ひよこ豆の乾燥した根腐れ病アッセイ:詳細な方法論
Summary
本研究では、ひよこ豆-根支バタチコラ 相互作用の根底にある病態分子メカニズムを研究する方法論を提示する。ブロッティングペーパー法は、ひよこ豆遺伝子型応答を迅速に研究するのに有用であり、病気のポットベースの方法は、同時に干ばつと R.バタチコラ 感染を課し、寛容な遺伝子型のスクリーニングに使用することができます。
Abstract
乾燥した根腐れ(DRR)病は、世界中のひよこ豆栽培に対する新たな生物ストレスの脅威です。これは、土壌媒介性真菌病原体、 根支バタチコラによって引き起こされます。文献では、疾患アッセイに関する包括的かつ詳細なステップバイステップのプロトコルはまばらである。この記事では、DRRに対する耐性の遺伝子型をすばやくスクリーニングするためのブロッティングペーパー技術の設定に関する手順の詳細を提供します。ブロッティング紙の技術は簡単で安価です。病気のポットアプローチに基づくもう 1 つの方法は、自然感染の模倣であり、疾患の三角形に関与する相互作用コンポーネント(植物、病原体、および環境)を研究するために適用することができます。
さらに、自然界では、DRRは主に雨が降ったひよこ豆栽培地域で発生し、作物の成長が進むにつれて土壌水分が後退します。干ばつストレスは、DRR病にひよこ豆植物を素因とすることが知られています。干ばつストレス下での植物と病原体の相互作用の病態および分子的理解は、ひよこ豆の生殖器プールからのエリートDRR耐性品種の同定のための道を開くことができる。本稿では、病的なポットの調製とその後の疾患アッセイのための段階的な方法論を提供する。全体として、本明細書に提示された情報は、研究者が R.バタチコラ 真菌接種を準備し、この病原体を維持し、ブロッティングペーパー技術を設定し、病気の培養および病気のポットを準備し、ひよこ豆植物における病原体感染を評価するのに役立ちます。
Introduction
乾燥した根腐れ(DRR)は、ひよこ豆1、2の経済的に重要な疾患の一つである。これは、根性バタチコーラ(テレオモーフ、マクロフォミナフェイショウチリーナ)によって引き起こされる根特異的疾患である。感染した植物は横根を欠き、脆いタップルートと黄色の葉1、3を所有しています。干ばつストレス下のDRRは、ひよこ豆栽培1、2、3に対する新たな脅威であると報告されている。さらに、DRRの発生率は、フィールド条件1、2、3の下で干ばつストレス下で悪化すると報告されている。DRRは、灌漑されたフィールド4よりも雨の多い地域で一般的です。耐性品種の利用は、病気を克服し、殺菌剤の使用を回避する方法です1,13.世界中で利用可能なひよこ豆の生殖器は、形質5の遺伝的変異を抱えているため、作物改善のための分子繁殖には耐性/感受性遺伝子型のスクリーニングおよび同定が重要である。
ひよこ豆のR.バタチコラ感染パターンを調査するには、堅牢で簡単で費用対効果の高い疾患アッセイが不可欠です。R.バタチコラ感染症に対するひよこ豆遺伝子型の応答を観察するために使用される主要な疾患アッセイは、ブロッティングペーパー技術1,4である。それは簡単な技術であり、液体真菌の接種、根を持つ苗、および無菌ブロッティング紙を使用して実行することができる。しかし、この技術は、文献で利用できるステップバイステッププロトコルがないため、最大限に活用されていません。
一方、シックポット技術は、潜在的な病気の文化の準備と干ばつストレスの賦課を含みます。干ばつストレスがDRR病の発生率を悪化させることを考えると、干ばつストレス6、7の下で植物病原体の相互作用を研究することが不可欠である。シックポット技術は、このような同時研究のためのプラットフォームを提供し、胚芽スクリーニングのためのより良い可能性を促進し、相互作用の機械主義的基礎を理解する。DRR病に固有の根長の増加や横根数の減少などの病態変化は、シックポット手法1、3、7を使用して対処することができる。
本明細書において、ひよこ豆と R.バタチコラ とスクリーンひよこ豆の細菌との相互作用を研究するために使用することができる紙およびシックポット技術をブロッティングするための詳細なプロトコルが提示される。研究で使用される材料の詳細は、材料表に示されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
ブロッティングペーパー技術は、実験室の条件下でひよこ豆遺伝子型をスクリーニングするための簡単なアプローチを提供します。浸出接種は、接種負荷を容易に制御して時間ベースで相互作用を調査し、インビトロスクリーニングを容易にする。さらに、若い苗も使用できます。5日前の真菌培養(図1B)は、植物に感染するのに十分な接種を生じることがで…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.S.Kラボのプロジェクトは、国立植物ゲノム研究所のコア資金によって支援されています。VI は、DBT- JRF (DBT/2015/NIPGR/430) を確認します。研修生のリシカさん、ジャヤチェンドラヤンさん、ドゥルガデヴィさんはビデオ撮影中の技術的な助け、サンディープ・ディクシット氏、アンジャリさん、アヴァニシュ・ライ博士が生データと原稿ファイルを批判的に評価してくれたことに感謝します。ラヒム・H・タラフダル氏とサンダー・ソランキ氏の研究室での支援に感謝します。我々は、プラント成長支援/スペースのためのe資源およびNIPGR植物成長施設へのアクセスを提供するDBT-eLibraryコンソーシアム(DeLCON)およびNIPGRライブラリを認める。
Materials
| Fungus- Rhizoctonia bataticola | Pathogen inoculum | Indian Type Culture Collection No. 8365 | GenBank: MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&view=article& id=1251&Itemid=1370) |
| Soilrite mix | Soil medium in the lab | Keltech Energies Limited, Bangalore, India | http://www.keltechenergies.com/ |
| Filter paper | Blotting paper to support the plant growth | Himedia | http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374 |
| Pot | Growing plants | 10 and 30 cm size pots | Routinely used nursery pots, for example, https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html |
| Potato dextrose agar/broth | Culture and maintain the fungus | Cat# 213400, DifcoTM, MD, USA | https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946 |
| Incubator | Culture the fungus | LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, incubator, and shaker | http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131 |
| Growth chamber | Growing plants in controlled condition | Model No. A1000, Conviron, Canada | https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber |
| Laminar airflow | Carrying out aseptic exercises | Telstar, Bio II advance, Class II cabinet, EN-12469-2000 | https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/, http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html |
| Mesh | Filtering the fungal mycelia | Nylon mosquito net | Mesh with 0.6-1 mm diameter pore size |
| Autoclave | Autoclaving media and chickpea seeds | Autoclave | http://www.scientificsystems.in/autoclave |
| Microscopes | Visualizing the infection ang fungal mycelia | SMZ25 / SMZ18, Research Stereomicroscopes, Leica EZ4 educational stereomicroscope | https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18 https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/ https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i |
| Weighing balance | Weighing fungus and chemicals | Sartorius Electronic Weighing Balance, BSA 4202S-CW | https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances |
| WGA-FITC | Fungus staining | Sigma | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en®ion=IN |
| Aniline blue | Fungus staining | Himedia | http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901 |
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