Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

गोजातीय डिम्बग्रंथि प्रांतस्था ऊतक संस्कृति

Published: January 14, 2021 doi: 10.3791/61668
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1
1Department of Animal Science, University of Nebraska-Lincoln, 2Department of Animal Production, School of Agriculture, University of Jordan
* These authors contributed equally

Summary

गोजातीय डिम्बग्रंथि प्रांतस्था के इन विट्रो संस्कृति और डिम्बग्रंथि माइक्रोएन्वायरमेंट पर पोषण सीढ़ी-चरण आहार का प्रभाव प्रस्तुत किया गया है। डिम्बग्रंथि प्रांतस्था के टुकड़ों को सात दिनों के लिए सुसंस्कृत किया गया था और स्टेरॉयड, साइटोकिन्स और कूप चरणों का मूल्यांकन किया गया था। सीढ़ी-कदम आहार उपचार ने स्टेरॉयडोजेनेसिस में वृद्धि की थी जिसके परिणामस्वरूप संस्कृति में कूप प्रगति हुई थी।

Abstract

आदिम से एंट्रल चरण तक कूप विकास डिम्बग्रंथि प्रांतस्था के भीतर एक गतिशील प्रक्रिया है, जिसमें दैहिक कोशिकाओं और क्यूमुलस सेल-ओसाइट संचार से अंतःस्रावी और पैराक्राइन कारक शामिल हैं। डिम्बग्रंथि माइक्रोएन्वायरमेंट के बारे में बहुत कम जाना जाता है और आसपास के परिवेश में उत्पादित साइटोकिन्स और स्टेरॉयड कूप प्रगति या गिरफ्तारी को कैसे प्रभावित करते हैं। डिम्बग्रंथि प्रांतस्था की इन विट्रो संस्कृति रोम को एक सामान्यीकृत वातावरण में विकसित करने में सक्षम बनाती है जो आसन्न स्ट्रोमा द्वारा समर्थित रहती है। हमारा उद्देश्य बोवाइन डिम्बग्रंथि प्रांतस्था के इन विट्रो संस्कृति के माध्यम से डिम्बग्रंथि माइक्रोएन्वायरमेंट (कूप विकास, स्टेरॉयड, और साइटोकाइन उत्पादन) पर पोषण संबंधी सीढ़ी-चरण आहार के प्रभाव को निर्धारित करना था। इसे पूरा करने के लिए, डिम्बग्रंथि कॉर्टिकल टुकड़ों को यौवन से पहले दो अलग-अलग पोषण संबंधी रूप से विकसित योजनाओं से गुजरने वाले बछड़ों से हटा दिया गया था: नियंत्रण (पारंपरिक पोषण विकास) और सीढ़ी-चरण (विकास के दौरान खिलाने और प्रतिबंध) जो लगभग 0.5-1 मिमी3 टुकड़ों में काट दिए गए थे। इन टुकड़ों को बाद में धोने की एक श्रृंखला के माध्यम से पारित किया गया था और एक ऊतक संस्कृति सम्मिलित पर तैनात किया गया था जो वेमाउथ के संस्कृति माध्यम से युक्त एक अच्छी तरह से सेट किया गया है। डिम्बग्रंथि प्रांतस्था दैनिक संस्कृति मीडिया परिवर्तन के साथ 7 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया गया था। हिस्टोलॉजिकल सेक्शनिंग को अतिरिक्त उपचार के बिना पोषण और संस्कृति के प्रभाव के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए संस्कृति से पहले और बाद में कूप चरण परिवर्तनों को निर्धारित करने के लिए किया गया था। कॉर्टेक्स संस्कृति माध्यम को स्टेरॉयड, स्टेरॉयड मेटाबोलाइट्स और साइटोकिन्स को मापने के लिए दिनों में पूल किया गया था। डिम्बग्रंथि माइक्रोएन्वायरमेंट में स्टेरॉयड हार्मोन में वृद्धि के लिए प्रवृत्तियां थीं जो सीढ़ी-चरण बनाम नियंत्रण डिम्बग्रंथि प्रांतस्था संस्कृतियों में कूप प्रगति के लिए अनुमति देती थीं। डिम्बग्रंथि प्रांतस्था संस्कृति तकनीक डिम्बग्रंथि माइक्रोएन्वायरमेंट की बेहतर समझ के लिए अनुमति देती है, और अंतःस्रावी स्राव में परिवर्तन विवो और इन विट्रो उपचार दोनों से कूप प्रगति और विकास को कैसे प्रभावित कर सकता है। यह संस्कृति विधि संभावित चिकित्सीय परीक्षण के लिए भी फायदेमंद साबित हो सकती है जो प्रजनन क्षमता को बढ़ावा देने के लिए महिलाओं में कूप प्रगति में सुधार कर सकती है।

Introduction

डिम्बग्रंथि प्रांतस्था अंडाशय की बाहरी परत का प्रतिनिधित्व करता है जहां कूप विकास होता है1. प्रारंभिक follicles, शुरू में विकास में गिरफ्तार किया गया, प्राथमिक, माध्यमिक बनने के लिए सक्रिय किया जाएगा, और फिर पैराक्राइन और गोनाडोट्रोपिन इनपुट1,2,3,4के आधार पर एंट्रल या तृतीयक follicles। अंडाशय के भीतर शारीरिक प्रक्रियाओं को बेहतर ढंग से समझने के लिए, ऊतक संस्कृति को इन विट्रो मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, जिससे एक नियंत्रित वातावरण को प्रयोगों का संचालन करने की अनुमति मिलती है। कई अध्ययनों ने सहायक प्रजनन प्रौद्योगिकी, प्रजनन संरक्षण और डिम्बग्रंथि के कैंसर5,6,7में अनुसंधान के लिए डिम्बग्रंथि ऊतक संस्कृति का उपयोग किया है। डिम्बग्रंथि ऊतक संस्कृति ने प्रजनन विषाक्त पदार्थों की जांच के लिए एक मॉडल के रूप में भी कार्य किया है जो डिम्बग्रंथि के स्वास्थ्य और प्रजनन विकारों के एटियलजि को नुकसान पहुंचाते हैं जैसे कि पॉलीसिस्टिक अंडाशय सिंड्रोम (पीसीओएस)8,9,10,11। इस प्रकार, यह संस्कृति प्रणाली विशिष्टताओं की एक विस्तृत सरणी पर लागू होती है।

कृन्तकों में, पूरे भ्रूण या प्रसवकालीन गोनाड्स का उपयोग प्रजनन जीव विज्ञान प्रयोगों में किया गया है12,13,14,15। हालांकि, बड़े घरेलू पशुधन से गोनाड्स को उनके बड़े आकार और संभावित अध: पतन के कारण पूरे अंगों के रूप में सुसंस्कृत नहीं किया जा सकता है। इसलिए, गोजातीय, और गैर-मानव प्राइमेट डिम्बग्रंथि प्रांतस्था को छोटे टुकड़ों में काटा जाता है16,17,18। कई अध्ययनों ने घरेलू पशुधन और गैर-मानव प्राइमेट्स1, 17, 18, 19में आदिम कूप दीक्षा में विभिन्न विकास कारकों(ओं)का अध्ययन करने के लिए छोटे डिम्बग्रंथि प्रांतस्था के टुकड़ों को सुसंस्कृत किया है। डिम्बग्रंथि कॉर्टेक्स संस्कृति के उपयोग ने 7दिनोंके लिए सुसंस्कृत गोजातीय और प्राइमेट कॉर्टिकल टुकड़ों के लिए सीरम की अनुपस्थिति में आदिम कूप दीक्षा का भी प्रदर्शन किया है। 2006 में यांग और फॉर्च्यून ने 10 दिनों में टेस्टोस्टेरोन खुराक की एक श्रृंखला के साथ भ्रूण डिम्बग्रंथि प्रांतस्था संस्कृति माध्यम का इलाज किया और देखा कि टेस्टोस्टेरोन की 10-7 एम एकाग्रता ने कूप भर्ती, अस्तित्व और प्रारंभिक चरण के रोमकीप्रगति में वृद्धि की। 2007 में, गोजातीय भ्रूण (गर्भावस्था के 5-8 महीने) से डिम्बग्रंथि प्रांतस्था संस्कृतियों का उपयोग करते हुए, यांग और फॉर्च्यून ने प्राथमिक से माध्यमिक कूप संक्रमण21में संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर ए (वीईजीएफए) के लिए एक भूमिका की सूचना दी। इसके अलावा, हमारी प्रयोगशाला ने डिम्बग्रंथि प्रांतस्था संस्कृतियों का उपयोग यह प्रदर्शित करने के लिए किया है कि वीईजीएफए आइसोफोर्म (एंजियोजेनिक, एंटीएंजियोजेनिक, और एक संयोजन) काइनेज डोमेन रिसेप्टर (केडीआर) के माध्यम से विभिन्न सिग्नल ट्रांसडक्शन मार्गों को विनियमित कर सकते हैं, जो मुख्य सिग्नल ट्रांसडक्शन रिसेप्टर है जो वीईजीएफए16को बांधता है। इस जानकारी ने बेहतर समझ के लिए अनुमति दी कि कैसे विभिन्न वीईजीएफए आइसोफोर्म कूप प्रगति या गिरफ्तारी को प्राप्त करने के लिए सिग्नलिंग मार्गों को प्रभावित करते हैं। एक साथ लिया, विभिन्न स्टेरॉयड या विकास कारकों के साथ विट्रो में डिम्बग्रंथि प्रांतस्था टुकड़ों की culturing एक मूल्यवान परख folliculogenesis को विनियमित तंत्र पर प्रभाव निर्धारित करने के लिए हो सकता है. इसी तरह, विभिन्न पोषण संबंधी शासनों पर विकसित किए गए जानवरों में डिम्बग्रंथि माइक्रोएन्वायरमेंट्स को बदल दिया जा सकता है, जो महिला प्रजनन परिपक्वता को प्रभावित करने वाले फोलिकुलोजेनेसिस को बढ़ावा दे सकता है या बाधित कर सकता है। इस प्रकार, वर्तमान पांडुलिपि में हमारा लक्ष्य गोजातीय प्रांतस्था संस्कृति तकनीक की रिपोर्ट करना है और यह निर्धारित करना है कि क्या हेफ़र्स से गोजातीय प्रांतस्था की इन विट्रो संस्कृति के बाद डिम्बग्रंथि माइक्रोएन्वायरमेंट में अंतर हैं या तो नियंत्रण या सीढ़ी-चरण आहार 13 महीने की उम्र में एकत्र किए गए हैं जैसा कि पहले16 वर्णितहै।

