheten på pikselnivå. Angi en terskel for pikselantallet slik at bare flekker som er tydelig over bakgrunnsstøyen, velges.
    2. Beregn endringene av individuelle antistoffposisjoner i hver retning mellom to påfølgende bilderammer.
    3. Plott histogrammet av antistoff posisjonsendringer mellom to påfølgende rammer og gjør det separat for hver retning. Gaussian passer til hvert histogram og angir den midterste posisjonen til topper som retningsdrift mellom to påfølgende rammer.
    4. Hvis du vil motvirke den observerte driften, flytter du hver bilderamme i motsatt retning med den beregnede drivmengden.
  4. Konstruer enkeltmolekylsbaner.
    MERK: Deteksjons-/sporingsprogramvare er tilgjengelig for å identifisere lyse flekker og trekke ut intensitetene fra databildeserien39,40.
    1. Identifiser antistoffposisjoner som beskrevet i trinn 6.3.1.
      MERK: Visuell inspeksjon anbefales for å sikre at den valgte terskelen ikke gir opphav til overdreven over- eller underplukking av partikler. Visuell inspeksjon kan oppnås ved å legge de identifiserte centroidposisjonene over hver bilderamme og visuelt vurdere avtalen (se Representative Resultater).
    2. Kombiner de plukkede partiklene fra alle rammer og fjern overflødige partikkelposisjoner.
    3. Inspiser visuelt bildene av bundne antistoffer og velg et firkantet område som omslutter pikslene med tellinger som er tydelig over bakgrunnen og representative for individuelt bundet antistoff.
      MERK: Punktspredningsfunksjonen (dvs. størrelsen på firkanten for et enkelt molekyl) bestemmes av det optiske oppsettet og detektorpikselstørrelsen.
    4. For hver partikkelposisjon konstruerer du en enkeltmolekylsbane ved å beregne den totale intensiteten til alle pikslene i det firkantede området rundt partikkelposisjonen. Baner er konstruert for hver posisjon, ramme for ramme og for hele datafilmen.
  5. Valgfritt: Påfør et ikke-lineært bakoverfilter41 for å redusere bakgrunnsstøy i enkeltmolekylbaner.
  6. Valgfritt: Digitaliser baner med eksisterende trinngjenkjenningsalgoritmer42,43,44,45.
    MERK: Valget av trinndeteksjonsalgoritme avhenger av kompleksiteten til enkeltmolekyldynamikken. For det enkleste scenariet av bare isolert ribosomoversettelse (dvs. ingen polysomdannelse) og godt signal-til-støy-forhold, er en terskelapplikasjon til fluorescenstallene tilstrekkelig for å identifisere tidspunktet for antistoffbinding og dissosiasjonshendelser i enkeltmolekylbanene. Visuell inspeksjon av minst 100 baner for hver tilstand anbefales for å sikre at banetrinn er riktig valgt av en trinndeteksjonsstrategi.
  7. Bestem tidspunktet for den første antistoffbindingshendelsen for hver bane (dvs. første ankomsttid, t1), enten ved hjelp av digitaliserte baner eller bruk av en terskel på uverdige baner.
    MERK: Medianverdien for distribusjon av første ankomsttid kan sammenlignes mellom ulike oversettelsesbetingelser. Alternativt kan den første ankomsttidsdistribusjonen monteres på en forskjøvet (3-parameter) log-normal funksjon for å bestemme gjennomsnittsverdien15 <t1>. Fordi den første ankomsttidsdistribusjonen vanligvis er skjev og har en lang hale, må du ikke beregne gjennomsnittet ved å beregne gjennomsnittet direkte over de observerte første ankomsttidene.
  8. Valgfritt: Dwell tidsanalyse og beregning av gjennomsnittlig peptidsynteserate.
    1. Bruk digitaliserte baner til å identifisere monosome (enkelt ribosome) oversettelseshendelser i hver bane og beregne enkeltbindingshendelsen som bortider som tidsforskjellen mellom tilsvarende antistoffbinding og dissosiasjonshendelser.
      MERK: Trinndeteksjonsalgoritmer for digitaliseringsbaner er generelt mindre pålitelige når flere molekylære hendelser overlapper i tide. Det anbefales derfor å ekskludere polysome hendelser fra dwell timeanalyse. For svært aktive oversettelsessystemer som er beriket med polysome hendelser og sjelden viser monosome hendelser, kan en blanding av merkede og umerkede antistoffer brukes til å øke sjansen for å observere isolerte oversettelseshendelser i enkeltmolekylbaner.
    2. Tilpass fordelingen til en log-normal funksjon og bruk den monterte funksjonen til å beregne gjennomsnittlig oppholdstid.
      MERK: Beregning av gjennomsnittet direkte ved å beregne gjennomsnittet av observerte oppholdstider anbefales ikke fordi dwell-tidsfordelingene vanligvis er skjevt med lange haler.
    3. Bestem antall aminosyrer som oversettes under antistoffbindingen bor ved å trekke summen av epitop aminosyrelengden og 35 (gjennomsnittlig aminosyrelengde av nascent peptid i ribosomet utgangstunnel) fra det totale antallet ORF-kodoner.
    4. For å bestemme gjennomsnittlig peptidsyntesehastighet, del antall oversatte aminosyrer med gjennomsnittlig oppholdstid.
  9. Valgfritt: Beregning av gjennomsnittlig starttid for første runde (<t1_I>).
    MERK: Initierings- og forlengelsesbetingelser, for eksempel initieringsstedsekvenskonteksten og kodesekvensen, bevares vanligvis bevisst for studier av initieringskinetikk. Derfor er gjennomsnittlig første ankomsttid <t1> fra trinn 6.7. kan brukes direkte til å beregne endringen i første runde initiering kinetikk mellom ulike forhold. Følgende korrigering er bare nødvendig for å bestemme den faktiske verdien av første runde initieringstid.
    1. Del summen av epitoplengden og 35 (den gjennomsnittlige aminosyrelengden på nascentpeptid i ribosomets utgangstunnel) ved gjennomsnittlig peptidsyntesehastighet (fra trinn 6.8.4.) for å beregne gjennomsnittlig peptidforlengelsestid for denne N-terminalregionen (<t1_tag>).
    2. Siden den første ankomsttiden er summen av starttiden for første runde og t1_tag, trekker du <t1_tag> fra den gjennomsnittlige første ankomsttiden <t1> for å beregne gjennomsnittlig starttid for første runde <t1_I>: <t1_I> = < t 1 > - < t 1_tag > = <t1> - <t1_tag> & gt;

