병아리콩에서 건조 루트 썩은 질병 에세이 : 상세한 방법론
Summary
이 연구는 병아리콩의 근간을 연구하는 방법론과 분자 메커니즘을 제시합니다–Rhizoctonia 바타티콜라 상호 작용. 상기 블로팅 종이 방법은 병아리콩 유전자형 반응을 빠르게 연구하는 데 유용하며, 아픈 냄비 기반 방법은 가뭄과 R. 바타티콜라 감염 및 내성 유전자형을 위한 화면을 동시에 부과하는 데 사용될 수 있다.
Abstract
건조 루트 부패 (DRR) 질병은 전 세계 병아리콩 재배에 대한 새로운 생물학적 스트레스 위협입니다. 토양에 의한 곰팡이 병원체인 리조토니아 바타티콜라에의한 것이다. 문헌에서는 질병 분석에 대한 포괄적이고 상세한 단계별 프로토콜은 희소합니다. 이 문서에서는 DRR에 대한 저항성을 위해 유전자형을 신속하게 선별하기 위한 블로팅 용지 기술을 설정하는 데 관련된 단계에 대한 자세한 내용을 제공합니다. 블로팅 페이퍼 기법은 쉽고 저렴합니다. 아픈 냄비 접근법에 근거한 또 다른 방법은 자연 감염의 모방이며 질병 삼각형에 관여하는 식물, 병원균 및 환경과 같은 상호 작용하는 구성 요소를 연구하기 위해 적용 될 수 있습니다.
또한, 자연에서 DRR은 주로 작물 성장이 진행됨에 따라 토양 수분이 후퇴하는 비가 내린 병아리콩 재배 지역에서 발생합니다. 가뭄 스트레스는 DRR 질병에 병아리콩 식물을 걸리기 쉬운 것으로 알려져 있습니다. 가뭄 스트레스하에서 식물 병원체 상호 작용의 병리학 및 분자 이해는 병아리콩 세균성 수영장에서 엘리트 DRR 내성 품종의 식별을위한 길을 열 수 있습니다. 이 문서는 아픈 냄비와 후속 질병 분석의 준비를위한 단계별 방법론을 제공합니다. 전반적으로, 본 원에 제시된 정보는 연구원이 R. bataticola 곰팡이 무분큐럼을 준비하고, 이 병원체를 유지하고, 블로팅 종이 기술을 설정하고, 아픈 문화와 아픈 냄비를 준비하고, 병아리콩 식물에 있는 병원균 감염을 평가하는 것을 도울 것입니다.
Introduction
건조 루트 부패 (DRR)는 병아리콩1,2에서경제적으로 중요한 질병 중 하나입니다. 그것은 Rhizoctonia 바타티콜라에 의해 발생 하는 루트 특이 적인 질병 (텔레모프, 거시 포 미나 phaseolina). 감염된 식물은 측면 뿌리가 부족하고 부서지기 쉬운 타뿌리와 노란색 단풍1,3을가지고 있습니다. 가뭄 스트레스하에서 DRR은 병아리콩재배1,2,3에대한 새로운 위협으로 보고되었습니다. 더욱이, DRR발생률은1, 2,3의현장조건하에서 가뭄 스트레스하에서 악화되는 것으로 보고된다. DRR은 관개 필드4보다비가 많이 내리는 지역에서 더 널리 퍼져 있습니다. 내성 품종의 활용은 질병을 극복하고 살균제 사용1,13을우회하는 방법입니다. 전 세계적으로 사용할 수있는 병아리 콩 세균은 특성5에대한 유전 적 변이를 항구하기 때문에, 내성 / 깨지기 쉬운 유전자형의 선별 및 식별은 작물 개선을위한 분자 번식에 매우 중요합니다.
견고하고 쉽고 비용 효율적인 질병 애약은 병아리콩의 R. 바타티콜라 감염 패턴을 조사하는 데 필수적입니다. R. 바타티콜라 감염에 대한 병아리콩 유전자형의 반응을 관찰하는 데 사용되는 1차 질환 분석법은 블로팅 종이 기술1,4이다. 그것은 간단한 기술이며 액체 곰팡이 접종, 뿌리가있는 모종 및 멸균 얼룩지를 사용하여 실행할 수 있습니다. 그러나 이 기술은 문헌에서 단계별 프로토콜을 사용할 수 없기 때문에 최대한 활용되지 않았습니다.
한편, 아픈 냄비 기술은 잠재적 인 아픈 문화의 준비와 가뭄 스트레스의 부과를 포함한다. 가뭄 스트레스가 DRR 질환 발생률 을 악화시키는 것을 감안할 때3,가뭄 스트레스6,7하에서식물 병원체 상호 작용을 연구하는 것이 필수적이다. 아픈 냄비 기술은 이러한 동시 연구를위한 플랫폼을 제공, 세균 검사를위한 더 나은 가능성을 촉진하고 상호 작용의 기계론적 기초를 이해. DRR 질병에 내재된 루트 길이의 증가 및 측면 루트 수의 감소와 같은 병리학적 변화는 아픈 냄비 기술1,3,7을사용하여 해결할 수 있다.