इसलिए, हमारा अगला कदम इन heifers है कि विभिन्न पोषण आहार के साथ विकसित किए गए थे में डिम्बग्रंथि माइक्रोएन्वायरमेंट निर्धारित करने के लिए किया गया था। हमने हाइफर्स से डिम्बग्रंथि प्रांतस्था का मूल्यांकन किया, जिसे या तो सीढ़ी-चरण या नियंत्रण आहार के साथ खिलाया गया था। नियंत्रण heifers 84 दिनों के लिए 97.9 ग्राम / किग्रा0.75 के रखरखाव आहार की पेशकश की गई थी। सीढ़ी-चरण आहार 8 महीने में शुरू किया गया था जिसमें 84 दिनों के लिए 67.4 ग्राम / किग्रा0.75 का प्रतिबंधित खिलाया गया आहार शामिल था। पहले 84 दिनों के बाद, जबकि कंट्रोल हेफ़र्स को 97.9 ग्राम / किग्रा0.75प्राप्त करना जारी रहा, सीढ़ी-चरण गोमांस हेफर्स को एक और 68 दिनों के लिए 118.9 ग्राम / किग्रा0.75 की पेशकश की गई, जिसके बाद उन्हें संस्कृति से पहले और बाद में कूपिक चरणों और आकृति विज्ञान में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए16 साल की उम्र में 13 महीने की उम्र में अंडाशय किया गया था। हम भी स्टेरॉयड, स्टेरॉयड चयापचयों, केमोकाइन्स, और साइटोकिन्स प्रांतस्था मीडिया में स्रावित में अंतर के लिए परख. स्टेरॉयड और अन्य चयापचयों को यह निर्धारित करने के लिए मापा गया था कि क्या ऊतक व्यवहार्यता और उत्पादकता पर विवो और / या इन विट्रो में किए गए उपचारों से कोई प्रत्यक्ष प्रभाव था। संस्कृति से पहले और बाद में डिम्बग्रंथि माइक्रोएन्वायरमेंट में परिवर्तन ने संस्कृति से पहले अंतःस्रावी परिवेश और फोलिकुलोजेनेसिस का एक स्नैपशॉट प्रदान किया और संस्कृति के दौरान संस्कृति या उपचार कूप प्रगति या गिरफ्तारी को कैसे प्रभावित करता है।

अंडाशय को16साल की उम्र में नियंत्रण और सीढ़ी-चरण heifers से अपने IACUC प्रक्रियाओं के अनुसार यूएस मीट एनिमल रिसर्च सेंटर (USMARC) में किए जाने के बाद अंडाशय एकत्र किए गए थे, रक्त और अन्य संदूषकों को हटाने के लिए 0.1% एंटीबायोटिक के साथ बाँझ फॉस्फेट बफर लवणीय (पीबीएस) धोने के साथ साफ किया गया था, अतिरिक्त ऊतक को छंटनी की गई थी, और नेब्रास्का-लिंकन विश्वविद्यालय (यूएनएल) प्रजनन फिजियोलॉजी प्रयोगशाला यूएनएल में 37 डिग्री सेल्सियस23 पर ले जाया गया था। . UNL में, डिम्बग्रंथि प्रांतस्था के टुकड़ों को छोटे वर्ग टुकड़ों में काटा गया था (~ 0.5-1 मिमी3; चित्र 1) और 7 दिनों के लिए सुसंस्कृत(चित्रा 2)। हिस्टोलॉजी को संस्कृति से पहले और बाद में कॉर्टेक्स संस्कृति स्लाइड पर आयोजित किया गया थाताकिरोम चरणों को निर्धारित किया जा सके16,24 (चित्रा 3 और चित्रा 4),और बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स प्रोटीन जो फाइब्रोसिस (पिक्रो-सिरस रेड, पीएसआर) का संकेत दे सकते हैं; चित्रा 5)। इसने कूप चरणों पर विवो पोषण संबंधी शासनों के प्रभाव के निर्धारण की अनुमति दी और कूप चरणों और कूप प्रगति पर डिम्बग्रंथि प्रांतस्था के 7 दिनों की तुलना की अनुमति दी। संस्कृति के दौरान, माध्यम को दैनिक रूप से एकत्र और बदल दिया गया था (लगभग 70% मीडिया प्रत्येक दिन एकत्र किया गया था; 250 μL / अच्छी तरह से) ताकि औसत सांद्रता प्राप्त करने के लिए दिनों में दैनिक हार्मोन / साइटोकिन्स / केमोकाइन्स का मूल्यांकन या पूल किया जा सके। एंड्रोस्टेनेडिओन (ए 4) और एस्ट्रोजन (ई 2) जैसे स्टेरॉयड को 3 दिनों में पूल किया जा सकता है और रेडियोइम्यूनोसे (आरआईए) के माध्यम से मूल्यांकन किया जा सकता है; चित्रा 6) और पशु प्रति 4 दिनों से अधिक pooled और उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (HPLC-एमएस)24, 25 (तालिका 1)के माध्यम से परख के माध्यम से. डिम्बग्रंथि प्रांतस्था संस्कृति माध्यम 26(तालिका2) में साइटोकाइन और केमोकाइन सांद्रता का आकलन करने के लिए साइटोकाइन सरणियों का उपयोग किया गया था। वास्तविक समय पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (आरटी-पीसीआर) परख प्लेटों विशिष्ट संकेत ट्रांसडक्शन मार्गों के लिए जीन अभिव्यक्ति निर्धारित करने के लिए आयोजित किया गया था के रूप में पहले से प्रदर्शित16. स्टेरॉयड, साइटोकाइन, कूप चरण और हिस्टोलॉजिकल मार्करों के सभी डिम्बग्रंथि माइक्रोएन्वायरमेंट और सुराग का एक स्नैपशॉट प्रदान करते हैं कि माइक्रोएन्वायरमेंट की क्षमता के रूप में "सामान्य" या "असामान्य" फोलिकुलोजेनेसिस को बढ़ावा देने के लिए।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

अंडाशय अमेरिकी मांस पशु अनुसंधान केंद्र16से प्राप्त किए गए थे। जैसा कि पहले कहा गया है16,सभी प्रक्रियाओं को अमेरिकी मांस पशु अनुसंधान केंद्र (USMARC) पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा कृषि अनुसंधान और शिक्षण में कृषि जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड के अनुसार अनुमोदित किया गया था। अंडाशय को नेब्रास्का-लिंकन प्रजनन प्रयोगशाला विश्वविद्यालय में लाया गया था जहां उन्हें संसाधित और सुसंस्कृत किया गया था।

1. आवश्यक मीडिया की तैयारी

  1. Waymouth MB 752/1 मध्यम
    1. बाँझ पानी के 900 मिलीलीटर के साथ एक 1 एल ऊतक संस्कृति बोतल भरें। जबकि पानी धीरे-धीरे एक हलचल प्लेट पर सरगर्मी कर रहा है, धीरे-धीरे पाउडर माध्यम जोड़ें। एक बार पाउडर माध्यम भंग हो जाने के बाद, 2.24 ग्राम सोडियम बाइकार्बोनेट जोड़ें, जिसके बाद 1.25 ग्राम गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) होता है। एक पीएच मीटर का उपयोग करें और पीएच को 7.25-7.35 पर समायोजित करें। अंतिम मात्रा को 1 एल तक लाने के लिए अतिरिक्त बाँझ पानी जोड़ें।
    2. एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में जाएं और माध्यम के 0.1% v / v की एकाग्रता पर पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट जोड़ें। एक 0.22 μm ताकना 33.2 सेमी2 500 mL बोतल शीर्ष फिल्टर के साथ माध्यम फ़िल्टर.
    3. फ़िल्टर किए गए माध्यम को कई 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में डालें। एलीकोटेड माध्यम के प्रति 50 मिलीलीटर इंसुलिन-ट्रांसफरिन-सेलेनियम के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें।
    4. एल्यूमीनियम पन्नी में शंक्वाकार ट्यूबों और माध्यम के स्टॉक बोतल लपेटें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। यह माध्यम प्रकाश संवेदनशील है।
      नोट: Waymouth माध्यम अप करने के लिए 1 महीने के लिए संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. Leibovitz के L-15 (LB-15) माध्यम
    नोट: एलबी -15 माध्यम का उपयोग संस्कृति की तैयारी में ऊतक को साफ करने के लिए किया जाता है।
    1. बाँझ पानी के 900 मिलीलीटर के साथ एक 1 एल ऊतक संस्कृति बोतल भरें। जबकि बाँझ पानी धीरे-धीरे एक हलचल प्लेट पर सरगर्मी कर रहा है, धीरे-धीरे तैयार पाउडर माध्यम जोड़ें। एक पीएच मीटर का उपयोग करें और पीएच को 7.25-7.35 पर समायोजित करें। अंतिम मात्रा को 1 एल तक लाने के लिए अतिरिक्त बाँझ पानी जोड़ें।
    2. जैविक सुरक्षा कैबिनेट के लिए ले जाएँ। 0.1% एंटीबायोटिक के साथ LB-15 के 1 एल बनाओ (सामग्री की तालिकादेखें)। एक 0.22 μm ताकना 33.2सेमी 2 500 mL बोतल शीर्ष फिल्टर का उपयोग कर दो 500 mL ऊतक संस्कृति बोतलों में माध्यम फ़िल्टर। एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटें बोतलों के रूप में LB-15 माध्यम प्रकाश संवेदनशील है और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर है।
      नोट: LB-15 माध्यम को 1 महीने तक संग्रहीत किया जा सकता है।
  3. फॉस्फेट बफ़र्ड लवण (PBS)
    1. प्रयोगशाला में पीबीएस बनाएं या कैल्शियम या मैग्नीशियम के बिना बाँझ पीबीएस खरीदें(सामग्री की तालिका)। प्रयोगशाला में पीबीएस बनाने के लिए, आसुत पानी के 800 मिलीलीटर के साथ शुरू करें और इसमें 8 ग्राम सोडियम क्लोराइड (NaCl) जोड़ें। फिर, पोटेशियम क्लोराइड (KCl) के 0.2 ग्राम जोड़ें, सोडियम फॉस्फेट dibasic के 1.44 ग्राम (Na2HPO4),और पोटेशियम फॉस्फेट dibasic के 0.24 ग्राम (KH2PO4). पीएच को ~ 7.4 में समायोजित करें और कुल मात्रा को 1 एल में समायोजित करें।
    2. एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में रहते हुए 0.1% एंटीबायोटिक (सामग्री की तालिकादेखें) के साथ 1 एल पीबीएस बनाएं।

