Un modello murino per la pancreatite cronica tramite infusione di TNBS del dotto biliare
Summary
La pancreatite cronica (CP) è una malattia caratterizzata da infiammazione e fibrosi del pancreas, spesso associata a dolori addominali intrattabili. Questo articolo si concentra sul perfezionamento della tecnica per generare un modello murino di CP tramite infusione del dotto biliare con acido 2,4,6 -trinitrobenzene solfonico (TNBS).
Abstract
La pancreatite cronica (CP) è una malattia complessa che coinvolge l’infiammazione pancreatica e la fibrosi, l’atrofia ghiandolare, il dolore addominale e altri sintomi. Diversi modelli di roditori sono stati sviluppati per studiare la CP, di cui il modello di infusione del dotto biliare acido 2,4,6 -trinitrobenzene solfonico (TNBS) replica le caratteristiche del dolore neuropatico osservato nella CP. Tuttavia, l’infusione di farmaci per i dotti biliari nei topi è tecnicamente impegnativa. Questo protocollo dimostra la procedura di infusione di TNBS del dotto biliare per la generazione di un modello murino CP. La TNBS è stata infusa nel pancreas attraverso l’ampolla di Vater nel duodeno. Questo protocollo ha ottimizzato il volume del farmaco, le tecniche chirurgiche e la gestione del farmaco durante la procedura. I topi trattati con TNBS hanno mostrato caratteristiche di CP riflesse da riduzioni del peso corporeo e del pancreas, cambiamenti nei comportamenti associati al dolore e morfologia pancreatica anormale. Con questi miglioramenti, la mortalità associata all’iniezione di TNBS è stata minima. Questa procedura non è solo fondamentale nella generazione di modelli di malattia pancreatica, ma è anche utile nella somministrazione locale di farmaci pancreatici.
Introduction
La pancreatite cronica (CP) è una malattia infiammatoria cronica caratterizzata da atrofia del pancreas, fibrosi, dolore addominale ed eventuale perdita delle funzioni sia esocrine che endocrine1. Gli attuali trattamenti medici e chirurgici non sono curativi ma vengono intrapresi per alleviare i sintomi che sono la conseguenza della malattia: dolore addominale refrattario, disfunzione endocrina ed esocrina. Pertanto, sono urgentemente necessari trattamenti più efficaci2. I modelli animali forniscono uno strumento essenziale per sviluppare una migliore comprensione della malattia e studiare potenziali terapie3. Sono stati sviluppati diversi modelli murini per CP, di cui modelli di ceruleina e/o alcol sono comunemente usati. Ceruleina, un oligopeptide che stimola la secrezione pancreatica, ha dimostrato di indurre in modo riproducibile un modello CP con atrofia pancreatica, fibrosi, tra gli altri4. Un altro modello comune utilizza iniezioni seriali di L-arginina, che produce insufficienza esocrina simile a quella osservata nei pazienti umani5. La CP può anche essere indotta dalla legatura completa o parziale del dotto pancreatico, così come dall’ipertensione del dotto pancreatico6,7. Nonostante la varietà di modelli animali disponibili per CP, nessuno di questi modelli riproduce efficacemente il dolore addominale sperimentato dai pazienti CON CP8.
Studi precedenti hanno dimostrato che l’iniezione pancreatica locale di acido solfonico 2,4,6 -trinitrobenzene (TNBS) replica il dolore persistente sperimentato dai pazienti CON CP9,10,11. I topi trattati con TNBS hanno dimostrato ipersensibilità addominale e aumento dei comportamenti correlati al dolore, nonché una “ipersensibilità generalizzata” agli stimoli dolorosi, un fenomeno che è stato osservato nei pazienti con CP10. Oltre a imitare accuratamente il dolore CP, il modello TNBS replica anche altre caratteristiche patologiche della condizione umana come la fibrosi, l’infiltrazione di cellule mononucleate e la sostituzione delle cellule acinari con tessuto adiposo10,12. Tuttavia, l’infusione di TNBS attraverso il dotto biliare è una procedura tecnicamente impegnativa nei topi che può causare la morte. Per quanto ne sappiamo, non esiste un protocollo visivo per mostrare come viene eseguita l’infusione del dotto biliare. In questo articolo, dimostriamo la procedura dell’infusione di duzione biliare di TNBS per generare un modello murino CP. Questa procedura aiuterà a generare preziosi modelli animali per lo studio della CP e di altre malattie pancreatiche e può essere utilizzata per infondere altri materiali (ad esempio, virus, cellule) nel pancreas13.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’infusione del dotto biliare di TNBS per indurre pancreatite cronica è tecnicamente impegnativa nei topi, poiché fino al 22,5% dei topi può morire entro 3-4 giorni dall’infusione del farmaco10. Qui, questo rapporto ha perfezionato la procedura sulla base di studi precedenti e ha ridotto la mortalità precoce dei topi a <10%. Ad esempio, l'aumento del volume del farmaco (da 35 μL a 50 μL) può garantire che i farmaci raggiungano l'intero pancreas. L'uso di una siringa da insulina e di una dim…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato supportato dal Department of Veterans Affairs (VA-ORD BLR& D Merit I01BX004536) e dal National Institute of Health che concede # 1R01DK105183, DK120394 e DK118529 a HW. Ringraziamo il Dr. Hongju Wu per aver condiviso l’esperienza tecnica.
Materials
| 10% Neutral buffered formalin v/v | Fisher Scientific | 23426796 | |
| Alcohol prep pads, sterile | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Animal Anesthesia system | VetEquip, Inc. | 901806 | |
| Buprenorphine hydrochloride, injection | Par Sterile Products, LLC | NDC 42023-179-05 | |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 0553859A | |
| Ethanol, absolute (200 proof), molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Extra fine Micro Dissecting scissors 4” straight sharp | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5882 | |
| Graefe forceps 4” extra delicate tip | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5136 | |
| Heated pad | Amazon | B07HMKMBKM | |
| Hegar-Baumgartner Needle Holder 5.25” | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-7850 | |
| Insulin syringe with 31-gauge needle | BD | 324909 | |
| Iodine prep pads | Fisher Scientific | 19-027048 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Micro clip applying forceps 5.5” | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5410 | |
| Micro clip, straight strong curved 1x6mm | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5433 | |
| Micro clip, straight, 0.75mm clip width | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5420 | |
| Picrylsulfonic acid solution, TNBS, 1M in H2O | Millipore Sigma | 92822-1ML | |
| Polypropylene Suture 4-0 | Med-Vet International | MV-8683 | |
| Polypropylene Suture 5-0 | Med-Vet International | MV-8661 | |
| Sodium chloride, 0.9% intravenous solution | VWR | 2B1322Q | |
| Surgical drape, sterile | Med-Vet International | DR1826 | |
| Tissue Cassette | Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Von Frey filaments | Bioseb | EB2-VFF |
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