Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: een gedetailleerde methodologie
Summary
Deze studie presenteert methodologieën om de pathomorfologische en moleculaire mechanismen te bestuderen die ten grondslag liggen aan kikkererwten:Rhizoctonia bataticola-interactie. De blotting papier methode is nuttig om snel te bestuderen kikkererwten genotype reacties, terwijl de zieke pot-gebaseerde methode kan worden gebruikt om tegelijkertijd droogte en R. bataticola infectie en scherm voor tolerante genotypen op te leggen.
Abstract
Droge wortelrot (DRR) ziekte is een opkomende biotische stress bedreiging voor kikkererwten teelt over de hele wereld. Het wordt veroorzaakt door een door de bodem overgedragen schimmelpathogene ziekteverwekker Rhizoctonia bataticola. In de literatuur zijn uitgebreide en gedetailleerde stapsgewijze protocollen over ziektetesten schaars. Dit artikel bevat volledige details over de stappen die betrokken zijn bij het opzetten van een blotting papier techniek voor het snel screenen genotypen voor weerstand tegen DRR. De blotting papier techniek is eenvoudig en minder duur. Een andere methode, gebaseerd op de zieke pot benadering, is een nabootsing van natuurlijke infectie en kan worden toegepast op de interactie componenten-plant, ziekteverwekker, en omgeving-betrokken bij de ziekte driehoek te bestuderen.
Bovendien komt DRR in de natuur vooral voor in geregen kikkererwtenteeltgebieden, waar bodemvocht afneemt naarmate de gewasgroei vordert. Droogte stress is bekend dat kikkererwten planten predisponeren om drr ziekte. Pathomorfologische en moleculaire kennis van de interactie tussen plant en ziekteverwekker bij droogtestress kan de weg vrijmaken voor de identificatie van elite DRR-resistente rassen uit de kikkererwtenkiempool. Dit artikel biedt een stapsgewijze methodologie voor de bereiding van een zieke pot en de daaropvolgende ziektetest. Over het algemeen zal de hierin gepresenteerde informatie onderzoekers helpen bij het voorbereiden van R. bataticola schimmelinoculum, het handhaven van deze ziekteverwekker, het opzetten van de blotting papiertechniek, het voorbereiden van zieke cultuur en zieke pot, en het beoordelen van ziekteverwekkerinfectie in kikkererwtenplanten.
Introduction
Droge wortelrot (DRR) is een van de economisch belangrijke ziekten bij kikkererwten1,2. Het is een wortel-specifieke ziekte veroorzaakt door Rhizoctonia bataticola (teleomorf, Macrophomina phaseolina). Geïnfecteerde planten missen laterale wortels en bezitten broze taproots en geel gebladerte1,3. DRR onder droogte stress is gemeld als een opkomende bedreiging voor kikkererwten teelt1,2,3. Bovendien wordt gemeld dat de drr-incidentie onder droogtestress onder veldomstandigheden1,2,3wordt verergerd . DRR komt vaker voor in regengebieden dan in geïrrigeerde velden4. Het gebruik van resistente rassen is de manier om de ziekte te overwinnen en fungicide gebruik te omzeilen1,13. Omdat kikkererwtenkiem kiemplasma beschikbaar over de hele wereld herbergt genetische variatie voor de eigenschap5, de screening en identificatie van resistente / vatbare genotypes zijn van cruciaal belang voor moleculaire veredeling voor gewas verbetering.
Robuuste, eenvoudige en kosteneffectieve ziektetesten zijn essentieel om r. bataticola-infectiepatronen in kikkererwten te onderzoeken. De primaire ziektetest die wordt gebruikt om de reactie van kikkererwtengenypes op R. bataticola-infectie waar te nemen, is de blotting papiertechniek1,4. Het is een eenvoudige techniek en kan worden uitgevoerd met behulp van vloeibare schimmel inoculum, zaailingen met wortels, en steriele blotting papier. Deze techniek is echter niet maximaal gebruikt omdat er geen stap-voor-stap-protocol beschikbaar is in de literatuur.
Ondertussen, de zieke pot techniek omvat de voorbereiding van een potentiële zieke cultuur en het opleggen van droogte stress. Aangezien droogtestress drr-ziekteincidentie3verergert , is het van essentieel belang om de interactie tussen plant en ziekteverwekker onder droogtestress te bestuderen6,7. De zieke pot techniek biedt het platform voor een dergelijke gelijktijdige studie, het bevorderen van betere mogelijkheden voor kiemplasma screening en het begrijpen van de mechanistische basis van de interactie. Pathomorfologische veranderingen, zoals een toename van de wortellengte en vermindering van het laterale wortelaantal — inherent aan de DRR-ziekte — kunnen worden aangepakt met behulp van de zieke pottechniek1,3,7.