2. डिम्बग्रंथि cortical संस्कृति प्रोटोकॉल

नोट: अंडाशय वसंत में जन्मे USMARC heifers से 13 महीने की उम्र में प्राप्त किए गए थे। अंडाशय को अच्छी तरह से कुल्ला किया गया था, और सभी रक्त और अन्य तरल पदार्थ को एंटीबायोटिक (0.1%) वाले पीबीएस के साथ हटा दिया गया था और 37 डिग्री सेल्सियस23 पर नेब्रास्का-लिंकन प्रजनन प्रयोगशाला यूएनएल विश्वविद्यालय (1.5 घंटे दूर) में ले जाया गया था। (परिवहन के दौरान अंडाशय के तापमान पर टिप्पणियों के लिए कृपया चर्चादेखें)

  1. एक साफ बेंच पर डिम्बग्रंथि ऊतक तैयार करें(चित्रा 1)।
    1. 70% इथेनॉल के साथ साफ बेंच कीटाणुरहित. बेंचटॉप पर एक ताजा अवशोषक पैड रखें। सुनिश्चित करें कि स्वच्छ बेंच ब्लोअर को यूवी प्रकाश के साथ विच्छेदन से आधे घंटे पहले चालू किया जाता है ताकि साफ बेंच में कुछ भी निष्फल किया जा सके, जिसमें शोषक पैड भी शामिल है और सुनिश्चित करें कि उचित पीपीई का उपयोग किया जाता है।
    2. ऊतक धोने के लिए पेट्री व्यंजन (60 x 15 मिमी) की व्यवस्था करें। पीबीएस धोने के लिए तीन पेट्री व्यंजन, एंटीबायोटिक के साथ पीबीएस के लिए तीन और एलबी -15 वॉश के लिए तीन की आवश्यकता होती है। एक अतिरिक्त एलबी -15-युक्त पेट्री डिश के साथ ढक्कन के साथ धोने के बाद टुकड़ों के अंतिम प्लेसमेंट के लिए उपयोग किया जाएगा।
    3. प्रत्येक पेट्री डिश को लगभग 10 मिलीलीटर उपयुक्त तरल पदार्थ के साथ भरें, या तो पीबीएस या एलबी -15।

Figure 1
चित्र1:स्वच्छ बेंच में अंडाशय और कॉर्टेक्स के टुकड़ों को धोने के लिए प्लेटों का लेआउट। (ए)अंडाशय को धोने के लिए उपयोग किए जाने वाले पीबीएस का उपयोग कॉर्टेक्स के वर्गों के रूप में किया जाता है। (बी)एंटीबायोटिक धोता है कि प्रांतस्था के टुकड़ों के माध्यम से ले जाया जाता है के साथ पीबीएस धोता है। डिम्बग्रंथिप्रांतस्था के टुकड़ों को एलबी -15 में अंतिम धोने के लिए जैव सुरक्षा कैबिनेट में जाने से पहले एलबी -15 में चार बार धोया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. 

  1. रेफ्रिजरेटर से तैयार Waymouth और LB-15 माध्यम निकालें और कमरे के तापमान के लिए गर्म करें।
  2. उपयोग करने से पहले नसबंदी सुनिश्चित करने के लिए सभी उपकरणों को आटोक्लेव करें।
  3. 37 डिग्री सेल्सियसपर अंडाशय बनाए रखें जब तक कि डिम्बग्रंथि प्रांतस्था एकत्र करने के लिए तैयार न हो जाए।
  4. दांतेदार जबड़े के साथ संदंश का उपयोग करके, अंडाशय उठाएं और पहले पीबीएस से भरे पेट्री डिश में अच्छी तरह से धो लें। अंडाशय को दूसरे पीबीएस धोने के लिए स्थानांतरित करें और एक बार फिर से अच्छी तरह से शुद्ध करें।
    नोट: अंडाशय दूसरे पीबीएस धोने में रहेगा, जबकि डिम्बग्रंथि cortical स्ट्रिप्स हटा दिए जाते हैं।
  5. दांतेदार जबड़े संदंश का उपयोग करके, अंडाशय को सुरक्षित करें और आधे में स्लाइस करें। इस समय, डिम्बग्रंथि प्रांतस्था मज्जा से दूर काट देगा। एक शासक का उपयोग करते हुए, सुनिश्चित करें कि अंडाशय की सतह की गहराई के 1-2 मिमी से अधिक को मज्जा16से दूर नहीं किया जाता है। मज्जा से डिम्बग्रंथि प्रांतस्था के अनुप्रस्थ वर्गों को हटा दें, डिम्बग्रंथि प्रांतस्था(चित्रा 2)के 3-4 पतले स्ट्रिप्स को एक स्केलपेल (# 11 स्केलपेल ब्लेड; # 3 हैंडल) के साथ काट लें, और स्ट्रिप्स को तीसरे पीबीएस से भरे पेट्री डिश में रखें।
    नोट: इस समय, अतिरिक्त डिम्बग्रंथि कॉर्टिकल ऊतक को आरएनए निष्कर्षण के लिए एकत्र किया जा सकता है या प्रारंभिक गैर-सुसंस्कृत कॉर्टेक्स टुकड़ों के हिस्टोलॉजी के लिए तय और एकत्र किया जा सकता है। डिम्बग्रंथि प्रांतस्था की स्ट्रिप्स को हटाते समय, दृश्यमान एंट्रल रोम या कार्पोरा ल्यूटिया वाले क्षेत्रों से बचें। इसके अलावा, मज्जा ऊतक एकत्र करने से बचें। मज्जा का हिस्टोलॉजी बहुत अलग है जैसा कि पहले दिखाया गया है16. यदि डिम्बग्रंथि प्रांतस्था को 1-2 मिमी की गहराई से अधिक नहीं काटा जाता है, तो मज्जा प्राप्त नहीं किया जाना चाहिए। अलग-अलग हिस्टोलॉजी कॉर्टेक्स और मज्जा के बीच स्थलों के लिए अनुमति देता है।
  6. तीसरे पीबीएस में डिम्बग्रंथि प्रांतस्था स्ट्रिप्स को छोटे, वर्ग टुकड़ों (~ 0.5-1 मिमी3)में # 21 स्केलपेल ब्लेड के साथ धोएं। पेट्री व्यंजनों के नीचे एक शासक का उपयोग करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि टुकड़े लगातार डिम्बग्रंथि प्रांतस्था के टुकड़े बनाने के लिए समान आकार और मोटाई के हैं। एक स्केलपेल के साथ टुकड़ों को काटते समय स्ट्रिप्स को सुरक्षित करने के लिए संदंश का उपयोग करें।
    नोट: कटे हुए ऊतक टुकड़ों की संख्या प्रयोग पर निर्भर करती है। डिम्बग्रंथि प्रांतस्था के चार टुकड़े संस्कृति के लिए आवश्यक ऊतक की न्यूनतम मात्रा है। उपयुक्त लंबाई और गहराई सुनिश्चित करने के लिए अन्य तरीकों में विशेष स्लाइसर26 या प्रीकट प्लास्टिक के टुकड़ों को टेम्पलेट्स27के रूप में उपयोग करना शामिल है।
  7. एंटीबायोटिक से भरे पेट्री व्यंजनों के साथ सभी तीन पीबीएस के माध्यम से डिम्बग्रंथि के कॉर्टिकल टुकड़ों को धोएं। धोने के बीच टुकड़ों को स्थानांतरित करने के लिए एक घुमावदार टिप संदंश का उपयोग करें।
  8. एलबी -15 धोने की श्रृंखला के माध्यम से कॉर्टेक्स टुकड़ों को स्थानांतरित करें और अंतिम एलबी -15-भरे पेट्री डिश में रखें। पशु आईडी और अंडाशय पक्ष (बाएं या दाएं) के साथ ढक्कन लेबल करें।
    नोट: पूरी तरह से सफाई के लिए प्रत्येक धोने में डिम्बग्रंथि प्रांतस्था के टुकड़ों को पूरी तरह से जलमग्न करें।
  9. अंडाशय प्रति चार डिम्बग्रंथि प्रांतस्था टुकड़े ले लीजिए और दिन शून्य histology के लिए तय. अतिरिक्त टुकड़ों को आरएनए के लिए फ्लैश जमे हुए भी किया जा सकता है। शेष ऊतक के टुकड़ों का उपयोग संस्कृति के लिए किया जाएगा। प्रत्येक ऊतक संग्रह के बाद 70% इथेनॉल के साथ विच्छेदन उपकरण ों को पोंछें।
  10. अंतिम ऊतक धोने और संस्कृति की तैयारी के लिए एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट तैयार करें। जैविक सुरक्षा कैबिनेट में रखने से पहले 70% इथेनॉल के साथ आपूर्ति को सैनिटाइज करें। जैविक सुरक्षा कैबिनेट में काम करते समय एसेप्टिक तकनीक का उपयोग करें।
  11. जैविक सुरक्षा कैबिनेट के लिए संस्कृति के लिए इरादा सभी डिम्बग्रंथि प्रांतस्था ले जाएँ और एक एलबी -15 से भरे पेट्री डिश में एक बार फिर से धोएं।
  12. एक 24-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट में, पिपेट 350 μL प्रति अच्छी तरह से Waymouth माध्यम के।
  13. संदंश का उपयोग करके प्रत्येक कुएं में अच्छी तरह से अनकोटेड संस्कृति को अच्छी तरह से सम्मिलित करें। सुनिश्चित करें कि सम्मिलित करने के आधार के नीचे कोई बुलबुले नहीं बनते हैं क्योंकि इसके परिणामस्वरूप ऊतक सूख जाएगा। माध्यम को आवेषण को छूना चाहिए ताकि माध्यम को अवशोषित किया जा सके और डिम्बग्रंथि प्रांतस्था के टुकड़ों को घेर लिया जा सके।
  14. प्रत्येक सम्मिलित करें(चित्रा 2)के जाल पर चार डिम्बग्रंथि प्रांतस्था के टुकड़ों को सावधानीपूर्वक रखें। संदंश जाल पंचर कर सकते हैं यदि ऊतक के टुकड़े नाजुक रूप से नहीं रखे जाते हैं। ऊतक के टुकड़े एक दूसरे या सम्मिलित करने के पक्ष को छूना नहीं चाहिए।
  15. 5% CO216के साथ ऊतक को 37 °C पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: दूसरों ने 38.8 °C28का उपयोग किया है। हालांकि, ऊतक की अखंडता में और न ही 37 डिग्री सेल्सियसऊतक में प्रगति करने के लिए रोम की क्षमता में कोई अंतर नहीं देखा गया है और न ही अन्य39,30हैं। इस प्रकार, इस बिंदु पर इनमें से कोई भी तापमान प्रयोग की सफलता के लिए अनुकूल होना चाहिए। दूसरों ने माध्यम के 400 μL का उपयोग किया है। या तो राशि तब तक ठीक है जब तक कि कोई सुसंगत है, और ऊतक आंशिक रूप से जलमग्न है जो ऊतक के जलयोजन (डिम्बग्रंथि प्रांतस्था के टुकड़ों के आसपास के मीडिया) के लिए अनुमति देने के लिए पर्याप्त सतह तनाव की अनुमति देता है। अन्य कुओं से वाष्पीकरण को कम करने में मदद करने के लिए बाँझ पानी के 500 μL के साथ खाली कुओं को भरें।