7. Analysekalibrering

MERK: Utfør følgende kalibreringstrinn når du først oppretter analysen.

  1. Hvis du vil undersøke antistoffbindingsspesifikkiteten, utfører du protokolltrinnene i avsnitt 4 og 5 separat for ukodede og kodede mRNAer (figur 2). Antistoffbindingsnivåene i kanaler med disse respektive mRNAene representerer omfanget av ikke-spesifikk antistoffbinding til påvisningsoverflaten og spesifikk antistoffbinding til nascent peptid.
    MERK: Det spesifikke til ikke-spesifikke bindingsforholdet anbefales å være >10 og kan økes med forskjellige overflate passivasjonsstrategier, lavere antistoffkonsentrasjon eller høyere mRNA overflatetetthet.
  2. For å måle frekvensen av antistoffbinding, utfør protokollen med et ekstra trinn mellom trinn 4 og trinn 5.
    1. Etter trinn 4 inkuberer du kanalen med oversettelsesblanding som mangler antistoff for å forhåndsgenerere mRNA/ ribosom / peptidkomplekser.
    2. Fortsett deretter til trinn 5 og strømning antistoff-supplert oversettelsesblanding inn i kanalen.
    3. Kvantifisere den gjennomsnittlige antistoffbindingshastigheten til forhåndsgenerert nascent peptid med eksponentiell tilpasning til første ankomsttid histogram.
      MERK: Antistoffbinding til forhåndsgenerert peptid bør være rask, i rekkefølgen av sekunder, og bør være raskere enn oversettelseskinetikken. En høyere antistoffkonsentrasjon kan brukes til å øke antistoffbindingshastigheten.
  3. Foto ustabilitet av fluorofor-merket antistoff.
    1. Klargjør et lysbilde i henhold til protokollen i trinn 2, men hopp over PEGylation-trinnet. Monter strømningskammeret etter saltiseringstrinnet. Silanbelegget gir effektiv ikke-spesifikk antistoffbinding til deteksjonsoverflaten.
    2. Tilsett de fluorescerende merkede antistoffene i kanalen for å oppnå enkeltmolekyltetthet av ikke-spesifikk antistoffbinding til deteksjonsoverflaten. Begynn med å tilsette fluorescerende merket antistoff som er svært fortynnet i T50 vaskebuffer og gradvis øke antistoffkonsentrasjonen til ønsket enkeltmolekyltetthet oppnås.
    3. Avvis deteksjonsoverflaten til det meste av antistofffluorescensen ikke lenger kan påvises.
    4. Plott det totale antallet synlige antistoffer over tid for å vurdere frekvensen av antistofffluorescenstap på grunn av fluorofor fotobleking.
      MERK: Antistoffmerking gir vanligvis flere fluoroforer per antistoff. Individuelle antistoffer forblir påvisbare til alle konjuged fluoroforer fotoblekemiddel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Etter protokollen som er beskrevet, muliggjør avbildning av individuelle antistoffinteraksjoner med nascent N-terminal-taggede polypeptider med enkeltmolekyloppløsning under aktiv cellefri oversettelse av 3' end-tethered reporter mRNA (Figur 1). Et minimalt demonstrasjonseksperiment rapporteres ved bruk av tre syntetiske mRNAer: LUC (koding ukodet luciferase), LUCFLAG (koding 3xFLAG-merket luciferase) og hp-LUCFLAG (LUCFLAG med en stabil stammeløkke i 5's lederregion) (Figur 2C). Bruken av luciferase-koding mRNA muliggjør sammenligninger mellom enkeltmolekylobservasjoner og bulk luminescensmålinger. Integriteten til 3' biotinylert mRNA ble vurdert ved å denaturere polyakrylamidgelelektroforese (PAGE) og RNA-farging. MRNA av god kvalitet viser et enkelt rent bånd og skal ikke vise flere raskere migreringssignaler (Figur 3A). Saccharomyces cerevisiae oversettelsesekstrakt ble brukt her og utarbeidet etter en protokoll som tidligere ble beskrevet30 og endret15. Bulkmålinger av luciferaseaktivitet i cellefrie oversettelsesreaksjoner med gjærekstraktet og biotinylert LUCFLAG mRNA som enten mangler eller inneholder en m7G-hette, viser hettestimulering av LUCFLAG mRNA-oversettelse ( Figur3B).

