Summary
Qui descriviamo il sistema RatWalker, costruito riprogettando l'apparato MouseWalker per adattarsi alle maggiori dimensioni e peso dei ratti. Questo sistema utilizza la riflessione interna totale frustrata (FTIR), l'acquisizione video ad alta velocità e il software di analisi ad accesso aperto per tracciare e quantificare i parametri dell'andatura.
Abstract
La malattia di Parkinson (PD) è una malattia neurodegenerativa progressiva causata dalla perdita di neuroni dopaminergici (DA) nella pars compacta substantia nigra. Le anomalie dell'andatura, tra cui la diminuzione dell'oscillazione del braccio, la velocità di camminata più lenta e i passi più brevi sono comuni nei pazienti con PD e compaiono precocemente nel corso della malattia. Pertanto, la quantificazione dei pattern motori in modelli animali di PD sarà importante per la caratterizzazione fenotipica durante il decorso della malattia e dopo il trattamento terapeutico. La maggior parte dei casi di PD sono idiopatici; tuttavia, l'identificazione di forme ereditarie di PD ha scoperto mutazioni e varianti genetiche, come mutazioni con perdita di funzione in Pink1 e Parkin, due proteine coinvolte nel controllo della qualità mitocondriale che potrebbero essere sfruttate per creare modelli animali. Mentre i topi sono resistenti alla neurodegenerazione dopo la perdita di Pink1 e Parkin (delezione singola e combinata), nei ratti, Pink1 ma non la carenza di Parkin porta alla perdita del neurone DA nigrale e alla compromissione motoria. Qui, riportiamo l'utilità dell'imaging FTIR per scoprire i cambiamenti dell'andatura in ratti maschi giovani (2 mesi di età) che camminano liberamente con perdita combinata di Pink1 e Parkin prima dello sviluppo di una grossolana anomalia motoria visivamente apparente quando questi ratti invecchiano (osservati a 4-6 mesi), caratterizzati da trascinamento degli arti posteriori come precedentemente riportato nei ratti knockout (KO) Pink1.
Introduction
La PD, la più comune malattia neurodegenerativa del movimento legata all'età, è causata dalla perdita di neuroni DA nella substantia nigra pars compacta. Questa perdita di neuroni DA nigrali e gli input di DA nello striato portano alle compromissioni osservate della funzione motoria osservate nei pazienti con PD 1,2. Le caratteristiche motorie che definiscono i pazienti con PD, note collettivamente come parkinsonismo, includono rigidità, tremore a riposo, bradicinesia, instabilità posturale e micrografia3. Inoltre, i disturbi dell'andatura, che sono comuni nei pazienti con PD, compaiono precocemente nel corso della malattia 1,4,5. Mentre alcuni stili di vita sono suggeriti per aiutare a rallentare la progressione del PD, come un'alimentazione sana e un regolare esercizio fisico, attualmente non esiste una cura per il PD, solo farmaci per gestire i sintomi. Ciò lascia spazio alla necessità di ulteriori indagini nella speranza di migliorare le terapie. Pertanto, la caratterizzazione del modello di andatura nei modelli animali di PD è uno strumento cruciale per caratterizzare la rilevanza del modello e il modo in cui i trattamenti terapeutici volti a controllare il PD stanno prevenendo o migliorando le menomazioni motorie.
Ci sono vari modelli animali PD che sono stati utilizzati per testare trattamenti terapeutici, tuttavia ognuno ha i suoi limiti. Ad esempio, modelli animali trattati con la neurotossina 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina (MPTP) hanno prodotto una grande quantità di informazioni sui processi importanti per la perdita dei neuroni DA nigrale e i successivi adattamenti striatali, e hanno indicato il ruolo dei mitocondri nella patogenesi della PD; tuttavia, il background patogenetico del modello MPTP è di natura tossica piuttosto che un processo neurodegenerativo come nel PD 6umano. Ulteriori modelli chimicamente inducibili includono 6-idrossidopamina (6-OHDA) e rotenone. 6-OHDA è stato il primo agente utilizzato per indurre PD mediante accumulo selettivo del farmaco nei neuroni DA, che alla fine uccide i neuroni e porta a sintomi simili a PD. Questo modello è stato utilizzato per la prima volta per il monitoraggio della deplezione di DA esaminando il comportamento in risposta all'anfetamina e all'apomorfina7. Questo metodo di induzione del PD si è dimostrato utile per lo screening di agenti farmacologici che hanno un impatto su DA e sui suoi recettori8. Mentre il modello 6-OHDA è un ottimo modello per tracciare i deficit motori quantificabili, questo modello non mostra come la graduale perdita di neuroni e la formazione di corpi di Lewy influiscano sull'animale. L'altro metodo di induzione, il rotenone, ha dimostrato di avere una progressiva degenerazione dei neuroni nigrostriatali con la perdita di tirosina idrossilasi e trasportatore DA, consentendo un modello migliore per tracciare la perdita di neuroni nel tempo9. I ratti trattati con rotenone hanno mostrato bradicinesia, instabilità posturale e andatura instabile10. Tuttavia, questo metodo è risultato essere ampiamente variabile tra diversi ceppi di ratti, il che ha provocato dubbi sul fatto che il rotenone sia o meno un modello PD affidabile11,12,13. Mentre l'analisi dell'andatura ha dimostrato di essere influenzata dall'induzione del PD nei ratti, fino ad oggi, i modelli di ratto PD geneticamente indotti non sono stati prontamente utilizzati per l'analisi dell'andatura camminando liberamente lungo una pista.