Figure 2
चित्र 2:डिम्बग्रंथि प्रांतस्था के टुकड़े और संस्कृति प्लेट। (ए)अंडाशय के प्रांतस्था से एक डिम्बग्रंथि पट्टी काटी जा रही है। (बी)शासक और प्रांतस्था टुकड़ा साथ-साथ दिखाया गया है। (सी)चार प्रांतस्था टुकड़े (~ 0.5-1 मिमी3)प्लेट में संस्कृति माध्यम में डालने पर आराम करते हैं। (डी)कुएं से संस्कृति माध्यम को इकट्ठा करने के लिए सम्मिलित उठाना। उचित pH.लगभग 250 μL प्रत्येक दिन (प्रारंभिक संस्कृति माध्यम का लगभग 70%) को बनाए रखने के लिए सभी संस्कृति माध्यमों को दैनिक (250 μL) एकत्र करें और प्रतिस्थापित करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

3. मीडिया संग्रह

  1. 7 दिनों के लिए दैनिक डिम्बग्रंथि प्रांतस्था संस्कृति माध्यम बदलें। मध्यम परिवर्तन मध्यम में बड़े पीएच और रंग परिवर्तन को रोकने के लिए जितना संभव हो उतना 24 घंटे के करीब होना चाहिए। मध्यम परिवर्तन से पहले 37 डिग्री सेल्सियस के लिए गर्म Waymouth माध्यम। लगभग 250 μL प्रत्येक दिन प्रत्येक अच्छी तरह से प्राप्त किया जाता है (प्रारंभिक संस्कृति माध्यम का लगभग 70%)।
  2. मध्यम परिवर्तनों के दौरान, अच्छी तरह से डालने को धीरे से उठाने के लिए संदंश का उपयोग करें। 0.5 mL ट्यूबों (लगभग 250 μL / दिन) में सुसंस्कृत Waymouth माध्यम ले लीजिए। अच्छी तरह से में वापस डालने सेट करें और सम्मिलित करें और अच्छी तरह से के पक्ष के बीच माध्यम को वितरित करके ताजा संस्कृति माध्यम के 350 μL जोड़ें।
    नोट: डिम्बग्रंथि माइक्रोएन्वायरमेंट निर्धारित करने के लिए आवश्यक सभी स्टेरॉयड, साइटोकिन्स और केमोकाइन्स को मापने के लिए पर्याप्त मीडिया प्राप्त करने के लिए दैनिक मीडिया के अधिकांश बदलें। इसके अलावा, दैनिक मध्यम परिवर्तन माध्यम में बड़े पीएच परिवर्तनों (रंग परिवर्तन द्वारा इंगित) को रोकने के लिए महत्वपूर्ण हैं। माध्यम की बूंदों को डिम्बग्रंथि प्रांतस्था के टुकड़ों के आसपास बनाए रखा गया था ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि टुकड़े गीले रहें। मीडिया के 70% को बदलने के कारण सुसंस्कृत ऊतक के साथ कोई समस्या नहीं देखी गई थी।
  3. -20 डिग्री सेल्सियसपर ऊतक संस्कृति से एकत्र माध्यम को स्टोर करें।

4. इमेजिंग और डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण

  1. 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियसपर संस्कृति के7दिनों के बाद, एक संलग्न कैमरे और कंप्यूटर इमेजिंग सॉफ्टवेयर प्रोग्राम के साथ एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके डिम्बग्रंथि प्रांतस्था के टुकड़ों की छवि।
    नोट: इमेजिंग के लिए सबसे अच्छी तस्वीर की गुणवत्ता प्राप्त करने के लिए एक अंधेरा कमरा आमतौर पर सबसे अच्छा होता है।
  2. इमेजिंग के बाद, हिस्टोलॉजी के लिए बोइन्स में अच्छी तरह से दो डिम्बग्रंथि प्रांतस्था के टुकड़े तय करें और सीडीएनए के लिए आरएनए प्राप्त करने के लिए तरल नाइट्रोजन में दो डिम्बग्रंथि प्रांतस्था के टुकड़ों को फ्लैश फ्रीज करें। ऊतक के साथ सभी कुओं के लिए इस चरण को दोहराएं। दिन 7 से माध्यम ले लीजिए और -20 डिग्री सेल्सियसपर स्टोर करें।
  3. डिम्बग्रंथि प्रांतस्था के टुकड़े Bouins (पिक्रिक एसिड 750 mL, ग्लेशियल एसिटिक एसिड 50 mL, और 37% -40% formalin 250 mL) में डूबे रहने दें, लगभग 1.5 घंटे के लिए 70% इथेनॉल के साथ तीन बार धोया जा रहा है। ऊतक 70% इथेनॉल में रहेगा और जब तक समाधान अब पीला नहीं है तब तक दैनिक रूप से साफ हो जाएगा।
    नोट: Bouins के अलावा अन्य fixatives के रूप में अच्छी तरह से paraformaldehyde इस्तेमाल किया जा सकता है. इस अनुभव में Bouins का उपयोग किया जाता है क्योंकि यह इष्टतम आकृति विज्ञान प्राप्त करने के लिए फिक्सेटिव है। यदि अन्य विश्लेषण के लिए अधिक ऊतक की आवश्यकता होती है, तो प्रत्येक जानवर से मीडिया के अतिरिक्त कुएं और डिम्बग्रंथि प्रांतस्था के टुकड़े प्राप्त किए जा सकते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

इस गोजातीय प्रांतस्था संस्कृति प्रक्रिया का उपयोग अंडाशय के छोटे टुकड़ों से हार्मोन, साइटोकाइन और हिस्टोलॉजी डेटा की एक विस्तृत विविधता को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। धुंधला, जैसे कि हेमाटोक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई), का उपयोग कूप स्टेजिंग16,23, 31 (चित्रा3) के माध्यम से डिम्बग्रंथि आकृति विज्ञान को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। संक्षेप में, रोम को आदिम के रूप में वर्गीकृत किया गया था, जो स्क्वैमस प्री-ग्रैनुलोसा कोशिकाओं (0) की एक परत से घिरा एक ओसाइट है; संक्रमणकालीन कूप या प्रारंभिक प्राथमिक, जो ज्यादातर स्क्वैमस प्री-ग्रैनुलोसा कोशिकाओं और कुछ घनाभ ग्रैनुलोसा कोशिकाओं (1) से घिरा एक ओसाइट है; प्राथमिक कूप, जो घनाभ ग्रैनुलोसा कोशिकाओं की 1-1.5 परतों से घिरा हुआ एक ओसाइट है (2); द्वितीयक कूप, जो दो या दो से अधिक घनाभ ग्रैनुलोसा कोशिकाओं (3) से घिरा एक ओसाइट है; एंट्रल कूप, जो व्यास में 1 मिमी से बड़ा नहीं है और ग्रैनुलोसा कोशिकाओं की दो या दो से अधिक परतों से घिरा हुआ है जिसमें एक अलग एंट्रम (4)16,23(चित्रा 3)होता है। कूप मंचन डिम्बग्रंथि प्रांतस्था पर आयोजित किया जा सकता है जो फोलिकुलोजेनेसिस का आकलन करने के लिए संस्कृति से पहले और निम्नलिखित से पहले और निम्नलिखित है(चित्रा 4)। हमने एच एंड ई के साथ दागे गए तीन अलग-अलग स्लाइड्स से प्रति स्लाइड तीन छवियां लीं। फिर, रोम का मंचन किया गया और तीन व्यक्तियों द्वारा गिना गया और प्रत्येक चरण16,23पर रोम की संख्या निर्धारित करने के लिए औसत किया गया। 400x आवर्धन पर एक छवि (तीन प्रति स्लाइड) के लिए दृश्य के क्षेत्र का क्षेत्रफल 0.4mm2है। इस प्रकार, डिम्बग्रंथि प्रांतस्था के टुकड़ों के क्षेत्र का 30% कूप चरणों को निर्धारित करने के लिए गिना गया था। प्रारंभिक कूपसंख्या (संस्कृति से पहले) (चित्रा4 ए)का उपयोग संस्कृति के बाद गिने जाने वाले रोम को सामान्य करने के लिए किया जाता है(चित्रा 4 बी)।