For enkeltmolekylavbildning ble oversettelsesekstrakt supplert med 67 nM Cy3-merket anti-FLAG antistoff (Cy3-αFLAG). Dette antistoffet hadde et høyt merkeforhold på 2-7 fargestoffer per antistoff. Laseren på 532 nm ble satt til 10 μW på målet. Laserhendelsesvinkelen ble satt til 71,5°, som var større enn den kritiske vinkelen på 63,8° for vårt oppsett. Et lavt fluorescensnivå ble avbildet fra deteksjonsflater som inneholder mRNA, men mangler oversettelsesblanding (figur 4A). For kanaldimensjoner på ca. 2 mm (bredde) x 50 μm (dybde) x 24 mm (lengde), ga en strømningsleveringshastighet på 150 μl/min en reagensutvekslingstid på 3 – 4 s. Innen 5 s av levering av oversettelsesblanding øker bakgrunnsfluorescensnivået på grunn av de diffuserende fluorescerende antistoffene. Omtrent 2 min etter levering av oversettelsesblanding til LUCFLAG mRNA-inneholdende kanaler, begynte Cy3-flekker å dukke opp i et synsfelt og fortsatte å samle seg i ~ 30 min (Figur 4B). Ikke-spesifikk antistoffbinding til overflaten, målt ved hjelp av den 3xFLAG-manglende LUC mRNA (figur 2C), forble på et svært lavt nivå15. Signalene fra mRNA/ribosomet/peptidbundet Cy3- αFLAG var godt synlig med den optimaliserte laserhendelsesvinkelen, men kunne maskeres med høy fluorescensbakgrunn med lavere laserhendelsesvinkler (figur 4C).

For å analysere Bindingshendelser i Cy3-αFLAG ble fluorescensintensiteten for utvalgte Cy3-αFLAG-flekker (figur 5A) beregnet ramme for ramme for hele filmen og deretter koblet til for å danne en intensitetsbane (Figur 5B). Rå baner kan virke støyende og kan kreve presisering med et ikke-lineært bakoverfilter for å redusere bakgrunnsstøy41. Ytterligere raffinement kan oppnås ved hjelp av trinndeteksjonsalgoritmer for å digitalisere banene42. For alle baner vises en universell økning i fluorescensnivået under reagensutveksling på grunn av de diffuserende fluorescerende antistoffene i oversettelsesblandingen (figur 5B). Antistoffbinding til et nascent polypeptid forårsaket en øyeblikkelig økning i fluorescens, mens antistoff/polypeptiddissosiasjon fra mRNA forårsaker en øyeblikkelig fluorescensreduksjon (Figur 5B).

Oppholdstiden for antistoffbinding kan brukes til å måle den totale dekodingstiden til en åpen leseramme. Dwell time histogram for LUCFLAG mRNA passer til en log-normal fordeling ( Figur6A) og ga en peptidsyntesehastighet på 2,5 ± 0,1 aminosyrer per sekund15. Histogrammet for første ankomsttid passer til en forskjøvet (3-parameter) log-normal funksjon (figur 6B). Den brede spredningen av første ankomsttid histogram viser den høye graden av heterogenitet i single mRNA oversettelse aktivitet. Histogrammet indikerte at den første peptidsyntesehendelsen på enkle LUCFLAG mRNA-molekyler kunne begynne så tidlig som 2 min, og så sent som 20 min, etter levering av oversettelsesblanding (Figur 6B). Sammenlignet med oversettelse med LUCFLAG mRNA, viste den første ankomsttiden histogram med hp-LUCFLAG mRNA-oversettelse langsommere antistoffbinding ( Figur7A). Bruk av masse luminescensmålinger fra cellefrie oversettelsesreaksjoner med de samme mRNAene løser imidlertid ikke forskjeller i oversettelseskinetikk (figur 7B,C). Disse resultatene viser den høyere oppløsningen av metoden vår sammenlignet med bulk kinetiske luciferase aktivitetsmålinger for å oppdage små endringer i initieringskinetikk.