본명, 병아리콩과 R. 바타티콜라 와 스크린 병아리콩 세균질 사이의 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있는 종이와 아픈 냄비 기술을 부팅하기 위한 상세한 프로토콜이 제시된다. 연구에 사용된 재료의 세부 사항은 재료 표에부여됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
얼룩지는 종이 기술은 실험실 조건 하에서 병아리콩 유전자형을 검사하는 간단한 접근 방식을 제공합니다. 딥 접종을 통해 접종부하(보충 도 1)를쉽게 제어하여 현세적 기초에 대한 상호 작용의 조사를 가능하게 하고 체외 검사를 용이하게 합니다. 또한, 심지어 젊은 묘목을 사용할 수 있습니다. 5일 된 곰팡이 배양(도 1B)은식물을 감염시킬 만큼 충분한 접종을 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.S.K 연구소의 프로젝트는 국립 식물 게놈 연구 핵심 자금 조달에 의해 지원됩니다. VI는 DBT-JRF(DBT/2015/NIPGR/430)를 인정합니다. 우리는 비디오 촬영 중 기술 적 도움을 준 훈련생 리시카 양, 자야첸 씨, 두르가데비 양에게 원시 데이터와 원고 파일을 비판적으로 평가해 준 것에 대해 감사드립니다. 라힘 H 타라프다르 씨와 선더 솔란키 씨가 실험실에서 도움을 주신 것에 감사드립니다. 우리는 DBT-eLibrary 컨소시엄 (DeLCON) 및 NIPGR 도서관이 공장 성장 지원 / 공간을위한 e 자원 및 NIPGR 플랜트 성장 시설에 대한 액세스를 제공하는 것을 인정합니다.
Materials
| Fungus- Rhizoctonia bataticola | Pathogen inoculum | Indian Type Culture Collection No. 8365 | GenBank: MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&view=article& id=1251&Itemid=1370) |
| Soilrite mix | Soil medium in the lab | Keltech Energies Limited, Bangalore, India | http://www.keltechenergies.com/ |
| Filter paper | Blotting paper to support the plant growth | Himedia | http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374 |
| Pot | Growing plants | 10 and 30 cm size pots | Routinely used nursery pots, for example, https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html |
| Potato dextrose agar/broth | Culture and maintain the fungus | Cat# 213400, DifcoTM, MD, USA | https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946 |
| Incubator | Culture the fungus | LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, incubator, and shaker | http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131 |
| Growth chamber | Growing plants in controlled condition | Model No. A1000, Conviron, Canada | https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber |
| Laminar airflow | Carrying out aseptic exercises | Telstar, Bio II advance, Class II cabinet, EN-12469-2000 | https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/, http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html |
| Mesh | Filtering the fungal mycelia | Nylon mosquito net | Mesh with 0.6-1 mm diameter pore size |
| Autoclave | Autoclaving media and chickpea seeds | Autoclave | http://www.scientificsystems.in/autoclave |
| Microscopes | Visualizing the infection ang fungal mycelia | SMZ25 / SMZ18, Research Stereomicroscopes, Leica EZ4 educational stereomicroscope | https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18 https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/ https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i |
| Weighing balance | Weighing fungus and chemicals | Sartorius Electronic Weighing Balance, BSA 4202S-CW | https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances |
| WGA-FITC | Fungus staining | Sigma | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en®ion=IN |
| Aniline blue | Fungus staining | Himedia | http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901 |
References
- Sharma, M., Ghosh, R., Pande, S. Dry root rot (Rhizoctonia bataticola (Taub.) Butler): an emerging disease of chickpea – where do we stand. Archives of Phytopathology and Plant Protection. 48 (13-16), 797-812 (2015).
- Sinha, R., Irulappan, V., Mohan-Raju, B., Suganthi, A., Senthil-Kumar, M. Impact of drought stress on simultaneously occurring pathogen infection in field-grown chickpea. Scientific Reports. 9 (1), (2019).
- Nene, Y., Haware, M., Reddy, M. Chickpea diseases: resistance screening techniques, information bulletins No. 10. Patancheru. Information Bulletin No. 10. Patancheru, A.P., India: International CroDS Research Institute for the Semi-Arid Tropics. , 1-10 (1981).
- Pande, S., Krishna Kishore, G., Upadhyaya, H. D., Narayana Rao, J. Identification of sources of multiple disease resistance in mini-core collection of chickpea. Plant Disease. , (2006).
- Pandey, P., Irulappan, V., Bagavathiannan, M. V., Senthil-Kumar, M. Impact of combined abiotic and biotic stresses on plant growth and avenues for crop improvement by exploiting physio-morphological traits. Frontiers in Plant Science. 8, (2017).
- Irulappan, V., Senthil-Kumar, M. Morpho-physiological traits and molecular intricacies associated with tolerance to combined drought and pathogen stress in plants. Biotechnologies of Crop Improvement, Volume 3: Genomic Approaches. , (2018).
- Jensen, A. B., et al. Standard methods for fungal brood disease research. Journal of Apicultural Research. 52 (1), 1-39 (2013).
- Agrios, G. . Plant Pathology: Fifth Edition. , 9780080473 (2004).
- Coley-Smith, J. R., Cooke, R. C. Survival and germination of fungal sclerotia. Annual Review of Phytopathology. , (1971).
- Nagamma, G., Saifulla, M., Sab, J., Pavitra, S. . Screening of chickpea genotypes against dry root rot caused by Macrophomina phaseolina (tassi) goid. 10 (4), 1795-1800 (2015).
- Infantino, A., et al. Screening techniques and sources of resistance to root diseases in cool season food legumes. Euphytica. 147 (1-2), 201-221 (2006).
- Khaliq, A., et al. Integrated control of dry root rot of chickpea caused by Rhizoctonia bataticola under the natural field condition. Biotechnology Reports. 25, 00423 (2020).