इसके अतिरिक्त, कोलेजन जमाव (पिक्रो सिरस रेड स्टेनिंग) द्वारा निर्धारित आकृति विज्ञान में अंतर सीढ़ी कदम या नियंत्रण हेफ़र्स(चित्रा 5)से डिम्बग्रंथि प्रांतस्था में फाइब्रोसिस का संकेत दे सकता है। संस्कृति माध्यम के दैनिक संग्रह को आरआईए द्वारा विभिन्न स्टेरॉयड हार्मोन उत्पादन का आकलन करने के लिए 3 दिनों में पूल किया जा सकता है (प्रति जानवर 200 μL मध्यम नमूने का उपयोग करके); चित्रा 6) या स्टेरॉयड मेटाबोलाइट्स उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (HPLC-MS; 220 μL मध्यम नमूना प्रति पशु 4 दिनों में pooled) का उपयोग कर; तालिका 1) और साइटोकाइन उत्पादन(तालिका 2)। इसलिए, सभी वांछित assays प्रदर्शन करने के लिए पर्याप्त प्रांतस्था माध्यम सुनिश्चित करने के लिए एक जानवर की कई प्रतिकृतियों की आवश्यकता हो सकती है।

क्योंकि सीढ़ी-कदम heifers संस्कृति की शुरुआत में आदिम follicles में वृद्धि हुई है हम इन संस्कृति में प्रगति करने के लिए और माध्यमिक follicles, जो हम परिणामों में देखा की अधिक से अधिक संख्या में प्राप्त करने की उम्मीद की है। इसके अलावा, माध्यमिक follicles में वृद्धि के कारण, हम स्टेरॉयड की अधिक सांद्रता की उम्मीद करेंगे। हमने एण्ड्रोजन, ग्लूकोकॉर्टिकोइड मेटाबोलाइट्स और प्रोजेस्टेरोन मेटाबोलाइट्स में वृद्धि की प्रवृत्ति देखी, जो वर्तमान पांडुलिपि में इसका समर्थन करेगी। हमारी प्रयोगशाला ने कूप प्रगति, स्टेरॉयडोजेनेसिस, और केडीआर में विभिन्न सिग्नल ट्रांसडक्शन अणुओं के सक्रियण पर विभिन्न वीईजीएफए आइसोफोर्मों के प्रभावों का भी मूल्यांकन किया है (जिसे संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर 2 के रूप में भी जाना जाता है); VEGFR2) सिग्नल ट्रांसडक्शन सरणी प्लेटों का उपयोग कर16| पशु भिन्नता को कम करने के लिए, हम प्रति उपचार 4-6 जानवरों का उपयोग करते हैं और शक्ति विश्लेषण और परिवर्तनशीलता के आधार पर अन्य प्रयोगों के लिए हमने 11 के रूप में कई का उपयोग किया है।

गोजातीय डिम्बग्रंथि प्रांतस्था संस्कृति से परिणामों की पुनरावृत्ति डिम्बग्रंथि प्रांतस्था के टुकड़ों के संदूषण से सबसे अधिक प्रभावित होती है। इसके अतिरिक्त, नकारात्मक, या subpar परिणाम हो सकता है यदि माध्यम नियमित रूप से 24-h अवधि के भीतर परिवर्तित नहीं किया जाता है। मूल रूप से जोड़ा जाने वाला माध्यम रंग में गुलाबी होता है, लेकिन जब माध्यम एकत्र किया जाता है, और रंग नारंगी या उज्ज्वल पीला दिखाई देता है तो यह पीएच में बदलाव का संकेत दे सकता है जो ऊतक के लिए हानिकारक हो सकता है। इसके अलावा, ऊतक के टुकड़े जो बहुत बड़े कटे हुए हैं, वे बीच में अध: पतन विकसित कर सकते हैं जो हिस्टोलॉजी के लिए ऊतक सेक्शनिंग तक नहीं देखे जाएंगे। यह अध: पतन विश्लेषण के लिए ऊतक के उपयोग को सीमित करेगा। इस पेपर में प्रस्तुत डेटा का विश्लेषण सांख्यिकीय सॉफ़्टवेयर प्रोग्राम में गैर-पैरामीट्रिक परीक्षणों और एक सामान्य रैखिक मॉडल विश्लेषण का उपयोग करके किया गया है। संस्कृति से पहले और बाद में प्रति अनुभाग आदिम, प्राथमिक, माध्यमिक और एंट्रल रोम की संख्या का विश्लेषण एक सामान्यीकृत रैखिक मिश्रित मॉडल का उपयोग करके किया गया था। महत्व पी < 0.05 पर निर्धारित किया गया था और 0.14 ≤ पी ≥ 0.05 पर एक प्रवृत्ति की सूचना दी गई थी।

Figure 3
चित्रा 3:डिम्बग्रंथि प्रांतस्था के कूप मंचन के लिए Hematoxylin और Eosin धुंधला. रोम के विभिन्न चरणों को तीर द्वारा इंगित किया जाता है। (ए)आदिम रोम (चरण 0); (बी)प्रारंभिक प्राथमिक रोम (चरण 1); (सी)प्राथमिक रोम (चरण 2); (डी)माध्यमिक कूप (चरण 3); (ई) एंट्रल कूप (चरण 4)। 400x आवर्धन पर एक छवि के लिए दृश्य के क्षेत्र का क्षेत्रफल 0.4 मिमी2है। हम कूप चरणों को निर्धारित करने के लिए डिम्बग्रंथि प्रांतस्था के टुकड़ों के क्षेत्र का 30% गिनती करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4:नियंत्रण (n = 6) और सीढ़ी-चरण (n = 6) heifers में विभिन्न कूपिक चरणों में follicles की औसत संख्या ( A) संस्कृति से पहले आदिम P = 0.001, प्रारंभिक प्राथमिक P = 0.12, प्राथमिक P = 0.31, माध्यमिक P = 0.22 संस्कृतिके 7 दिनों के बाद, आदिम P = 0.37, प्रारंभिक प्राथमिक P = 0.84, प्राथमिक P = 0.69, द्वितीयक P = 0.02। त्रुटि पट्टियाँ SEM के प्रतिनिधि हैं। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5:कोलेजन (पिक्रो सिरियस रेड; पीएसआर) डिम्बग्रंथि प्रांतस्था में धुंधला। PSR में(ए)नियंत्रण और सीढ़ी कदम heifers दिन 0 और दिन 7 से. (बी)नियंत्रण (एन = 4) और सीढ़ी-चरण (एन = 4) बछियों के बीच प्रति डिम्बग्रंथि प्रांतस्था क्षेत्र (पिक्सेल / μm2) प्रति पीएसआर-सकारात्मक धुंधला के औसत क्षेत्र की तुलना में ग्राफ। त्रुटि पट्टियाँ SEM के प्रतिनिधि हैं। 400x आवर्धन पर एक छवि के लिए दृश्य के क्षेत्र का क्षेत्रफल 0.4mm2है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6:A4 और E2 की सांद्रता ( A) A4 की सांद्रता और(B)E2 की सांद्रता नियंत्रण और सीढ़ी-चरण heifers के डिम्बग्रंथि प्रांतस्था मीडिया में संस्कृति के 3 दिनों से अधिक pooled के रूप में RIA द्वारा मापा जाता है। प्रत्येक समूह के लिए n = 4। त्रुटि पट्टियाँ SEM के प्रतिनिधि हैं। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें. 

हार्मोन नियंत्रण सीढ़ी-चरण P-मान 
n 4 4
ng/mL औसत SEM ± औसत SEM ±
डॉक्टर 0.33 0.28 0.72 0.48 0.15
सराय 0.61 0.60 4.93 3.99 0.08
CORT 0.003 0.003 0.01 0.01 0.85
17OHP 0.59 0.53 1.88 0.99 0.08
A4 1.46 1.43 5.74 3.27 0.08
एक  0.15 0.09 0.54 0.32 0.08
DHEAS 4.50 2.60 7.59 0.85 0.56
E2 0.05 0.05 0.13 0.08 0.32
P4 5.05 2.78 6.52 1.66 0.39
T 0.33 0.33 1.33 0.96 0.14
DHT 0.07 0.02 0.01 0.01 0.09
डॉक - 11-डीऑक्सीकॉर्टिकोस्टेरोन, आईएनएन - 11-डीऑक्सीकॉर्टिसोल, कोर्ट - कॉर्टिकोस्टेरोन, 17OHP - 17-Hydroxyprogesterone, A4- Androstenedione, AN – Androsterone, DHEAS – dehydroepiandrosterone सल्फेट, E2 - Estradiol, P4 – प्रोजेस्टेरोन, टी – टेस्टोस्टेरोन, DHT – Dihydrotestosterone

तालिका 1: स्टेरॉयड और स्टेरॉयड मेटाबोलाइट्स डिम्बग्रंथि प्रांतस्था संस्कृति माध्यम में मापा प्रत्येक जानवर के लिए एक अच्छी तरह से संस्कृति के 4 दिनों में pooled के लिए. माध्य ± SEM के साथ प्रस्तुत डेटा। नीला P < 0.1 को इंगित करता है और इसमें अलग होने की प्रवृत्ति होती है।

साइटोकिन्स नियंत्रण सीढ़ी-चरण P-मान
n 4 4
pg/mL औसत SEM ± औसत SEM ±
ANG1 27.29 11.71 63.66 25.06 0.39
CD40L 4527.01 2986.34 3537.59 3537.59 0.74
DCN  1307.68 320.87 996.54 282.96 0.77
INFπ 0.36 0.36 0.002 0.002 0.85
IL18 0.00 0.00 1832.89 1265.33 0.13
LIF  97.45 88.12 337.58 231.25 0.54
RANTES 698.06 322.59 1254.13 811.19 0.56
INFπ 4.49 1.37 3.68 0.65 0.77
IL13 501.21 285.07 810.81 159.67 0.25
IL21 24.38 9.51 18.52 6.17 0.56
IL1F5 5.07 3.85 5.40 1.70 0.56
TNFα 61.45 35.00 44.91 13.41 0.77
ANG1 – एंजियोपोइटिन 1, CD40L – CD40 लिगैंड, DCN – Decorin, IFNπ – इंटरफेरॉन बीटा 1, IL18 – इंटरल्यूकिन -18, LIF – ल्यूकेमिया निरोधात्मक कारखाने, RANTES – सक्रियण पर विनियमित, सामान्य टी सेल व्यक्त और स्रावित, IFNπ – इंटरफेरॉन गामा, IL13 – इंटरल्यूकिन 13, IL21 – इंटरल्यूकिन 21, IL1F5 – इंटरल्यूकिन 1 परिवार के सदस्य 5, TNFα – ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर

तालिका 2: साइटोकाइन और केमोकिन्स डिम्बग्रंथि प्रांतस्था संस्कृति माध्यम में मापा जाता है, जो प्रत्येक जानवर के लिए एक अच्छी तरह से 4 दिनों की संस्कृति में पूल किया जाता है। माध्य ± SEM के साथ प्रस्तुत डेटा। नीला P < 0.1-0.14 को इंगित करता है और इसमें अलग होने की प्रवृत्ति होती है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इन विट्रो डिम्बग्रंथि प्रांतस्था संस्कृति का लाभ, जैसा कि इस पांडुलिपि में वर्णित है, यह है कि रोम रोम के आसपास आसन्न स्ट्रोमा के साथ एक सामान्यीकृत वातावरण में विकसित होते हैं। दैहिक कोशिकाएं और ओसाइट बरकरार रहते हैं, और विवो मॉडल में एक इन-विवो मॉडल के रूप में उपयुक्त सेल-टू-सेल संचार होता है। हमारी प्रयोगशाला ने पाया है कि एक 7-दिवसीय संस्कृति प्रणाली डिम्बग्रंथि प्रांतस्था के उपचार के लिए प्रतिनिधि फोलिकुलोजेनेसिस और स्टेरॉयडोजेनेसिस डेटा प्रदान करती है। अन्य डिम्बग्रंथि ऊतक संस्कृति प्रोटोकॉल में या तो अपेक्षाकृत कम संस्कृति अवधि 1-6 दिन7,32 या 10-15 दिनों की लंबी संस्कृति अवधि5,6,10होती है। हालांकि, हमने देखा है कि 7 दिनों से अधिक समय तक खेती करने से ऊतक क्षरण होता है, स्टेरॉयडोजेनेसिस कम हो जाता है, और संभावित रूप से संदूषण की बढ़ती संभावना होती है (डेटा नहीं दिखाया गया है)। अंडाशय के बाद डिम्बग्रंथि प्रांतस्था की खेती भी उस विशेष जानवर के भीतर डिम्बग्रंथि माइक्रोएन्वायरमेंट में प्रत्यक्ष अंतर्दृष्टि प्रदान करती है। यह हमारी अनुसंधान प्रयोगशाला के लिए रुचि का विषय है क्योंकि हमने पोषाहार संबंधी शासनों को दूध पिलाने के बाद लगाए जाने के बाद कूपिक विकास में परिवर्तन की पहचान की है और बछिया16में यौवन की ओर अग्रसर किया गया है।

आदिम से एंट्रल चरण तक कूप विकास डिम्बग्रंथि प्रांतस्था के भीतर एक गतिशील प्रक्रिया है, जिसमें दैहिक कोशिकाओं और क्यूमुलस सेल-ओसाइट संचार33से अंतःस्रावी और पैराक्राइन कारक शामिल हैं। ऊतक संस्कृति, जैसे डिम्बग्रंथि प्रांतस्था संस्कृति, इन कारकों की यांत्रिक भूमिका और डिम्बग्रंथि माइक्रोएन्वायरमेंट में अंतःस्रावी परिवेश की जांच करने के लिए एक नियंत्रित वातावरण प्रदान करती है। अंडाशय को उन जानवरों से एकत्र किया जा सकता है जो विवो उपचार के माध्यम से चले गए हैं या कूप प्रगति पर प्रभाव निर्धारित करने के लिए आनुवंशिक रूप से बदल दिए गए हैं।

अंडाशय को एक स्थानीय बूचड़खाने (1 घंटे दूर) से भी एकत्र किया जा सकता है और एंटीबायोटिक के साथ पीबीएस युक्त थर्मस में 37 डिग्री सेल्सियस पर ले जाया जा सकता है। यदि परिवहन लंबा है (उदाहरण के लिए, रात भर), अंडाशय को बर्फ22पर भेज दिया जाता है या ले जाया जाता है। इसी तरह के परिणाम देखे गए हैं कि क्या अंडाशय का परिवहन रातभर बर्फ पर होता है या थर्मस में अल्पकालिक परिवहन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर होता है। एक थर्मस परिवहन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इन विट्रो परिपक्वता (आईवीएम) या इन विट्रो निषेचन (आईवीएफ)34के लिए इस ऊतक से ओसाइटों की फसल के लिए अनुमति देता है। अन्य अध्ययनों में पाया गया है कि 2-8 डिग्री सेल्सियस के बीच के तापमान पर ऊतकों के परिवहन का उपयोग प्रजनन ऊतकों35 , 36,37में प्रजनन संरक्षण के लिए भी किया गया है। फिर भी अन्य अध्ययनों ने 34-37 डिग्री सेल्सियस पर और बर्फ पर ले जाए गए अंडाशय का उपयोग किया है और गोजातीय ऊतक संस्कृति में अंतर नहीं देखाहै।

यदि डिम्बग्रंथि प्रांतस्था संस्कृति ऊतक संस्कृति के बाद स्वस्थ नहीं दिखता है, तो यह डिम्बग्रंथि प्रांतस्था के टुकड़ों के बहुत बड़े होने के कारण हो सकता है। प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम यह सुनिश्चित करना है कि डिम्बग्रंथि प्रांतस्था के टुकड़े 0.5-1 मिमी3से बड़े नहीं हैं। हम टुकड़ों को मापने के लिए एक शासक का उपयोग करते हैं और डिम्बग्रंथि प्रांतस्था के टुकड़ों के आकार को निर्धारित करने के लिए विच्छेदन माइक्रोस्कोप के भीतर एक पैमाने का उपयोग करते हैं(चित्रा 2 सी)। अन्य लोग समान मोटाई और लंबाई / चौड़ाई के लिए विशिष्ट उपकरणों (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करते हैं, क्रमशः26। यदि उपकरण के ये टुकड़े उपलब्ध नहीं हैं, तो प्लास्टिक के वर्गों का उपयोग एक समान मोटाई प्राप्त करने और समान आकार के टुकड़ों को सुनिश्चित करने के लिए टेम्पलेट के रूप में किया जा सकताहै।

कटे हुए टुकड़ों को सुनिश्चित करने के लिए जो केवल कॉर्टेक्स से हैं और अंडाशय को धोने के बाद मज्जा नहीं है, हम इसे 60 मिमी डिश में रखते हैं और आधे में काटते हैं। कॉर्टेक्स और मज्जा हिस्टोलॉजिकल रूप से बहुत अलग हैं जैसा कि पहले अबेदल-माजेड, 202016में देखा गया था। अंडाशय के प्रत्येक आधे हिस्से को ब्लेड से भरा जाता है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि अंडाशय से केवल कॉर्टेक्स को हटा दिया जाता है और मज्जा बनी रहती है। यदि व्यक्ति अभी इस काटने की तकनीक को सही करना शुरू कर रहे हैं, तो वे अंडाशय39के प्रत्येक आधे हिस्से के हिस्टोलॉजी को बारीकी से देखने के लिए तटस्थ लाल रंग का भी उपयोग कर सकते हैं। यह उनकी काटने की तकनीक के रूप में स्थलों के विकास के लिए अनुमति देगा, सुधार करता है। इसके अलावा, वे उन उपकरणों का उपयोग कर सकते हैं जो समान मोटाई में कटौती कर सकते हैं (सामग्री की तालिकादेखें) जैसा कि26, 27से ऊपर बताया गयाहै।

डिम्बग्रंथि प्रांतस्था माध्यम हल्के गुलाबी होना चाहिए। हमने देखा है कि डिम्बग्रंथि प्रांतस्था संस्कृति माध्यम का पीएच कुछ जानवरों में जल्दी से बदलता है, इस प्रकार, डिम्बग्रंथि प्रांतस्था माध्यम के बहुमत (70%) को संस्कृति स्वास्थ्य को बढ़ावा देने के लिए हर 24 घंटे में बदला जाना चाहिए। पिछले पत्रों ने मध्यम दैनिक40के आधे हिस्से को बदलने पर चर्चा की है। वर्तमान पांडुलिपि में मीडिया के बहुमत को बदलने का हमारा कारण डिम्बग्रंथि प्रांतस्था संस्कृतियों के स्वास्थ्य को बढ़ावा देना था। डिम्बग्रंथि प्रांतस्था के टुकड़ों के आसपास की बूंदें बनी रहती हैं और संस्कृति पर मध्यम परिवर्तन का कोई नकारात्मक प्रभाव नहीं था। इसके अलावा, इसने हमें डिम्बग्रंथि माइक्रोएन्वायरमेंट में अंतर्दृष्टि उत्पन्न करने के लिए प्रत्येक जानवर के लिए अधिक हार्मोन, साइटोकिन्स और केमोकाइन्स का विश्लेषण करने की अनुमति दी।