Un modo per analizzare la compromissione motoria nei roditori che camminano liberamente è l'analisi cinematica dell'andatura, che può essere eseguita utilizzando l'imaging FTIR. Questo metodo consolidato utilizza un sensore tattile ottico basato su FTIR, che registra e traccia le impronte dei roditori mentre si muovono lungo la pista14,15,16. Rispetto ad altri metodi, FTIR non dipende da alcun marcatore sul corpo dell'animale che potrebbe interferire con le impronte delle zampe. La generazione dei dati video produce impronte digitali di zampe di tutti e quattro gli arti che possono essere combinate per creare un modello di camminata dinamico e riproducibile per vari modelli di roditori. Il principio dell'analisi dell'andatura basata sull'imaging è quello di prendere ogni singola zampa e misurare l'area di contatto nel tempo mentre il roditore cammina lungo la pista. Ogni posizione è rappresentata da un aumento dell'area della zampa (nella fase di frenata) e una diminuzione dell'area della zampa (nella fase di propulsione). Questo è proceduto dalla fase di oscillazione, che è quando non viene rilevato alcun segnale di zampa. Dopo la valutazione del video, vengono generati diversi parametri che possono essere utilizzati per confrontare il modello wild-type (WT) rispetto al modello PD. Alcuni esempi di parametri sono la lunghezza del passo (distanza che la zampa copre in un passo), la durata dell'oscillazione (durata del tempo in cui la zampa non è in contatto con la pista), la velocità di oscillazione (lunghezza del passo in funzione della durata dell'oscillazione) e il modello di passo (passi diagonali, gradini laterali o gradini della cintura).
Per dimostrare l'utilità della FTIR per scoprire i primi cambiamenti del modello di andatura nei ratti, abbiamo usato un modello genetico di ratto di PD. Mentre la maggior parte dei casi di PD sono idiopatici; l'identificazione di forme ereditarie di mutazioni e varianti genetiche scoperte per il PD, come le mutazioni con perdita di funzione in Pink1 e Parkin, due proteine coinvolte nel controllo della qualità mitocondriale17, che potrebbero essere sfruttate per creare modelli animali18. Sfortunatamente, i topi sono resistenti alla neurodegenerazione per perdita di queste proteine (singole e combinate)19,20,21. Nei ratti, il Pink1 ma non il deficit di Parkin porta alla perdita del neurone DA nigrale e a menomazioni motorie22, ma senza penetranza completa. Pertanto, abbiamo generato un modello combinato di ratto Pink1 / Parkin double knockout (DKO), che mostra il fenotipo di trascinamento degli arti posteriori visivamente evidente riportato nei ratti maschi Pink1 KO22, ma ora a un tasso più elevato: 100% contro 30-50% dei maschi tra 4-6 mesi.
Mentre questo metodo funziona bene per analizzare i deficit motori nei topi14, le specifiche del sistema di andatura di imaging FTIR per adattarsi alle dimensioni e al peso dei ratti non erano precedentemente disponibili non commerciali. Qui spieghiamo come costruire il RatWalker, un sistema di imaging dell'andatura FTIR modificato modellato sul MouseWalker14, tranne adattato per le dimensioni e il peso dei ratti. Questo sistema utilizza un effetto ottico, FTIR, per fornire un metodo per visualizzare e successivamente registrare le impronte degli animali per l'analisi. Il contatto del piede di un animale con la guida d'onda ottica (piattaforma) provoca interruzioni nel percorso della luce con conseguente effetto di dispersione visibile, che viene catturato utilizzando videografia domestica ad alta velocità ed elaborazione utilizzando software open source. Questo studio dimostra il potere dell'imaging FTIR nello studio dei cambiamenti dell'andatura nei modelli genetici di ratto di PD. Ad esempio, mentre i cambiamenti motori palesi visivamente evidenti (cioè il trascinamento degli arti posteriori) sono osservati nei ratti DKO maschi al più presto a 4 mesi, utilizzando FTIR siamo in grado di scoprire anomalie del gate nei ratti DKO maschi a 2 mesi di età.