Hierin wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor blotting papier en zieke pottechnieken, die kunnen worden gebruikt om de interactie tussen kikkererwten en R. bataticola en het scherm van kikkererwtenkiemen te bestuderen. De details van de in de studie gebruikte materialen zijn vermeld in de tabel met materialen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De blotting papier techniek biedt een eenvoudige aanpak voor het scherm kikkererwten genotypen onder laboratoriumomstandigheden. Dip-inenting maakt het onderzoeken van interactie op tijdelijke basis mogelijk met eenvoudige controle over entmateriaalbelasting(aanvullende figuur 1)en vergemakkelijkt in vitro screening. Bovendien kunnen zelfs jonge zaailingen worden gebruikt. Vijf dagen oude schimmelcultuur (Figuur 1B) kan voldoende inentmateriaal opleveren om de planten te inf…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Projecten in het M.S.K lab worden ondersteund door het National Institute of Plant Genome Research kernfinanciering. VI erkent DBT- JRF (DBT/2015/NIPGR/430). Wij danken studenten in opleiding, Miss Rishika, de heer Jayachendrayan, en Miss Durgadevi voor technische hulp tijdens video-opnamen en de heer Sandeep Dixit, Miss Anjali en Dr. Avanish Rai voor het kritisch beoordelen van ruwe gegevens en de manuscriptbestanden. We danken Mr Rahim H Tarafdar en Mr. Sunder Solanki voor hun hulp in het laboratorium. Wij erkennen DBT-eLibrary Consortium (DeLCON) en NIPGR Library voor het verstrekken van toegang tot e-resources en NIPGR Plant Growth Facility voor de groei van planten ondersteuning / ruimte.
Materials
| Fungus- Rhizoctonia bataticola | Pathogen inoculum | Indian Type Culture Collection No. 8365 | GenBank: MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&view=article& id=1251&Itemid=1370) |
| Soilrite mix | Soil medium in the lab | Keltech Energies Limited, Bangalore, India | http://www.keltechenergies.com/ |
| Filter paper | Blotting paper to support the plant growth | Himedia | http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374 |
| Pot | Growing plants | 10 and 30 cm size pots | Routinely used nursery pots, for example, https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html |
| Potato dextrose agar/broth | Culture and maintain the fungus | Cat# 213400, DifcoTM, MD, USA | https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946 |
| Incubator | Culture the fungus | LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, incubator, and shaker | http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131 |
| Growth chamber | Growing plants in controlled condition | Model No. A1000, Conviron, Canada | https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber |
| Laminar airflow | Carrying out aseptic exercises | Telstar, Bio II advance, Class II cabinet, EN-12469-2000 | https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/, http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html |
| Mesh | Filtering the fungal mycelia | Nylon mosquito net | Mesh with 0.6-1 mm diameter pore size |
| Autoclave | Autoclaving media and chickpea seeds | Autoclave | http://www.scientificsystems.in/autoclave |
| Microscopes | Visualizing the infection ang fungal mycelia | SMZ25 / SMZ18, Research Stereomicroscopes, Leica EZ4 educational stereomicroscope | https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18 https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/ https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i |
| Weighing balance | Weighing fungus and chemicals | Sartorius Electronic Weighing Balance, BSA 4202S-CW | https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances |
| WGA-FITC | Fungus staining | Sigma | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en®ion=IN |
| Aniline blue | Fungus staining | Himedia | http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901 |
References
- Sharma, M., Ghosh, R., Pande, S. Dry root rot (Rhizoctonia bataticola (Taub.) Butler): an emerging disease of chickpea – where do we stand. Archives of Phytopathology and Plant Protection. 48 (13-16), 797-812 (2015).
- Sinha, R., Irulappan, V., Mohan-Raju, B., Suganthi, A., Senthil-Kumar, M. Impact of drought stress on simultaneously occurring pathogen infection in field-grown chickpea. Scientific Reports. 9 (1), (2019).
- Nene, Y., Haware, M., Reddy, M. Chickpea diseases: resistance screening techniques, information bulletins No. 10. Patancheru. Information Bulletin No. 10. Patancheru, A.P., India: International CroDS Research Institute for the Semi-Arid Tropics. , 1-10 (1981).
- Pande, S., Krishna Kishore, G., Upadhyaya, H. D., Narayana Rao, J. Identification of sources of multiple disease resistance in mini-core collection of chickpea. Plant Disease. , (2006).
- Pandey, P., Irulappan, V., Bagavathiannan, M. V., Senthil-Kumar, M. Impact of combined abiotic and biotic stresses on plant growth and avenues for crop improvement by exploiting physio-morphological traits. Frontiers in Plant Science. 8, (2017).
- Irulappan, V., Senthil-Kumar, M. Morpho-physiological traits and molecular intricacies associated with tolerance to combined drought and pathogen stress in plants. Biotechnologies of Crop Improvement, Volume 3: Genomic Approaches. , (2018).
- Jensen, A. B., et al. Standard methods for fungal brood disease research. Journal of Apicultural Research. 52 (1), 1-39 (2013).
- Agrios, G. . Plant Pathology: Fifth Edition. , 9780080473 (2004).
- Coley-Smith, J. R., Cooke, R. C. Survival and germination of fungal sclerotia. Annual Review of Phytopathology. , (1971).
- Nagamma, G., Saifulla, M., Sab, J., Pavitra, S. . Screening of chickpea genotypes against dry root rot caused by Macrophomina phaseolina (tassi) goid. 10 (4), 1795-1800 (2015).
- Infantino, A., et al. Screening techniques and sources of resistance to root diseases in cool season food legumes. Euphytica. 147 (1-2), 201-221 (2006).
- Khaliq, A., et al. Integrated control of dry root rot of chickpea caused by Rhizoctonia bataticola under the natural field condition. Biotechnology Reports. 25, 00423 (2020).