यह ऊतक संस्कृति प्रोटोकॉल कई फायदे प्रदान करता है। संवर्धित डिम्बग्रंथि प्रांतस्था follicles एक वातावरण है कि विवो में के समान है में विकसित करने के लिए अनुमति देता है. Follicles आसपास के स्ट्रोमा द्वारा समर्थित रहते हैं और दैहिक कोशिकाओं और cumulus सेल-ओसाइट के बीच संचार जारी है। संस्कृति अच्छी तरह से आवेषण का उपयोग डिम्बग्रंथि प्रांतस्था को जलमग्न किए बिना संस्कृति माध्यम पर आराम करने में सक्षम बनाता है, जिससे ऊतक को अच्छी तरह से प्लेट के प्लास्टिक आधार पर बंधने से रोका जा सकता है। एक और लाभ संस्कृति खिड़की है। प्रोटोकॉल में वर्णित 7-दिवसीय संस्कृति विंडो प्रतिनिधि हार्मोन और विकास कारक डेटा प्रदान करती है। इसके अलावा, folliculogenesis इस इन विट्रो वातावरण में प्रगति करना जारी रखता है क्योंकि हमने संस्कृति के 7 दिनों के बाद कम शुरुआती-मंचन वाले रोम (आदिम) और अधिक देर से मंचन किए गए रोम (माध्यमिक, एंट्रल) की गणना कीहै। पिछले डिम्बग्रंथि ऊतक संस्कृति प्रोटोकॉल ने अपेक्षाकृत कम (1-6 दिन7, 32)या लंबे(10-15दिन5,6,10)संस्कृति अवधि का उपयोग किया है। भ्रूण के गोजातीय डिम्बग्रंथि प्रांतस्था41में आदिम कूप सक्रियण की जांच करने के लिए छोटी संस्कृति खिड़कियों का उपयोग किया गया है। गैर-मानव प्राइमेट्स में, सीरम-मुक्त माध्यम18में विट्रो में जीवित रहने और विकास शुरू करने के लिए प्राइमेट आदिम रोम की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए 20-दिवसीय संस्कृति अवधि का उपयोग किया गया था। हालांकि, हमने सीरम-मुक्त माध्यम में 7 दिनों से अधिक समय तक डिम्बग्रंथि गोजातीय प्रांतस्था की खेती करते समय ऊतक क्षरण में वृद्धि देखी है। हमने दैनिक नमूनों के विश्लेषण में यह भी निर्धारित किया है कि स्टेरॉयड सांद्रता संस्कृति के 4 दिनों के बाद कम हो जाती है (डेटा नहीं दिखाया गया है)। एक लंबी संस्कृति खिड़की भी डिम्बग्रंथि प्रांतस्था संस्कृतियों में संदूषण की संभावना को बढ़ा सकती है। इसलिए, प्रमुख प्रभावों को संस्कृति15 के 7 दिनों से मापा जा सकता है और संस्कृति का समय पशु मॉडल और संबोधित वैज्ञानिक प्रश्न पर निर्भर हो सकता है।

जबकि इस गोजातीय डिम्बग्रंथि प्रांतस्था प्रोटोकॉल के कई फायदे मौजूद हैं, कुछ सीमाएं हैं। एक सीमा डिम्बग्रंथि cortical ऊतक और संस्कृति मध्यम डिम्बग्रंथि cortical संस्कृति के दौरान एकत्र की मात्रा है. डिम्बग्रंथि प्रांतस्था के टुकड़ों का छोटा आकार सीमित संख्या में ऊतक वर्गों को धुंधला उद्देश्यों (एच एंड ई, इम्यूनोफ्लोरेसेंस, आदि) के लिए उपयोग करने की अनुमति देता है। आरटी-पीसीआर करने के लिए, कम से कम चार कॉर्टेक्स टुकड़ों की आवश्यकता होती है16। इसके अलावा, एकत्र किए गए संस्कृति माध्यम की कम मात्रा आयोजित विश्लेषणों की मात्रा को सीमित कर सकती है। इन सीमाओं का मुकाबला करने के लिए, हम हिस्टोलॉजी, एसेस और पीसीआर के लिए संस्कृति माध्यम और ऊतक की पर्याप्त आपूर्ति प्रदान करने के लिए प्रति अंडाशय कई प्रतिकृतियों को कल्चर करने का सुझाव देते हैं। अक्सर हम आगे के विश्लेषण के लिए अधिक ऊतक प्राप्त करने के लिए और हार्मोन / साइटोकिन्स / केमोकाइन के कॉर्टेक्स स्राव को मापने के लिए बढ़ी हुई संस्कृति माध्यम प्राप्त करने के लिए एक गाय / बछिया से प्रत्येक अंडाशय के कई टुकड़ों को संस्कृति करते हैं। Preantral follicles युवा मादाओं (heifers) की तुलना में पुराने गाय अंडाशय में अधिक फैलाना कर रहे हैं। इस प्रकार, एक संभावित सीमा सभी डिम्बग्रंथि प्रांतस्था के टुकड़ों पर प्रीएंट्रल रोम प्राप्त कर रही है जो सुसंस्कृत हैं। इस सीमा को कम करने के कई तरीके अधिक डिम्बग्रंथि प्रांतस्था के टुकड़ों को प्राप्त करना और प्रत्येक जानवर के लिए अतिरिक्त कुओं को संस्कृति करना या रोम की कल्पना करने के लिए तटस्थ लाल का उपयोग करना और यह सुनिश्चित करना है कि सभी कॉर्टेक्स टुकड़ों में शुरुआती प्रीएंट्रल रोम होते हैं। डिम्बग्रंथि प्रांतस्था संस्कृति की एक तीसरी सीमा यह है कि संस्कृति प्रणाली का कोई भी संदूषण मीडिया और कॉर्टेक्स टुकड़ों को विश्लेषण के लिए अनुपयोगी बनाता है। इस प्रकार, बाँझ वातावरण को बनाए रखने के कई तरीके संस्कृति में उपयोग किए जाने वाले माध्यम को फ़िल्टर करना है। डिम्बग्रंथि प्रांतस्था के टुकड़ों को संसाधित करने और काटने से पहले यह सुनिश्चित करें कि साफ बेंच को 70% इथेनॉल के साथ निष्फल किया गया है, और विच्छेदन से पहले हवा का प्रवाह कम से कम 30 मिनट तक चल रहा है। इसके अलावा, यदि आसान सफाई(चित्रा 1)को सक्षम करने के लिए एक अवशोषक पैड का उपयोग करना, तो सुनिश्चित करें कि पैड और साफ बेंच को निष्फल करने के लिए किसी भी ऊतक को साफ बेंच में रखने से पहले यूवी प्रकाश को 30 मिनट के लिए चालू किया गया है। अंत में, सभी मीडिया परिवर्तनों को पर्याप्त एयरफ्लो, बाँझ उपकरणों के साथ एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में आयोजित किया जाना चाहिए, और यह सुनिश्चित करने के लिए कि डिम्बग्रंथि प्रांतस्था संस्कृति के लिए कुओं में रखे जाने वाले माध्यम में केवल बाँझ युक्तियों को पेश किया जाता है।

इस तकनीक का अनुप्रयोग डिम्बग्रंथि माइक्रोएन्वायरमेंट को समझने में सहायता करेगा और महिला प्रजनन विकारों में शामिल तंत्र को उजागर करना शुरू कर सकता है जिसमें परिवर्तित कूपिक विकास शामिल है। उदाहरण के लिए, पॉलीसिस्टिक अंडाशय सिंड्रोम (पीसीओएस) का एटियलजि और समय से पहले डिम्बग्रंथि विफलता (पीओएफ) के पहलू अस्पष्ट रहते हैं। चूंकि गाय मोनो-ओव्यूलेटरी हैं, इसलिए वे उन कारकों को समझने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल बनाते हैं जो कूप प्रगति को प्रभावित करते हैं और अन्य मोनो-ओव्यूलेटरी प्रजातियों (जैसे, मनुष्यों और गैर-मानव प्राइमेट्स) में गिरफ्तारी करते हैं। इसके अलावा, यह डिम्बग्रंथि प्रांतस्था संस्कृति विधि संभावित चिकित्सीय परीक्षण के लिए भी फायदेमंद साबित हो सकती है जो महिलाओं में बांझपन के परिणामस्वरूप कूप-मध्यस्थता विकारों में सुधार कर सकती है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस शोध को एएससी, एएससी के लिए स्वास्थ्य प्रतिस्पर्धी अनुदान के लिए नेब्रास्का खाद्य विश्वविद्यालय के लिए राष्ट्रीय खाद्य और कृषि संस्थान 2013-67015-20965 द्वारा समर्थित किया गया था। संयुक्त राज्य अमेरिका के कृषि विभाग हैच अनुदान NEB26-202 / W3112 परिग्रहण # एएससी के लिए 1011127, हैच-एनईबी एएनएचएल परिग्रहण # एएससी के लिए 1002234। क्वांटिटेटिव लाइफ साइंसेज इनिशिएटिव समर पोस्टडॉक्टोरल स्कॉलर सपोर्ट - सीएमएस के लिए गर्मियों के वित्त पोषण के लिए कोविड -19 पुरस्कार।

लेखक डॉ रॉबर्ट कुशमैन, अमेरिकी मांस पशु अनुसंधान केंद्र, क्ले सेंटर, एनई को अपनी प्रशंसा का विस्तार करना चाहते हैं ताकि उन्हें पिछले प्रकाशन में अंडाशय प्रदान करने के लिए धन्यवाद दिया जा सके, जो तब इस तकनीक को मान्य करने में अवधारणा के प्रमाण के रूप में वर्तमान पेपर में उपयोग किए गए थे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#11 Scapel Blade Swann-Morton  303 Scaple Blade
#21 Scapel Blade Swann-Morton  307 Scaple Blade
500mL Bottle Top Filter Corning 430514 Bottle Top Filter 0.22 µm pore for filtering medium
AbsoluteIDQ Sterol17 Assay Biocrates Sterol17 Kit Samples are sent off to Biocrates and steroid panels are run and results are returned 
Androstenedione Double Antibody RIA Kit MPBio 7109202 RIA to determine androstenedione from culture medium
Belgium A4 Assay Kit  DIA Source  KIP0451 RIA to determine androstenedione from culture medium
Bovine Cytokine Array Q3 RayBiotech QAB-CYT-3-1 Cytokine kit to determine cytokines from culture medium
cellSens Software Standard 1.3 Olympus 7790 Imaging Software
Insulin-Transferrin-Selenium-X Gibco ThermoFisher Scientific 5150056 Addative to the culture medium
Leibovitz's L-15 Medium Gibco ThermoFisher Scientific 4130039 Used for tissue washing on clean bench, and in the biosafety cabniet 
Microscope  Olympus SZX16 Disection microscope used for imaging tissue culture pieces 
Microscope Camera  Olympus DP71 Microscope cameraused for imaging tissue culture pieces 
Millicell Cell Culture Inserts 0.4µm, 12,mm Diameter Millipore Sigma PICM01250 Inserts that allow the tissue to rest against the medium without being submerged in it
Multiwell 24 well plate Falcon 353047 Plate used to hold meduim, inserts, and tissues
Petri dish 60 x 15 mm Falcon 351007 Petri dish used for washing steps prior to culture
Phosphate-Buffered Saline (PBS 1X) Corning 21-040-CV Used for tissue washing
SAS Version 9.3 SAS Institute  9.3 TS1M2 Statistical analysis software 
Thomas Stadie-Riggs Tissue Slicer Thomas Scientific 6727C10 Tissue slicer for preperation of thin uniform sections of fresh tissue
Waymouth MB 752/1 Medium Sigma-Aldrich W1625 Medium used for tissue cultures