Figure 1
Figur 1: Protokollflytskjema. Skjematiske representasjoner av coverlip og lysbildeforberedelse, kammermontering med ett molekyl, TIRF-avbildning og datainnsamling og dataanalysetrinn vises. TIRF-bildetrinnet inneholder skjematiske skildringer av mRNA-immobilisering og oversettelse i en strømningskanal. Deteksjon av overflatekomponenter, fluorescerende merket antistoff og celleekstraktkomponenter er indikert. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: mRNA-design for enkeltmolekylanalysen. (A) For å tilpasse en bulkoversettelsesanalyse til enkeltmolekylanalysen, ble DNA-malen til bulkreporteren ORF modifisert med en N-terminal epitop-tagsekvensinnsetting for å generere en tag reporter-koding ORF. ORF- og N-terminal tag-kodingsregioner er indikert. (B) mRNAer var 5′-m7G avkortet for å tillate cap-avhengig oversettelse og 3′-biotinylated for deres immobilisering til enkeltmolekyl deteksjon overflate. 5′-m7G hette og 3′-biotin er indisert på ukodede og taggede ORF RNAer. (C) Luciferase-koding mRNAer ble brukt til å demonstrere enkeltmolekylanalysen. LUC og LUCFLAG mRNAs koder luciferase som mangler og inneholder en N-terminal 3xFLAG-kode. hp-LUCFLAG mRNA inneholder en ekstra innsetting som introduserer en hårnål sekundær struktur i LUCFLAGG mRNA 5′-leder. Hårnålstermabiliteten, 3′-poly(A) halen og 3′-biotin er indikert. Alle tre mRNAene inkluderte en 30 nt 3′-poly(A) hale for mer effektiv cap-avhengig oversettelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Enkeltmolekylreporter mRNA-integritet og bulkoversettelse. (A) Representativ denaturing PAGE bildebehandling av single-molekyl reporter mRNA. 5′-m7G capped og 3′-biotinylated LUCFLAG mRNA ble lastet på en denaturing 10% polyakrylamid gel ved siden av en RNA stige. (B) Enkeltmolekylreporter mRNA bevarte 5' cap-dependence i bulkcellefrie oversettelsesreaksjoner. 3′-biotinylated LUCFLAG mRNA som enten manglet (–cap) eller inneholdt (+ cap) en 5′-m7G hette ble oversatt i S. cerevisiae oversettelse ekstrakt i 30 min ved 25 °C. Luciferase-aktiviteten ble målt fra to uavhengige reaksjoner og normalisert til aktiviteten med –cap mRNA, som vilkårlig settes til 1,0. Standardavvik fra gjennomsnittsverdier angis av feilfelt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Avbildning av deteksjonsoverflater som inneholder immobilisert mRNA. (A) Bakgrunnsfluorescens i fravær av oversettelsesblanding. (B) Cy3 fluorescerende flekker i et synsfelt 30 min etter oversettelsesblandingen levering og med en optimalisert laserhendelsesvinkel. (C) Avbildet synsfelt 30 min etter levering av oversettelsesmiks og med lav laserhendelsesvinkel. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Bildeanalyse. (A) Cy3-flekker i et synsfelt uten (venstre panel) eller med (høyre panel) spotmarkering. (B) Eksempel på enkeltmolekylbane for et valgt Cy3-sted. Den svarte pilen indikerer økningen i bakgrunnsfluorescens på grunn av diffust antistoff under levering av oversettelsesblanding. Den grønne pilen indikerer den plutselige økningen i fluorescensintensiteten på grunn av Cy3-αFLAG-binding. Den røde pilen indikerer den plutselige reduksjonen i fluorescensintensiteten på grunn av Cy3-αFLAG / nascent peptiddissosiasjon fra mRNA. Oppholdstiden for en Cy3-αFLAG bindingshendelse er indikert med en tohodet pil. Rå, filtrerte og digitaliserte data angis. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Kinetisk analyse av Cy3-αFLAG binding med LUCFLAG mRNA oversettelse. (A) Cy3-αFLAG bindingen bor tid histogram passer til en log-normal distribusjon. (B) Cy3-αFLAG binding første ankomsttid histogram passer til en forskjøvet (3-parameter) log-normal funksjon. Tilpasset fra Wang et al.15 med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Enkeltmolekylanalysen har en høyere oppløsning for initieringskinetikk enn bulk luminescensanalysen. (A) Første ankomsttid histogrammer for Cy3-αFLAG binding med oversettelse av LUCFLAG og hp-LUCFLAG mRNAs avslørt langsommere initiering forårsaket av en liten hårnål struktur i mRNA 5′-leder. N = 10650 baner (LUCFLAG), kombinert fra 3 datasett og N = 4079 baner (hp-LUCFLAG), kombinert fra 2 datasett. (B,C) Kinetiske målinger for bulk luciferase-aktivitet utførte ikke forskjeller i initieringskinetikk for LUCFLAG (N = 9 datasett) og hp-LUCFLAG (N = 6 datasett) mRNA-oversettelse. (B) Bulk luminescen kinetikk. (C) Spred plott av første runde oversettelsestider bestemt av gaussisk tilpasning til det andre derivatet av luminescenskinetikkkurvene i (B), som beskrevet av Vassilenko et al. 46. De røde sirklene og stolpene i (C) representerer gjennomsnittsverdien og standardavviket for henholdsvis beregnet første runde av oversettelsestiden. Tilpasset fra Wang et al.15 med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sammenlignet med typiske in vitro TIRF enkeltmolekyleksperimenter, er enkeltmolekylavbildning med analysen beskrevet her i tillegg kompleks på grunn av bruk av celleekstrakt og en høy konsentrasjon av fluorescerende merket antistoff. Sammenlignet med den vanligste praksisen med en runde med overflate PEGylering, reduserer en andre runde PEGylering (trinn 2) i stor grad ikke-spesifikk antistoffbinding til deteksjonsoverflate15. Den høye konsentrasjonen av diffuserende fluorescerende antistoffer forårsaker en ekstremt høy fluorescerende bakgrunn som maskerer enkeltmolekyldeteksjon av antistoffbinding. For å redusere denne fluorescerende bakgrunnen økes laserhendelsesvinkelen godt over den kritiske vinkelen (trinn 3.4.). Antistoffdeteksjon reduseres også av overdreven fluorofor ustabilitet, noe som kan begrense evnen til å kvantifisere oppholdstid. Når du støter på dette problemet, erstatt fluoroforen med en mer fotosabel fluorofor, for eksempel de som er konjugert til en triplet-state quencher47, eller senk laserbelysningsintensiteten. Selv om oksygenoppfinnende systemer ofte brukes i in vitro enkeltmolekyleksperimenter for å undertrykke fluorofor fotobleking48,49, kan analysen beskrevet her gi et veldig sjenerøst deteksjonsvindu uten å implementere oksygenoppfinnende systemer15. Videre kan oksygenoppfinnende systemer i stor grad redusere eukaryotisk cellefri oversettelseseffektivitet. Derfor bør oksygenoppfinnende systemer vurderes nøye før bruk med denne analysen.