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Protocol
Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università del Nebraska Medical Center.
1. Apparato di deambulazione
NOTA: Modellato dal MouseWalker14, il RatWalker è stato progettato con dimensioni proporzionali alla differenza di lunghezza del passo tra ratti e topi. È costituito da una retroilluminazione laterale, un involucro per passerella, una passerella ottica a guida d'onda, uno specchio e una telecamera (Figura S1). Strisce LED, orientate in posizione sfalsata, sono state utilizzate su ciascun lato della passerella e guide d'onda di retroilluminazione per accogliere il materiale extra. I materiali necessari per costruire l'apparato di andatura modificato possono essere trovati nella Tabella S1.
- Utilizzare una retroilluminazione (Figura S2) per creare una silhouette dell'animale che viene utilizzata dal software per assegnare posizione, direzione del movimento e qualità morfometriche. La costruzione è composta da un pannello stratificato di un diffusore acrilico, guida d'onda ottica, riflettore e strisce luminose a LED assemblate all'interno di un telaio in alluminio di serie (Tabella S1).
- Utilizzare un recinto per passerelle (Figura S3) per guidare l'animale lungo la piattaforma e dirigerlo verso la gabbia domestica. La costruzione è costituita da fogli acrilici trasparenti saldati a solvente con diclorometano (tabella S2).
- Utilizzare la passerella (Figura S4) per fornire il mezzo per generare impronte illuminate. La passerella è costruita in acrilico trasparente, che è illuminato lateralmente con strisce LED e alloggiato in angolo di alluminio (Tabella S3).
- Posizionare uno specchio (Figura S5) direttamente sotto la passerella con un angolo di 45 gradi per riflettere la parte inferiore della passerella per la videografia. È costruito da uno specchio di vetro spesso 1/4 "supportato da acrilico e staffe angolate disposte in fila (Tabella S4).
- Esegui la videografia utilizzando una action cam ad alta velocità montata su treppiede, di qualità domestica.
2. Configurazione dell'attrezzatura
- Allineare la retroilluminazione, la passerella e lo specchio secondo la Figura S1, sopra un piano di lavoro, un banco da lavoro o un carrello stabile. Assicurarsi che ogni componente sia centrato rispetto alla passerella.
- Utilizzando un livello, assicuratevi che i componenti siano a piombo orizzontalmente.
- Posizionare il recinto della passerella sulla parte superiore della passerella.
- Pulire tutte le superfici di contatto con etanolo al 70%. Assicurarsi di utilizzare un asciugamano non abrasivo per evitare graffi della passerella.
- Montare la fotocamera ad alta velocità su un treppiede da 57 pollici e posizionarla a metà linea rispetto allo specchio, distanziata abbastanza da catturare l'intera passerella all'interno del campo visivo. Dal menu delle impostazioni video, assicurati che la fotocamera ad alta velocità sia impostata sull'acquisizione lineare in modalità 1080p a 120 fotogrammi al secondo (fps) con qualsiasi tipo di regolazione automatica o ottimizzazioni disattivate.
- Collegare e accendere le strisce luminose a LED per la retroilluminazione e la passerella. Potrebbe essere necessario attenuare la retroilluminazione per ridurre l'acquisizione dello sfondo.
3. Acclimatazione degli animali
NOTA: Una settimana prima del primo esperimento, eseguire gli animali attraverso l'apparato di andatura modificato.
- Posiziona una gabbia domestica al capolinea della passerella.
- Con il recinto installato e le luci spente, posizionare il topo alla fine della passerella di fronte alla gabbia domestica e consentirgli di attraversare la passerella in modo non forzato.
- Esegui ogni topo attraverso l'apparato di andatura modificato più volte, fino a quando non possono attraversare agevolmente l'intera passerella.
- Ripeti il processo due giorni prima dell'esperimento.
4. Procedura di andatura
- Posiziona una gabbia domestica alla fine della passerella prima dell'inizio di ogni corsa per servire come spunto positivo per il topo per attraversare la passerella.
- Spegni le luci della stanza, accendi la fotocamera e inizia a registrare diversi secondi prima che il topo venga posizionato sulla piattaforma.
NOTA: assicurarsi di utilizzare una scheda di memoria ufficialmente raccomandata dal produttore della fotocamera. Una scheda di memoria non elencata potrebbe ancora funzionare, ma non è garantito che acquisisca al presunto frame rate. - Con il recinto installato, posizionare il topo alla fine della passerella di fronte alla gabbia domestica e consentirgli di attraversare la passerella in modo non forzato.
- Interrompi la registrazione una volta che l'animale raggiunge il capolinea della passerella.