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Braw-Tal, R., Yossefi, S. Studies in vivo and in vitro on the initiation of follicle growth in the bovine ovary. Journal of Reproduction and Fertility. 109, 165-171 (1997).
  2. Nilsson anEdson, M. A., Nagaraja, A. K., Matzuk, M. M. The mammalian ovary from genesis to revelation. Endocrine Reviews. 30 (6), 624-712 (2009).
  3. Fortune, J. E., Cushman, R. A., Wahl, C. M., Kito, S. The primordial to primary follicle transition. Molecular and Cellular Endocrinology. 163, 53-60 (2000).
  4. Ireland, J. J. Control of follicular growth and development. Journal of Reproduction and Fertility. 34, 39-54 (1987).
  5. Higuchi, C. M., Maeda, Y., Horiuchi, T., Yamazaki, Y. A simplified method for three-dimensional (3-D) ovarian tissue culture yielding oocytes competent to produce full-term offspring in mice. PLoS One. 10 (11), e0143114 (2015).
  6. Ramezani, M., Salehnia, M., Jafarabadi, M. Short term culture of vitrified human ovarian cortical tissue to assess the cryopreservation outcome: molecular and morphological analysis. Journal of Reproduction & Infertility. 18 (1), 162-171 (2017).
  7. McLaughlin, M., Telfer, E. Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system. Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).
  8. Stefansdottir, A., Fowler, P. A., Powles-Glover, N., Anderson, R. A., Spears, N. Use of ovary culture techniques in reproductive toxicology. Reproductive Toxicology. 49, 117-135 (2014).
  9. Bromfield, J. J., Sheldon, I. M. Lipopolysaccharide reduces the primordial follicle pool in the bovine ovarian cortex ex vivo and in the murine ovary in vivo. Biology of Reproduction. 88 (4), 1-9 (2013).
  10. Franks, S., Stark, J., Hardy, K. Follicle dynamics and anovulation in polycystic ovary syndrome. Humane Reproduction Update. 14 (4), 367-378 (2008).
  11. Desmeules, P., Devine, P. J. Characterizing the ovotoxicity of cyclophosphamide metabolites on cultured mouse ovaries. Toxicological Sciences. 90 (2), 500-509 (2006).
  12. Bott, R. C., McFee, R. M., Clopton, D. T., Toombs, C., Cupp, A. S. Vascular endothelial growth factor and kinase domain region receptor are involved in both seminiferous cord formation and vascular development during testis morphogenesis in the rat. Biology of Reproduction. 75, 56-67 (2006).
  13. Baltes-Breitwisch, M. M., et al. Neutralization of vascular endothelial growth factor antiangiogenic isoforms or administration of proangiogenic isoforms stimulates vascular development in the rat testis. Reproduction. 140 (2), 319-329 (2010).
  14. McFee, R. M., et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor receptor signal transduction blocks follicle progression but does not necessarily disrupt vascular development in perinatal rat ovaries. Biology of Reproduction. 81, 966-977 (2009).
  15. Artac, R. A., et al. Neutralization of vascular endothelial growth factor antiangiogenic isoforms is more effective than treatment with proangiogenic isoforms in stimulating vascular development and follicle progression in the perinatal rat ovary. Biology of Reproduction. 81, 978-988 (2009).
  16. Abedal-Majed, M. A., et al. Vascular endothelial growth factor A isoforms modulate follicle development in peripbertal heifers independent of diet through diverse signal transduction pathways. Biology of Reproduction. 102 (3), 680-692 (2020).
  17. Wandji, S. A., Srsen, V., Voss, A. K., Eppig, J. J., Fortune, J. E. Initiation in vitro of bovine primordial follicles. Biology of Reproduction. 55, 942-948 (1996).
  18. Wandji, S. A., Srsen, V., Nathanielsz, P. W., Eppig, J. J., Fortune, J. E. Initiation of growth of baboon primordial follicles in vitro. Human Reproduction. 12 (9), 1993-2001 (1993).
  19. Yang, M. Y., Fortune, J. E. Testosterone stimulates the primary to secondary follicle transition in bovine follicles in vitro. Biology of Reproduction. 75, 924-932 (2006).
  20. Fortune, J. E., Kito, S., Wandji, S. A., Srsen, V. Activation of bovine and baboon primordial follicles in vitro. Theriogenology. 49, 441-449 (1998).
  21. Yang, M. Y., Fortune, J. E. Vascular endothelial growth factor stimulates the primary to secondary follicle transition in bovine follicles in vitro. Molecular Reproduction and Development. 74, 1095-1104 (2007).
  22. Barberino, R. S., Silva, J. R. V., Figueiredo, J. R., Matos, M. H. T. Transport of domestic and wild animal ovaries: a review of the effects of medium, temperature, and periods of storage on follicular viability. Biopreservation and Biobanking. 17 (1), 84-90 (2019).
  23. Summers, A. F., et al. Altered theca and cumulus oocyte complex gene expression, follicular arrest and reduced fertility in cows with dominant follicle follicular fluid androgen excess. PLoS One. 9 (10), e110683 (2014).
  24. Koal, T., Schmiederer, D., Pham-Tuan, H., Rohring, C., Rauh, M. Standardized LC-MS/MS based steroid hormone profile analysis. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 129, 129-138 (2012).
  25. Poole, R. K., Brown, A. R., Pore, M. H., Pickworth, C. L., Poole, D. H. Effects of endophyte-infected tall fescue seed and protein supplementation on stocker steers: II. Adaptive and innate immune function. Journal of Animal Science. 97 (10), 4160-4170 (2019).
  26. Laronda, M., et al. Alginate encapsulation supports the growth and differentiation of human primordial follicles within ovarian cortical tissue. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 31 (8), 1013-1028 (2014).
  27. Silber, S. J., et al. A series of monozygotic twins discordant for ovarian failure: ovary transplantation (cortical versus microvascular) and cryopreservation. Human Reproduction. 23 (7), 1531-1537 (2008).
  28. Wiedemann, C., Zahmel, J., Jewgenow, K. Short-term culture of ovarian cortex pieces to assess the cryopreservation outcome in wild fields for genome conservation. BMC Veterinary Research. 9 (37), (2013).
  29. Baufeld, A., Vanselow, J. Increasing cell plating density mimics an early post-LH stage in cultured bovine granulosa cells. Cell and Tissue Research. 354 (3), 869-880 (2013).
  30. Shimizu, T., Miyamoto, A. Progesterone induces the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) 120 and Flk-1, its receptor, in bovine granulosa cells. Animal Reproduction Science. 102 (3-4), 228-237 (2007).
  31. Tepekoy, F., Akkoyunlu, G. The effect of FSH and activin A on Akt and MAPK1/3 phosphorylation in cultured bovine ovarian cortical strips. Journal of Ovarian Research. 9 (13), 1-9 (2016).
  32. Beck, K., Singh, J., Arshud Dar, M., Anzar, M. Short-term culture of adult bovine ovarian tissues: chorioallantoic membrane (CAM) vs. traditional in vitro culture systems. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 21 (2018).
  33. Eppig, J. J. Oocyte control of ovarian follicular development and function in mammals. Reproduction. 122 (6), 829-838 (2001).
  34. Paczkowski, M., Silva, E., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Comparative importance of fatty acid beta-oxidation to nuclear maturation, gene expression, and glucose metabolism in mouse, bovine, and porcine cumulus oocyte complexes. Biology of Reproduction. 88 (5), 1-11 (2013).
  35. Raffel, N., et al. Is ovarian tissue transport at supra-zero temperatures compared to body temperature optimal for follicle survival? In Vivo. 34 (2), 533-541 (2020).
  36. Duncan, F., et al. Ovarian tissue transport to expand access to fertility preservation: from animals to clinical practice. Reproduction (Cambridge, England). 152 (6), R201-R210 (2016).
  37. Liebenthron, J., et al. Overnight ovarian tissue transportation for centralized cryobanking: a feasible option. Reproductive BioMedicine Online. 38 (5), 740-749 (2019).
  38. Mohammed, B. T., Donadeu, F. X. Bovine granulosa cell culture. Epithelial Cell Culture: Methods and Protocols. , 79-87 (2018).
  39. Langbeen, A., et al. Effects of neutral red assisted viability assessment on the cryotolerance of isolated bovine preantral follicles. Journal of Assisted Reproduction Genetics. 31, 1727-1736 (2014).
  40. Higuchi, C. M., Maeda, Y., Horiuchi, T., Yamazaki, Y. A simplified method for three-dimensional (3-D) ovarian tissue culture yielding oocytes competent to produce full-term offspring in mice. PLoS One. 10 (11), e0143114 (2015).
  41. Yang, M. Y., Fortune, J. E. Changes in the transcriptome of bovine ovarian cortex during follicle activation in vitro. Physiological Genomics. 47, 600-611 (2015).

Tags

जीव विज्ञान अंक 167 गोजातीय डिम्बग्रंथि प्रांतस्था हार्मोन follicles ऊतक संस्कृति संस्कृति माध्यम स्टेरॉयड साइटोकिन्स
गोजातीय डिम्बग्रंथि प्रांतस्था ऊतक संस्कृति
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sutton, C. M., Springman, S. A.,… More

Sutton, C. M., Springman, S. A., Abedal-Majed, M. A., Cupp, A. S. Bovine Ovarian Cortex Tissue Culture. J. Vis. Exp. (167), e61668, doi:10.3791/61668 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter