Un modelo de ratón para la pancreatitis crónica a través de la infusión de TNBS del conducto biliar
Summary
La pancreatitis crónica (PC) es una enfermedad caracterizada por inflamación y fibrosis del páncreas, a menudo asociada con dolor abdominal intratable. Este artículo se centra en refinar la técnica para generar un modelo de ratón de CP mediante infusión de conductos biliares con ácido sulfónico trinitrobenceno 2,4,6 (TNBS).
Abstract
La pancreatitis crónica (PC) es una enfermedad compleja que involucra inflamación pancreática y fibrosis, atrofia glandular, dolor abdominal y otros síntomas. Se han desarrollado varios modelos de roedores para estudiar la CP, de los cuales el modelo de infusión de ácido sulfónico trinitrobenceno (TNBS) del conducto biliar 2,4,6 replica las características del dolor neuropático observado en la PC. Sin embargo, la infusión de medicamentos para las vías biliares en ratones es técnicamente desafiante. Este protocolo demuestra el procedimiento de infusión de TNBS de conducto biliar para la generación de un modelo de ratón CP. TNBS se infundió en el páncreas a través de la ampolla de Vater en el duodeno. Este protocolo optimizó el volumen de medicamentos, las técnicas quirúrgicas y el manejo de medicamentos durante el procedimiento. Los ratones tratados con TNBS mostraron características de PC reflejadas por las reducciones de peso corporal y páncreas, los cambios en los comportamientos asociados al dolor y la morfología pancreática anormal. Con estas mejoras, la mortalidad asociada con la inyección de TNBS fue mínima. Este procedimiento no solo es crítico en la generación de modelos de enfermedad pancreática, sino que también es útil en la administración local de medicamentos pancreáticos.
Introduction
La pancreatitis crónica (PC) es una enfermedad inflamatoria crónica caracterizada por la atrofia del páncreas, fibrosis, dolor abdominal y eventual pérdida de las funciones exocrina y endocrina1. Los tratamientos médicos y quirúrgicos actuales no son curativos, sino que se llevan a cabo para aliviar los síntomas que son la consecuencia de la enfermedad: dolor abdominal refractario, disfunción endocrina y exocrina. Por lo tanto, se necesitan urgentemente tratamientos más efectivos2. Los modelos animales proporcionan una herramienta esencial para desarrollar una mejor comprensión de la enfermedad e investigar posibles terapias3. Se han desarrollado múltiples modelos de ratón para PC, de los cuales se utilizan comúnmente modelos de ceruleína y / o alcohol. Se ha demostrado que la ceruleína, un oligopéptido que estimula la secreción pancreática, induce de forma reproducible un modelo de PC con atrofia pancreática, fibrosis, entre otros4. Otro modelo común utiliza inyecciones seriadas de L-arginina, que produce insuficiencia exocrina similar a la observada en pacientes humanos5. La PC también puede ser inducida por ligadura completa o parcial del conducto pancreático, así como por hipertensión del conducto pancreático6,7. A pesar de la variedad de modelos animales disponibles para la PC, ninguno de estos modelos reproduce eficazmente el dolor abdominal experimentado por los pacientes conPC 8.
Estudios previos mostraron que la inyección pancreática local de ácido 2,4,6 -trinitrobenceno sulfónico (TNBS) replica el dolor persistente experimentado por los pacientes con PC9,10,11. Los ratones tratados con TNBS demostraron hipersensibilidad abdominal y un aumento de los comportamientos relacionados con el dolor, así como una “hipersensibilidad generalizada” a los estímulos dolorosos, un fenómeno que se ha observado en pacientes con PC10. Además de imitar con precisión el dolor CP, el modelo TNBS también replica otras características patológicas de la condición humana como la fibrosis, la infiltración de células mononucleares y el reemplazo de células acinares con tejido graso10,12. Sin embargo, la infusión de TNBS a través del conducto biliar es un procedimiento técnicamente desafiante en ratones que puede causar la muerte. Hasta donde sabemos, no existe un protocolo visual que muestre cómo se realiza la infusión de conductos biliares. En este artículo, demostramos el procedimiento de la infusión de ducción biliar de TNBS para generar un modelo de ratón CP. Este procedimiento ayudará a generar valiosos modelos animales para el estudio de la PC y otras enfermedades pancreáticas y se puede utilizar para infundir otros materiales (por ejemplo, virus, células) en el páncreas13.
Protocol
Representative Results
Discussion
La infusión de TNBS en las vías biliares para inducir pancreatitis crónica es técnicamente un desafío en ratones, ya que hasta el 22,5% de los ratones pueden morir dentro de los 3-4 días posteriores a la infusión del medicamento10. Aquí, este informe refinó el procedimiento basado en estudios previos y redujo la mortalidad temprana de ratones a <10%. Por ejemplo, el aumento del volumen de medicamentos (de 35 μL a 50 μL) puede garantizar que los medicamentos lleguen a todo el páncreas. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por el Departamento de Asuntos de Veteranos (VA-ORD BLR & D Merit I01BX004536), y el Instituto Nacional de Salud otorga subvenciones # 1R01DK105183, DK120394 y DK118529 a HW. Agradecemos al Dr. Hongju Wu por compartir experiencias técnicas.
Materials
| 10% Neutral buffered formalin v/v | Fisher Scientific | 23426796 | |
| Alcohol prep pads, sterile | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Animal Anesthesia system | VetEquip, Inc. | 901806 | |
| Buprenorphine hydrochloride, injection | Par Sterile Products, LLC | NDC 42023-179-05 | |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 0553859A | |
| Ethanol, absolute (200 proof), molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Extra fine Micro Dissecting scissors 4” straight sharp | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5882 | |
| Graefe forceps 4” extra delicate tip | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5136 | |
| Heated pad | Amazon | B07HMKMBKM | |
| Hegar-Baumgartner Needle Holder 5.25” | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-7850 | |
| Insulin syringe with 31-gauge needle | BD | 324909 | |
| Iodine prep pads | Fisher Scientific | 19-027048 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Micro clip applying forceps 5.5” | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5410 | |
| Micro clip, straight strong curved 1x6mm | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5433 | |
| Micro clip, straight, 0.75mm clip width | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5420 | |
| Picrylsulfonic acid solution, TNBS, 1M in H2O | Millipore Sigma | 92822-1ML | |
| Polypropylene Suture 4-0 | Med-Vet International | MV-8683 | |
| Polypropylene Suture 5-0 | Med-Vet International | MV-8661 | |
| Sodium chloride, 0.9% intravenous solution | VWR | 2B1322Q | |
| Surgical drape, sterile | Med-Vet International | DR1826 | |
| Tissue Cassette | Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Von Frey filaments | Bioseb | EB2-VFF |
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