鹰嘴豆的干根罗特病测定：详细方法
Summary
本研究提出了研究鹰嘴豆-瑞佐克托马基亚相互作用背后的病理形态和分子机制 的方法。印迹纸方法可用于快速研究鹰嘴豆基因型反应，而病锅基方法可用于同时 施加干旱和R.巴塔蒂奥拉感染 和筛选耐受基因型。
Abstract
干根腐烂 （DRR） 疾病是世界各地鹰嘴豆种植的一种新兴生物压力威胁。它是由土壤传播的真菌病原体 Rhizoctonia巴塔蒂奥拉引起的。在文献中，关于疾病测定的全面和详细的分步协议是稀疏的。本文详细介绍了设置印迹纸技术以快速筛选基因型以抵抗 DRR 的步骤。印迹纸技术简单易用，成本更低。另一种基于病锅方法的方法是自然感染的模仿，可用于研究疾病三角中涉及的相互作用的成分——植物、病原体和环境。
此外，在自然界中，DRR主要发生在雨中鹰嘴豆种植区，那里的土壤水分随着作物生长的推进而消退。众所周知，干旱压力使鹰嘴豆植物容易患 DRR 疾病。对干旱压力下植物-病原体相互作用的病理和分子理解可以为从鹰嘴豆种质池中鉴定优质耐数 DRR 品种铺平道路。本文提供了一个逐步的方法，用于准备病锅和随后的疾病测定。总体而言，本文提供的信息将帮助研究人员准备 R.巴 塔基托真菌孵化，维持这种病原体，建立印迹纸技术，准备病菌培养和病锅，并评估鹰嘴豆植物的病原体感染。
Introduction
干根腐烂（DRR）是鹰嘴豆1，2中具有经济意义的疾病之一。这是一种根特异性疾病，由Rhizoctonia巴塔蒂奥拉（电图，巨管，相相） 引起。受感染的植物缺乏横向根，并拥有脆脆的锥根和黄叶1，3。据报道，在干旱压力下，DRR对鹰嘴豆种植1、2、3构成一种新威胁。此外，据报道，在干旱压力下，在1、2、3的干旱压力下，DRR发生率会加剧。DRR在雨水灌溉地区比在灌溉田中更为普遍。利用耐药品种是战胜疾病和规避杀菌剂使用的方法。由于全球现有的鹰嘴豆种质具有遗传变异，因此对耐药/易感基因型的筛选和鉴定对于作物改良的分子育种至关重要。
强健、简单且具有成本效益的疾病检测对于调查鹰嘴豆的R.巴塔蒂奥拉感染模式至关重要。用于观察鹰嘴豆基因型对R.巴塔基奥拉感染反应的主要疾病分析是印迹纸技术1，4。这是一种简单的技术，可以使用液体真菌注射液，带根的幼苗和无菌印迹纸执行。但是，由于文献中没有提供分步协议，因此未充分利用此技术。
同时，病锅技术涉及准备潜在的病文化，并施加干旱压力。鉴于干旱压力加重了干旱病的发病率3，研究干旱压力下植物病原体相互作用6、7至关重要。病锅技术为这种同步研究提供了平台，促进种质筛选的更好可能性，并理解相互作用的机械基础。病理变化，如根长增加和横向根数减少（DRR疾病固有的）可以使用病锅技术1、3、7加以解决。
本文介绍了印迹纸和病锅技术的详细方案，可用于研究鹰嘴豆与 R.蝙 蝠豆和网眼鹰嘴豆种质之间的相互作用。研究中使用的材料的详细信息见《材料表》。
Protocol
Representative Results
Discussion
印迹纸技术为在实验室条件下筛选鹰嘴豆基因型提供了一种简单的方法。滴接种使在时间基础上的相互作用调查，易于控制接种负荷（补充图1），并方便体外筛查。此外，即使是年轻的幼苗也可以使用。五天大的真菌培养（图1B）可以产生足够的幼崽来感染植物.液体中分含有 mycelia 和微分体（图 1D & E）。根腐症状<strong class="x…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.S.K 实验室的项目得到了国家植物基因组研究所核心资助的支持。VI 确认 DBT- JRF （DBT/2015/NIPGR/430）。我们感谢见习学生Rishika小姐、贾亚亨德拉扬先生和杜尔加德维小姐在录像拍摄期间提供技术帮助，并感谢桑迪普·迪克西特先生、安贾利小姐和阿瓦尼什·雷博士对原始数据和手稿文件进行批判性评估。我们感谢拉希姆·塔拉夫达尔先生和桑德·索兰基先生对实验室的帮助。我们感谢 DBT-e 图书馆联盟 （DeLCON） 和 NIPGR 图书馆提供访问电子资源和 NIPGR 工厂生长设施，用于植物生长支持/空间。
Materials
| Fungus- Rhizoctonia bataticola | Pathogen inoculum | Indian Type Culture Collection No. 8365 | GenBank: MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&view=article& id=1251&Itemid=1370) |
| Soilrite mix | Soil medium in the lab | Keltech Energies Limited, Bangalore, India | http://www.keltechenergies.com/ |
| Filter paper | Blotting paper to support the plant growth | Himedia | http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374 |
| Pot | Growing plants | 10 and 30 cm size pots | Routinely used nursery pots, for example, https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html |
| Potato dextrose agar/broth | Culture and maintain the fungus | Cat# 213400, DifcoTM, MD, USA | https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946 |
| Incubator | Culture the fungus | LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, incubator, and shaker | http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131 |
| Growth chamber | Growing plants in controlled condition | Model No. A1000, Conviron, Canada | https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber |
| Laminar airflow | Carrying out aseptic exercises | Telstar, Bio II advance, Class II cabinet, EN-12469-2000 | https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/, http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html |
| Mesh | Filtering the fungal mycelia | Nylon mosquito net | Mesh with 0.6-1 mm diameter pore size |
| Autoclave | Autoclaving media and chickpea seeds | Autoclave | http://www.scientificsystems.in/autoclave |
| Microscopes | Visualizing the infection ang fungal mycelia | SMZ25 / SMZ18, Research Stereomicroscopes, Leica EZ4 educational stereomicroscope | https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18 https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/ https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i |
| Weighing balance | Weighing fungus and chemicals | Sartorius Electronic Weighing Balance, BSA 4202S-CW | https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances |
| WGA-FITC | Fungus staining | Sigma | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en®ion=IN |
| Aniline blue | Fungus staining | Himedia | http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901 |
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