Det er viktig å påpeke at små variasjoner i reagenspreparatet oppdages av analysen på grunn av dens enkeltmolekyloppløsning. Replikering av oversettelsesuttrekksforberedelser kan for eksempel vise forskjellige aktiviteter som kan oppdages eller ikke kan oppdages ved hjelp av massemetoder. Videre kan fryse-tine sykluser av oversettelsesekstrakt og andre reagenser raskt svekke oversettelsesaktiviteten. Vi anbefaler å gjøre småskala piloteksperimenter med lett tilgjengelig materiale for å teste forholdene før du planlegger en systematisk studie. For en systematisk studie anbefales store preparater av oversettelsesreagenser, engangs aliquots for fryse-/tinefølsomme reagenser og konsistens i å utføre protokolltrinn. Oversettelsesekstrakt som er flash frosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 °C, viser minimalt aktivitetstap i minst to år. Anvendelse av disse tiltakene kan effektivt undertrykke eksperimentelle variasjoner og øke robustheten til enkeltmolekylanalysen.

Siden denne metoden kombinerer eksisterende bulkcellefrie oversettelsessystemer og in vitro enkeltmolekylavbildningsteknikker, diskuteres ikke feilsøking av generiske problemer på disse to områdene her. Eksempler på slike generiske problemer inkluderer preparater av lav kvalitet av reporter mRNA eller PEGylated coverlip og lav oversettelsesaktivitet av celleekstrakt. Her vil vi fokusere på problemer som er spesifikke for denne metoden. I tillegg til de flere tekniske problemene som er omtalt i protokollen, kan et annet potensielt problem være lavt eller ingen antistoffbinding i strømningskanalen for en oversettelsesbetingelse som forventes å ha god aktivitet. Det er flere muligheter for feilsøking. Effektiviteten av biotinylert mRNA immobilisering til deteksjonsoverflaten kan vurderes ved å gløde komplementære og fluorofor-konjugerte DNA-oligomerer til den immobiliserte mRNA og bilde av fluorescerende DNA: RNA-duplekser. Kvaliteten på oversettelsesmiksen og biotinylerte reporter-mRNAer kan kontrolleres ved å kjøre masseoversettelsesanalysen. Videre, etter å ha utført en oversettelsesreaksjon i en mRNA-immobilisert strømningskanal, kan oversettelsesreaksjonsløsningen pipetteres ut av kanalen og brukes i en reporteraktivitetsanalyse for å bekrefte forekomsten av in-channel oversettelse. Om nødvendig kan en for høy mRNA-overflatetetthet brukes til kanaloversettelsesreaksjonen for å muliggjøre enklere deteksjon av reporteraktivitetsanalysen.

Den største begrensningen i denne analysen er oppløsningen for initieringskinetikk. I denne analysen inneholder den direkte eksperimentelle produksjonen, første ankomsttid, både første runde initieringstid og peptidforlengelsestid for å oversette epitopen og 35 ekstra codons. Selv om bidraget fra peptidforlengelsestiden kan korrigeres (trinn 6.9.), er denne analysen derfor mest følsom for måling av initieringskinetikk som oppstår i løpet av minutter, som ser ut til å være en generisk egenskap av cap-avhengig initiering15. Eksperimentelt er det lett å tilpasse denne analysen til å studere andre initieringsmekanismer. Men hvis en initieringsmekanisme oppstår betydelig raskt i rekkefølgen av sekunder, er det lite sannsynlig at denne analysen løser initieringskinetikken.