- Pulire la passerella utilizzando etanolo al 70% e un asciugamano non abrasivo tra una corsa e l'altra e dopo che un animale urina o defeca, quindi lasciare evaporare l'etanolo prima di introdurre un altro animale.
- Fai correre i ratti attraverso la passerella per un totale di 7 volte durante ogni periodo di osservazione, prendendo le prime tre corse che segnano come passaggio per l'analisi.
- Segna una corsa come passaggio se l'animale fa quattro o più passi consecutivi in direzione della gabbia domestica senza interruzioni a causa di toelettatura, pause o movimenti erranti.
NOTA: È buona norma registrare la massa degli animali prima di ogni ciclo di misure. Per il nostro studio, WT (n = 7) e DKO (n = 8) pesavano rispettivamente 200,3 ± 21,67 g e 296,6 ± 3,85 g (p = 0,004, test t spaiato con correzione di Welch). Non vediamo un problema con i ratti di qualsiasi età o dimensione.
5. Pre-elaborazione video
NOTA: I video catturati dalla fotocamera ad alta velocità sono renderizzati in formato mp4 a 120 fps e una risoluzione di 1080p. Per alleggerire il carico sul software analitico a valle, prima taglia le riprese non necessarie e rimuovi l'audio da ogni video usando il software LosslessCut (versione 3.23.7, https://github.com/mifi/lossless-cut), quindi converti il flusso video mp4 in una sequenza di immagini png usando il software open source FFmpeg (versione 4.2, http://ffmpeg.org/). Nota: altri formati Lossless come tiff possono essere utilizzati al posto di png.
- Creare una directory per i video su un PC con Windows 7 o versione successiva, quindi trasferire i video dal dispositivo di archiviazione della videocamera ad alta velocità alla directory appena creata. Inoltre, copiare ffmpeg.exe nella stessa posizione.
- In LosslessCut, trascina i video sull'interfaccia da aprire. Scartare l'audio, impostare i punti di taglio iniziale e finale in modo da includere solo la parte analiticamente rilevante del video, impostare il formato del fotogramma di acquisizione su png ed esportare. Una volta esportato il video, rinominare il file video utilizzando qualsiasi convenzione di denominazione seguita da "_trimmed".
- Per convertire in batch i video in sequenze di immagini, aprire un prompt dei comandi, impostare la directory di lavoro sulla posizione dei video con "cd [percorso della directory]" ed eseguire i seguenti comandi:
per %i in (*) do mkdir "%~ni_cropped"
per %i in (*) do mkdir "%~ni_trimmed"
for /f "tokens=1 delims=." %a in ('dir /B *_trimmed. MP4') do ffmpeg -i "%a.MP4" "%a/%a_%04d.png" - Al termine del processo batch, aprire ogni sequenza di immagini in ImageJ Fiji23 e ritagliare la sequenza nella regione di interesse (ROI) che comprende l'area del pavimento all'interno della quale viene osservato il ratto.
- Per ridurre lo sfondo dall'illuminazione della passerella, aumentare il bilanciamento del colore minimo del canale ciano a 76.
- Salva come sequenza di immagini e cambia il suffisso "_trimmed" in "_cropped", salvando i file nella rispettiva cartella "_cropped".
6. Elaborazione dell'andatura
NOTA: i dati dell'andatura vengono elaborati e quantificati utilizzando il software disponibile gratuitamente, MouseWalker (http://biooptics.markalab.org/MouseWalker/)14.
- Decomprimere e installare il software MouseWalker su un PC che esegue un ambiente Windows a 64 bit con Microsoft Excel installato.
- Dopo aver avviato MouseWalker.exe, eseguire una calibrazione iniziale della scala per ogni set di esecuzioni. Carica una sequenza di immagini e utilizzando punti di riferimento o un righello catturato nel video, misura due punti di distanza nota. Calcola il numero di pixel per centimetro nel fotogramma video e inserisci questo valore nella sezione dei parametri del modulo delle impostazioni insieme alla frequenza fotogrammi di acquisizione video.
- Allo stesso modo, misurare la testa, la coda e le zampe del ratto per determinare la lunghezza della testa, la larghezza e l'area massima della coda, l'area minima e massima del piede e altre caratteristiche necessarie per completare la sezione dei parametri di tracciamento del modulo delle impostazioni di MouseWalker. Vedere http://biooptics.markalab.org/MouseWalker/ per il manuale dell'utente e altra documentazione.
- Per ottenere i valori dell'area del corpo, aprite la stessa sequenza di immagini in ImageJ, disegnate una selezione che delinea il ratto ed eseguite un conteggio dei pixel della regione di interesse (ROI).
- Parametri e impostazioni utilizzati per questa pubblicazione (Figura S6).
NOTA: i parametri vengono forniti a scopo illustrativo e dipendono dalla scala del video, dall'hardware di acquisizione e dalle condizioni. La calibrazione e la regolazione del software sono necessarie ogni volta che la telecamera o l'apparecchiatura viene riposizionata. L'acquisizione di un dispositivo di misura all'interno dell'acquisizione migliora la precisione e facilita la calibrazione. - Dopo la calibrazione, caricare ogni sequenza di immagini. Selezionando auto inizierà l'assegnazione autonoma delle impronte.
- Scorri ogni fotogramma della sequenza, correggendo manualmente le impronte assegnate in modo errato. Salva una volta completato questo passaggio.
- Infine, selezionare valuta per elaborare i dati relativi alla posizione dell'impronta e alla pressione. Una serie di grafici, immagini e un foglio di calcolo con metriche quantitative dell'andatura verranno esportati in una cartella dei risultati.
7. Analisi dei dati
- Utilizza il foglio di calcolo esportato alla fine di ogni valutazione che contiene i dati quantitativi dell'andatura per ogni corsa. Concatenare i dati di ogni corsa e la media per ratto. Tracciare i dati medi e testare la significatività utilizzando GraphPad Prism versione 7.0a.
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Representative Results
Manutenzione delle colonie di ratti
La generazione e la caratterizzazione dei ratti Pink1 e Parkin single KO sono state descritte in precedenza22. I ratti KO singoli Pink1 e Parkin sono stati ottenuti da SAGE Labs (e ora disponibili da Envigo). I ratti DKO sono stati generati incrociando ratti Pink1-/- con ratti Parkin-/- per ottenere ratti Pink1+/-/Parkin+/-, che sono stati incrociati per ottenere ratti Pink1-/-/Parkin-/- (sarà disponibile da Envigo). Per confermare la delezione di 26 bp in Park6 (gene che codifica per Pink1), la genotipizzazione è stata eseguita utilizzando primer 5'-CCCTGGCTGACTATCCTGAC-3' in avanti e 5'-CCACCACCCACTACCACTTACT-3' reverse primer. La delezione di 5 bp in Park2 (gene che codifica per Parkin) è stata testata dopo che il DNA è stato amplificato utilizzando un 5'-GGTGTGTCTTGGCTCAGTGTGA-3' e un 5'-GCCACCCAGAATAGCATCTC-3' inverso. I campioni di reazione a catena della polimerasi amplificata (PCR) sono stati inviati ad ACGT Inc (Wheeling, IL) per il sequenziamento (Figura S7). Tutti i ratti sono stati tenuti sullo sfondo Long Evans Hooded (LEH). I ratti DKO erano vitali e fertili; tuttavia, c'era un alto tasso di mortalità tra le dighe DKO al momento del parto (circa il 30%). Solo i ratti maschi sono stati utilizzati in questi esperimenti. I ratti sono stati tenuti in un ambiente a temperatura controllata con un ciclo luce/buio di 12 ore e libero accesso al ratto chow e all'acqua.
Risultati
Per servire come esempio dell'utilità del sistema di analisi dell'andatura FTIR per i ratti, adattato da14, abbiamo eseguito l'analisi dell'andatura su ratti maschi WT e Pink1 / Parkin DKO a 2 mesi di età per determinare se l'uso dell'analisi cinematica dell'andatura potesse scoprire sottili menomazioni motorie non osservate con la percezione visiva umana prima della comparsa di problemi motori grossolani a partire dai 4 mesi di età.
Analogamente ai precedenti studi sull'andatura nei topi14, il sistema FTIR adattato è stato in grado di visualizzare il modello di impronta creato dal ratto che cammina e il percorso creato dal centro del corpo (Figura 1A). Nonostante l'aumento del peso dei ratti DKO rispetto al WT (Figura 1B), la pressione del piede applicata alla superficie di calpestio (visualizzata come mappe di calore) determinata dalle intensità del segnale FTIR, è rimasta inalterata (Figura 1C). Dopo aver valutato diversi parametri dell'andatura in funzione della velocità di camminata (Figura 1D-H), abbiamo osservato che la velocità di camminata e le lunghezze dei passi erano simili tra i ratti WT e DKO (Figura 1D). Tuttavia, la variazione tra ratti WT e DKO è diventata evidente nella fase di posizione e nella durata dell'oscillazione a velocità di camminata più lente (Figura 1E, F). La frazione del ciclo di passi in cui la gamba è nella fase di posizione (durata / periodo di posizione) è il fattore di servizio, e questo parametro evidenzia più tempo trascorso nella fase di oscillazione che nella fase di posizione al diminuire del fattore di lavoro, tipico della corsa (Figura 1G). Ancora una volta, le differenze sono evidenziate a velocità inferiori. Inoltre, mentre le velocità di oscillazione aumentano con l'aumentare della velocità negli animali WT, la correlazione è smussata nei ratti DKO (Figura 1H).
L'analisi dell'andatura FTIR ha anche permesso di tracciare tracce di fase di posizione di ciascuna gamba rispetto al corpo in ratti che camminano liberamente (Figura 2A, B). Le tracce di posizione sono normalizzate alla lunghezza del corpo e sono definite come la posizione del piede rispetto al centro del corpo dal touchdown della zampa (posizione estrema anteriore, AEP) alla fine della fase di posizione (posizione estrema posteriore, PEP). Confrontando il posizionamento della zampa, abbiamo osservato cambiamenti significativi in AEP (arto posteriore sinistro) e PEP (arto posteriore destro) suggerendo che l'arto posteriore sinistro è più vicino al corpo durante il touchdown della zampa (AEP), mentre l'arto posteriore destro è più lontano dal corpo durante il decollo della zampa (PEP) in DKO rispetto ai ratti WT (Figura 2C).
Diversi parametri aggiuntivi sono stati significativamente modificati nei ratti DKO rispetto a WT. In particolare, sono stati scoperti cambiamenti nei modelli di oscillazione degli arti posteriori. La velocità di oscillazione di entrambi gli arti posteriori sinistro e destro è aumentata nei ratti DKO rispetto ai ratti WT (Figura 3A), mentre la durata di oscillazione di entrambi gli arti posteriori sinistro e destro è diminuita (Figura 3B). Da notare che la lunghezza del passo è rimasta inalterata (Figura 4).
Figura 1. Analisi del modello di impronta e dei parametri di passaggio. Modelli di impronta rappresentativi per (A) WT e (B) ratti DKO che mostrano (pannello superiore) mappa termica dell'impronta che rappresenta l'intensità dei pixel e linea orizzontale che rappresenta il percorso del corpo e (pannello inferiore) singoli piedi etichettati con colori diversi: anteriore sinistro (LF, giallo), posteriore sinistro (LH, blu), anteriore destro (RF, arancione) e posteriore destro (RH, verde). (C) Velocità media di camminata per ogni ratto WT (n = 7) e DKO (n = 8). Media con SEM. Non significativo. (D-H) Parametri di passo in funzione della velocità nei ratti WT (n = 7) e DKO (n = 8). Linee di regressione lineare e valori R quadrati inclusi. (D) La lunghezza del passo aumenta con la velocità nei ratti WT e DKO. (E) La durata dell'oscillazione è inversamente proporzionale alla velocità nei ratti WT, ma non nei ratti DKO (non sono significativi). (F) La durata della posizione diminuisce con la velocità nei ratti WT e DKO. (G) Il fattore di dovere è inversamente proporzionale alla velocità nei ratti DKO, ma non nei ratti WT (non sono significativi). (H) La velocità di oscillazione aumenta linearmente con la velocità nei ratti WT, ma non nei ratti DKO (non sono significativi). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2. Analisi delle tracce di posizione e del posizionamento delle zampe. (A) Analisi rappresentativa del percorso di camminata per un ratto WT (prima e dopo la correzione dello sfondo) visualizzata con naso (solido rosso), contorno della testa (tratteggiato blu), contorno della coda (verde tratteggiato), centro del corpo (tratteggiato bianco) e impronte (cerchi: verde, RF e azzurro, LH). (B) Grafici rappresentativi di tracce di posizione per ratti WT e DKO che camminano liberamente. (C) Viene mostrato il posizionamento delle zampe nei ratti WT (n = 7) e DKO (n = 8). AEP, posizione estrema anteriore; PEP, posizione estrema posteriore; L, sinistra; R, a destra; F, zampa anteriore; H, zampa posteriore. Media con SEM. Significativo rispetto a WT (p < 0,05*, 0,001***) utilizzando ANOVA bidirezionale e il test di confronto multiplo di Sidak. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3. I parametri di oscillazione della zampa posteriore sono stati alterati nei ratti DKO. Misurazioni della zampa anteriore e posteriore della velocità (A) alla quale le zampe si muovono e del tempo (B) le zampe sono in volo nei ratti WT (n = 7) e DKO (n = 8). L, sinistra; R, a destra; F, zampa anteriore; H, zampa posteriore. Media con SEM. Significativo rispetto a WT (p < 0,01**) utilizzando il test t a due code spaiato di Student con correzione di Welch. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4. Lunghezza del passo inalterata nei ratti DKO. Misurazioni della zampa anteriore e posteriore della lunghezza del passo nei ratti WT (n = 7) e DKO (n = 8). L, sinistra; R, a destra; F, zampa anteriore; H, zampa posteriore. Media con SEM. Significativo rispetto a WT (non significativo) usando il test t a due code spaiato di Student con correzione di Welch. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
I disturbi dell'andatura, tra cui una diminuzione dell'oscillazione del braccio, una velocità di camminata più lenta e passi più brevi, sono una caratteristica distintiva della malattia di Parkinson e si verificano all'inizio del decorso della malattia 1,5. Nel corso degli anni sono stati sviluppati diversi metodi per osservare e registrare i passi per l'analisi dell'andatura nei modelli di PD dei roditori, con tecniche manuali per quantificare la posizione del calpestio che portano ad approcci automatizzati più sensibili e in grado di catturare parametri dinamici. Alcuni approcci statici prevedono l'"inchiostrazione" delle zampe del roditore con un indicatore da tracciare su supporti posti su una passerella24,25,26. I passi residui vengono successivamente quantificati a mano. Questi metodi sono spesso utilizzati in combinazione con la videoregistrazione per il punteggio cinematico manuale. I metodi autonomi di cattura e quantificazione dei modelli di andatura sono stati introdotti più recentemente15,16 e sono disponibili in commercio. La quantificazione autonoma dell'andatura aggiunge attributi temporali a impronte altrimenti statiche, consentendo ai ricercatori di cercare anomalie attribuite alla velocità e al tempo oltre alla distanza e all'angolo27. La pressione è anche quantificabile se accoppiata con il metodo FTIR.
Anomalie del modello di andatura sono state riportate anche in modelli di ratto indotti da tossine di PD. In particolare, sono stati riportati cambiamenti dell'andatura nel modello di lesione 6-OHDA utilizzando una piattaforma commerciale di analisi dell'andatura28,29,30. L'alterazione più importante in questo modello è stata la diminuzione della velocità e della cadenza di camminata. Inoltre, la piattaforma commerciale di analisi dell'andatura è stata utilizzata per valutare una serie di parametri dinamici e statici dell'andatura dei modelli PD, come l'impatto delle lesioni unilaterali indotte da 6-OHDA e come il trapianto di neuroni dopaminergici salva le alterazioni dell'andatura31. Inoltre, uno studio ha analizzato il rapporto tra i parametri delle lesioni 6-OHDA nei lati feriti rispetto a quelli non danneggiati del cervello, correggendo la velocità in parametri correlati come il ciclo dei passi degli arti posteriori, l'area di stampa degli arti posteriori e la sequenza dei passi, che sono tutti significativamente alterati quando si confrontano diversi tipi di lesioni con i controlli salini32 . Tuttavia, è importante notare che il background patogenetico dei modelli indotti da tossine è di natura tossica piuttosto che un processo neurodegenerativo come nel PD 6 umano, e come tale la valutazione dell'andatura dopo l'induzione della lesione potrebbe imitare il PD avanzato quando i neuroni sonopersi, ma rendere più difficili gli studi sui cambiamenti motori precoci.
La geometria dell'andatura è stata misurata nei ratti Pink1 KO, Parkin KO e DJ-1 KO22, modelli di PD ereditaria, che mostrano una progressiva perdita di neuroni dopaminergici nigrale con l'invecchiamento. L'andatura è stata misurata utilizzando l'apparato commerciale NeuroCube, in cui i ratti sono autorizzati a camminare in cerchio, osservando la geometria e le caratteristiche dinamiche. I ratti KO Pink1 e DJ-1 hanno mostrato una durata più breve in falcata, oscillazione e posizione rispetto a WT a 4 e 8 mesi.
Poiché i sistemi di analisi dell'andatura commerciali sono costosi e dotati di pipeline di analisi proprietarie, abbiamo cercato un'alternativa aperta per il nostro studio dei modelli ereditari di malattia di Parkinson sui ratti. Il sistema MouseWalker14, fornito con istruzioni di costruzione e software ad accesso aperto, acquisisce tutti i parametri delle apparecchiature commerciali progettate per piccoli roditori. Poiché la piattaforma era troppo piccola per ottenere risultati accettabili con ratti adulti, cioè quattro passi ininterrotti durante la locomozione a velocità di camminata, abbiamo ridimensionato l'hardware per accogliere i ratti. Inoltre, abbiamo utilizzato una action cam domestica al posto di una soluzione video commerciale ad alta velocità.
La minore densità di fotogrammi era una potenziale insidia dell'utilizzo di una action cam al posto di una telecamera ad alta velocità. Tuttavia, la soglia di qualità nella videografia domestica è in rapido aumento ed è in grado di registrare a 120 fps in alta risoluzione. Inoltre, la distorsione dell'obiettivo può essere corretta durante la registrazione dal software della fotocamera producendo un campo visivo (FOV) costantemente lineare.
Inizialmente eravamo preoccupati per la dinamica della pressione dell'utilizzo di uno spessore simile di acrilico per la passerella con una base più ampia e animali più pesanti, e la capacità del software di elaborare video di animali più grandi in un FOV più ampio. Ipotizziamo che la gamma di massa tra topi e ratti rientri nella gamma di sensibilità della piattaforma FTIR acrilica che ci consente di misurare i ratti durante il loro intero ciclo di vita. Inoltre, è possibile che la potenziale diluizione dei pixel possa essere compensata dalla maggiore superficie delle impronte delle zampe dei ratti rispetto all'area catturata nel FOV, se c'è qualche differenza significativa. Con una corretta calibrazione, come documentato qui, il software14 disponibile gratuitamente è stato in grado di elaborare il video dell'andatura del ratto come descritto.
Con questo protocollo, siamo stati in grado di dimostrare che il sistema di andatura del topo FTIR14 modificato qui per i ratti può rilevare alterazioni nell'andatura prima dell'osservazione visiva del trascinamento degli arti posteriori nei ratti DKO maschi. Da notare che la compromissione motoria visivamente evidente (trascinamento degli arti posteriori) osservata nei ratti DKO è stata precedentemente riportata nei ratti maschi Pink1 single KO22. Mentre i ratti DKO maschi mostrano un trascinamento degli arti posteriori visivamente osservabile a partire dai 4-6 mesi di età, l'analisi dell'andatura ha scoperto cambiamenti di locomozione a 2 mesi di età. In particolare, sono stati riscontrati cambiamenti nei parametri dell'andatura degli arti posteriori. I ratti DKO mostrano una maggiore velocità di oscillazione degli arti posteriori (sia a sinistra che a destra) e una diminuzione associata della durata dell'oscillazione degli arti posteriori (sia a sinistra che a destra). Inoltre, i ratti DKO posizionano la zampa posteriore sinistra più vicino al loro corpo durante il touchdown della zampa, mentre la zampa posteriore destra è più lontana dal loro corpo durante il decollo della zampa. Mentre non abbiamo scoperto cambiamenti nella durata del passo o della posizione nei ratti DKO a 2 mesi, la durata dello swing era più breve nei ratti DKO come riportato in modo simile nei ratti Pink1 e DJ-1 KO22. Nel complesso, questi cambiamenti suggeriscono che i parametri dell'andatura degli arti posteriori sono alterati prima dello sviluppo del trascinamento degli arti posteriori nei ratti DKO maschi. I futuri studi longitudinali sull'andatura che monitorano lo sviluppo delle alterazioni della locomozione aiuteranno a individuare l'età in cui i cambiamenti dell'andatura diventano significativi.
In questo studio, abbiamo dimostrato che un sistema di andatura del topo FTIR14 modificato qui per lo studio dei ratti può essere utilizzato per distinguere i cambiamenti nei parametri dell'andatura nei ratti DKO maschi di 2 mesi, un modello per PD ereditario, rispetto ai ratti WT di età corrispondente. Studi precedenti in pazienti con PD hanno rivelato una riduzione della lunghezza del passo e un tempo medio di oscillazione inferiore, nonché una maggiore variabilità del tempo di falcata e variabilità del tempo di oscillazione4. Pertanto, i nostri risultati sui cambiamenti nel tempo di oscillazione nei ratti DKO e precedenti segnalazioni di alterazioni del tempo di oscillazione nei ratti Pink1 KO e DJ-1 KO22, sembrano rilevanti per la progressione del PD.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
KS e HF ringraziano la Michael J Fox Foundation for Parkinson's Research per il sostegno al loro lavoro sulla malattia di Parkinson.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum | |||
| 1.5” Aluminum Angle (1/8” - 6063) | Dimensions: 8' Qty: 8 |
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| 1” Aluminum Square Tube (1/16” - 6063) | Dimensions: 8' Qty: 4 |
||
| 32 Gauge Aluminum Sheet | Dimensions: 10' Qty: 1 |
||
| 1” Aluminum Tube (1/8” - 6063) | Dimensions: 8' Qty: 1 |
||
| Acrylic | |||
| 7/32” Clear Acrylic Sheet | Dimensions: 4'x8' Qty: 2 |
||
| 1/8” White Acrylic Sheet 55% (2447) | Dimensions: 4'x8' Qty: 1 |
||
| Mirror | |||
| 7/32” Glass Mirror | Dimensions: 60"x12" Qty: 1 |
||
| LED | |||
| 5050 LED Tape Light (Green) | Dimensions: 16.4' Qty: 1 |
||
| 5050 LED Tape Light (Red) | Dimensions: 16.4' Qty: 1 |
||
| Camera | |||
| GoPro Hero 6 Black | Qty: 1 | ||
| Tripod | Dimensions: 57" Qty: 1 |
References
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