Enkeltmolekyltilnærmingen som beskrives her, kombinerer enkeltmolekylavbildning og ekstraktbasert oversettelse for å muliggjøre målinger av individuelle capavhengige oversettelseshendelser i sanntid og under aktiv cellefri oversettelse. Analysen gjør det enkelt å gå over fra en bulkoversettelsesanalyse til en enkeltmolekylanalyse, samtidig som masseoversettelseskinetikken bevares. Dermed kan enkeltmolekylelle kinetiske observasjoner tolkes i direkte referanse til tilsvarende bulkresultater. Tidligere metoder, inkludert nylig utviklede in vivo-tilnærminger 11,12,13,14, mangler oppløsningen for kinetiske målinger av individuelle oversettelsesstarthendelser og krever antagelser om oversettelsesmekanismer for å trekke ut initieringstidsgjennomsnitt fra eksperimentelle observerbare. Enkeltmolekylmetoden som presenteres her, gir den første hypotesefrie tilnærmingen for å kvantifisere gjennomsnittlig starttid for aktiv capavhengig oversettelse. Videre, selv om bulk kinetiske målinger med en luminescensanalyse har blitt brukt til å gi de mest kvantitative og systematiske bulkkarakteristikkene av cap-avhengige oversettelseskinetikk til dags dato46,50, måler enkeltmolekylanalysen beskrevet her gjennomsnittlig initiering kinetiske endringer med større følsomhet enn bulkanalysen ( Figur7). I tillegg bevarer enkeltmolekyldataene enkel mRNA-oversettelse stochasticity og heterogenitet, egenskaper som er gjennomsnittet ut i bulkmålinger. Enkeltmolekyloppløsningen av translasjonskinetikk kan brukes til systematiske kinetiske analyser for å avdekke innsikt i oversettelsesmekanismer som ikke kan oppnås med andre metoder.

Denne analysen er kompatibel med eksisterende biokjemiske og genetiske tilnærminger som ofte brukes til oversettelsesstudier. For eksempel kan oversettelsesfunksjonen til en bestemt faktor studeres ved å generere faktorutarmet ekstrakt og supplere det med wild-type eller mutantfaktor. I tillegg, ved å supplere fluorescerende merket faktor, kan studier potensielt undersøke det kinetiske forholdet mellom faktorbinding og oversettelsesprogresjon. Ved bruk av to distinkte epitop-/antistoffpar kan denne protokollen potensielt utvides fra en enfarget analyse til en tofarget analyse som muliggjør samtidig deteksjon av to distinkte kodesekvenser. Denne tilpasningen vil tillate sporing av oversettelsen av forskjellige leserammer og kan brukes på frameshifting og starte studier av valg av nettsteder. Alternativt kan et tofarget system brukes til å oppdage antistoffinteraksjoner med taggede polypeptider kodet av oppstrøms og nedstrøms åpne leserammer for å overvåke både oppstrøms og nedstrøms oversettelseshendelser på individuelle mRNAer. Disse utvidelsene kan muliggjøre et bredt spekter av mekanistiske studier som undersøker cap-avhengig oversettelse og regulering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health [R01GM121847]; Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) støtter tilskudd/kjernestipend (P30 CA008748); og MSKCC Functional Genomics Initiative.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100X oil objective, N.A. 1.49 Olympus UAPON 100XOTIRF
Acryamide/bis (40%, 19:1) Bio-Rad 161-0144
Alkaline liquid detergent Decon 5332
Aminosilane (N-(2-Aminoethyl)-3-Aminopropyltrimethoxysilane) UCT Specialties, LLC A0700
Andor ixon Ultra DU 897V EMCCD Andor DU-897U-CSO-#BV
Andor Solis software Andor For controlling the Andor EMCCD
Band-pass filter Chroma 532/640/25
Band-pass filter Chroma NF03-405/488/532/635E-25
Biotin-PEG-SVA Laysan Bio Inc Biotin-PEG-SVA
Coenzyme A free acid Prolume 309-250
Coolterm software For controlling the syringe pump
Desktop computer Dell For controlling the microscope, camera, stage, and pump.
Dichroic mirror Semrock R405/488/532/635
Direct-zol RNA microprep 50RNX Fisher Scientific NC1139450
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega E1910
Epoxy Devcon 14250
Firefly luciferin D-Luciferin free acid Prolume 306-250
Glacial acetic acid Fisher Scientific BP1185500
Hydrogen perioxide Sigma-Aldrich 216763-500ML
Immersion oil Olympus Z-81226A Low auto-fluorescence
Luciferase Assay System Promega E1500
MEGASCRIPT T7 Transcription Kit Thermo fisher AM1334
Methanol Fisher Scientific MMX04751
Microscope Olympus IX83
Microscope slide Thermo Scientific 3048
Monoclonal anti-FLAG M2-Cy3 Sigma-Aldrich A9594
mPEG-SVA Laysan Bio Inc mPEG-SVA-5000
MS(PEG)4 Thermo Scientific 22341
NaCl (5M) Thermo Scientific AM9760G
No 1.5 microscope Cover glass Fisherband 12-544-C
Olympus Laser, 532nm 100mM Olympus digital Laser system CMR-LAS 532nm 100mW
Olympus TirfCtrl software Olympus For controlling the laser intensity and incident angle
Optical table TMC vibration control 63-563 With vibration isolation
Phenol chloroform isoamyl alcohol mix Sigma-Aldrich 77617-100ml
Pierce RNA 3' End Biotinylation Kit Thermo Scientific 20160
Potassium hydroxide pellets Sigma-Aldrich P1767-500G
Prior motorized XY translation stage Prior PS3J100
Prior PriorTest software Prior For controlling the Prior motorized stage
Recombinant RNasin RNase Inhibitor Promega N2515
Stage top Incubator In vivo scientific (world precision Instruments) 98710-1 With a custom built acrylic cage
Staining jar Fisher Scientific 08-817
Streptavidin Thermo Scientific 43-4301
Sulfuric acid Fisher Scientific A300212
SYBR green II Fisher Scientific S7564
Syringe Hamilton 1725RN
Syringe pump Harvard apparatus 55-3333
Tris (1M), pH = 7.0 Thermo Scientific AM9850G
Ultrasonic Bath Branson CPX1800H
Urea Sigma-Aldrich U5378-500G
Vaccinia Capping system New England Biolabs M2080S
Zymo-Spin IC Columns Zymo Research C1004

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hinnebusch, A. G. The scanning mechanism of eukaryotic translation initiation. Annual Review of Biochemistry. 83, 779-812 (2014).
  2. Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 827-835 (2004).
  3. Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 113-127 (2010).
  4. Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. Translational control in cancer. Nature Reviews Cancer. 10, 254-266 (2010).
  5. Saini, A. K., Nanda, J. S., Lorsch, J. R., Hinnebusch, A. G. Regulatory elements in eIF1A control the fidelity of start codon selection by modulating tRNA(i)(Met) binding to the ribosome. Genes and Development. 24, 97-110 (2010).
  6. Algire, M. A., et al. Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system. RNA. 8, 382-397 (2002).
  7. Amrani, N., Ghosh, S., Mangus, D. A., Jacobson, A. Translation factors promote the formation of two states of the closed-loop mRNP. Nature. 453, 1276-1280 (2008).
  8. Pisarev, A. V., Unbehaun, A., Hellen, C. U., Pestova, T. V. Assembly and analysis of eukaryotic translation initiation complexes. Methods in Enzymology. 430, 147-177 (2007).
  9. Hinnebusch, A. G. Structural insights into the mechanism of scanning and start codon recognition in eukaryotic translation initiation. Trends in Biochemical Sciences. 42, 589-611 (2017).
  10. Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The growing toolbox for protein synthesis studies. Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).
  11. Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352, 1425-1429 (2016).
  12. Wang, C., Han, B., Zhou, R., Zhuang, X. Real-time imaging of translation on single mRNA transcripts in live cells. Cell. 165, 990-1001 (2016).
  13. Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. H. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 352, 1430-1435 (2016).
  14. Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. Dynamics of translation of single mRNA molecules in vivo. Cell. 165, 976-989 (2016).
  15. Wang, H., Sun, L., Gaba, A., Qu, X. An in vitro single-molecule assay for eukaryotic cap-dependent translation initiation kinetics. Nucleic Acids Research. 48, 6 (2020).
  16. Aitken, C. E., Lorsch, J. R. A mechanistic overview of translation initiation in eukaryotes. Nature Structural & Molecular Biology. 19, 568-576 (2012).
  17. Anderson, C. W., Straus, J. W., Dudock, B. S. Preparation of a cell-free protein-synthesizing system from wheat germ. Methods in Enzymology. 101, 635-644 (1983).
  18. Erickson, A. H., Blobel, G. Cell-free translation of messenger RNA in a wheat germ system. Methods in Enzymology. 96, 38-50 (1983).
  19. Iizuka, N., Najita, L., Franzusoff, A., Sarnow, P. Cap-dependent and cap-independent translation by internal initiation of mRNAs in cell extracts prepared from Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 14, 7322-7330 (1994).
  20. Iizuka, N., Sarnow, P. Translation-competent extracts from Saccharomyces cerevisiae: effects of L-A RNA, 5' cap, and 3' poly(A) tail on translational efficiency of mRNAs. Methods. 11, 353-360 (1997).
  21. Jackson, R. J., Hunt, T. Preparation and use of nuclease-treated rabbit reticulocyte lysates for the translation of eukaryotic messenger RNA. Methods in Enzymology. 96, 50-74 (1983).
  22. Sachs, M. S., et al. Toeprint analysis of the positioning of translation apparatus components at initiation and termination codons of fungal mRNAs. Methods. 26, 105-114 (2002).
  23. Tarun, S. Z., Sachs, A. B. A common function for mRNA 5' and 3' ends in translation initiation in yeast. Genes and Development. 9, 2997-3007 (1995).
  24. Wang, Z., Sachs, M. S. Ribosome stalling is responsible for arginine-specific translational attenuation in Neurospora crassa. Molecular and Cellular Biology. 17, 4904-4913 (1997).
  25. Wang, Z., Sachs, M. S. Arginine-specific regulation mediated by the Neurospora crassa arg-2 upstream open reading frame in a homologous, cell-free in vitro translation system. Journal of Biological Chemistry. 272, 255-261 (1997).
  26. Fedyukina, D. V., Cavagnero, S. Protein folding at the exit tunnel. Annual Review of Biophysics. 40, 337-359 (2011).
  27. Jha, S., Komar, A. A. Birth, life and death of nascent polypeptide chains. Biotechnology Journal. 6, 623-640 (2011).
  28. Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2, 24 (2019).
  29. Zhovmer, A., Qu, X. Proximal disruptor aided ligation (ProDAL) of kilobase-long RNAs. RNA Biology. 13, 613-621 (2016).
  30. Wu, C., Sachs, M. S. Preparation of a Saccharomyces cerevisiae cell-free extract for in vitro translation. Methods in Enzymology. 539, 17-28 (2014).
  31. Zhao, R., Rueda, D. RNA folding dynamics by single-molecule fluorescence resonance energy transfer. Methods. 49, 112-117 (2009).
  32. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).
  33. Deindl, S., Zhuang, X. Monitoring conformational dynamics with single-molecule fluorescence energy transfer: applications in nucleosome remodeling. Methods in Enzymology. 513, 59-86 (2012).
  34. Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. L. DNA curtains for high-throughput single-molecule optical imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).
  35. Gaba, A., Wang, Z., Krishnamoorthy, T., Hinnebusch, A. G., Sachs, M. S. Physical evidence for distinct mechanisms of translational control by upstream open reading frames. The EMBO Journal. 20, 6453-6463 (2001).
  36. Schaffer, B., Grogger, W., Kothleitner, G. Automated spatial drift correction for EFTEM image series. Ultramicroscopy. 102, 27-36 (2004).
  37. Wang, Y., et al. Localization events-based sample drift correction for localization microscopy with redundant cross-correlation algorithm. Optics Express. 22, 15982-15991 (2014).
  38. Sugar, J. D., Cummings, A. W., Jacobs, B. W., Robinson, B. D. A free Matlab script for spacial drift correction. Microscopy Today. 22, 40-47 (2014).
  39. Chenouard, N., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nature Methods. 11, 281-289 (2014).
  40. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
  41. Chung, S. H., Kennedy, R. A. Forward-backward non-linear filtering technique for extracting small biological signals from noise. Journal of Neuroscience Methods. 40, 71-86 (1991).
  42. Ensign, D. L., Pande, V. S. Bayesian detection of intensity changes in single molecule and molecular dynamics trajectories. Journal of Physical Chemistry B. 114, 280-292 (2010).
  43. Blanco, M., Walter, N. G. Analysis of complex single-molecule FRET time trajectories. Methods in Enzymology. 472, 153-178 (2010).
  44. Shuang, B., et al. Fast step transition and state identification (STaSI) for discrete single-molecule data analysis. The Journal of Physical Chemistry Letters. 5, 3157-3161 (2014).
  45. White, D. S., Goldschen-Ohm, M. P., Goldsmith, R. H., Chanda, B. Top-down machine learning approach for high-throughput single-molecule analysis. Elife. 9, 53357 (2020).
  46. Vassilenko, K. S., Alekhina, O. M., Dmitriev, S. E., Shatsky, I. N., Spirin, A. S. Unidirectional constant rate motion of the ribosomal scanning particle during eukaryotic translation initiation. Nucleic Acids Research. 39, 5555-5567 (2011).
  47. Zheng, Q., et al. Ultra-stable organic fluorophores for single-molecule research. Chemical Society Review. 43, 1044-1056 (2014).
  48. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).
  49. Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82, 6132-6138 (2010).
  50. Berthelot, K., Muldoon, M., Rajkowitsch, L., Hughes, J., McCarthy, J. E. Dynamics and processivity of 40S ribosome scanning on mRNA in yeast. Molecular Microbiology. 51, 987-1001 (2004).

Tags

Biokjemi utgave 163 cellefri eukaryotisk oversettelse single-molekyl oversettelse kinetikk in vitro fluorescensavbildning cap-avhengig initiering translasjonskontroll in vitro analyse
En <em>In Vitro</em> single-molecule imaging assay for analyse av cap-avhengig oversettelse kinetikk
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gaba, A., Wang, H., Qu, X. An In … More

Gaba, A., Wang, H., Qu, X. An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics. J. Vis. Exp. (163), e61648, doi:10.3791/61648 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter