Großtechnische Herstellung von Exosomen aus der Synovialflüssigkeit mesenchymaler Stammzellen durch 3D-Bioreaktorkultur

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Herstellung einer großen Anzahl von GMP-konformen Exosomen aus mesenchymalen Stammzellen der Synovialflüssigkeit unter Verwendung eines 3D-Bioreaktors.

Abstract

Exosomen, die von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) abgesondert werden, wurden als vielversprechende Kandidaten für Knorpelverletzungen und die Behandlung von Arthrose vorgeschlagen. Exosomen für die klinische Anwendung erfordern eine großtechnische Produktion. Zu diesem Zweck wurden humane Synovialflüssigkeits-MSCs (hSF-MSCs) auf Mikroträgerperlen gezüchtet und dann in einem dynamischen dreidimensionalen (3D) Kultursystem kultiviert. Durch die Verwendung einer dynamischen 3D-Kultur gelang es diesem Protokoll, großräumige Exosomen aus SF-MSC-Kulturüberständen zu erhalten. Exosomen wurden durch Ultrazentrifugation geerntet und durch ein Transmissionselektronenmikroskop, Nanopartikel-Transmissionsassay und Western Blotting verifiziert. Auch die mikrobiologische Sicherheit von Exosomen wurde nachgewiesen. Die Ergebnisse des Exosomennachweises deuten darauf hin, dass dieser Ansatz eine große Anzahl von GMP-Exosomen (Good Manufacturing Practices) hervorbringen kann. Diese Exosomen könnten in der Exosomenbiologie und der klinischen Arthrosebehandlung verwendet werden.

Introduction

Osteoarthritis (OA), die aus Gelenkknorpel und darunterliegendem Knochenabbau resultiert, bleibt eine schwere Herausforderung, die zu Behinderungen führt ^1,2. Ohne Blut- und Nervenversorgung ist die Selbstheilungsfähigkeit des Knorpels minimal, sobald er verletzt ist ^3,4. In den letzten Jahrzehnten haben Therapien, die auf autologer Chondrozytenimplantation (ACI) basieren, einige Fortschritte in der OA-Behandlung gemacht⁵. Für die Isolierung und Expansion von Chondrozyten ist die Ernte kleiner Knorpel aus dem nicht belastenden Bereich des OA-Gelenks erforderlich, was zu Verletzungen des Knorpels führt. Außerdem erfordert das Verfahren eine zweite Operation, um die expandierten Chondrozyten zu implantieren⁶. Daher werden einstufige Therapien für die OA-Behandlung ohne Knorpelverletzungen intensiv erforscht.

Mesenchymale Stammzellen (MSCs) wurden als vielversprechende Alternativen für die OA-Behandlung vorgeschlagen ^7,8. MSCs stammen aus mehreren Geweben und können sich mit spezifischer Stimulation in Chondrozyten differenzieren. Wichtig ist, dass MSCs Immunantworten über entzündungshemmende Mittel modulieren können⁹. Daher haben MSCs signifikante Vorteile bei der OA-Behandlung, indem sie Knorpeldefekte reparieren und die Immunantwort modulieren, insbesondere im Entzündungsmilieu. Für die OA-Behandlung haben MSCs aus Synovialflüssigkeit (SF-MSCs) in letzter Zeit aufgrund ihrer stärkeren Chondrozytendifferenzierungsfähigkeit als andere MSC-Quellen viel Aufmerksamkeit erregt^10,11. Insbesondere in der orthopädischen Klinik ist die Extraktion von entzündlicher SF aus der Gelenkhöhle eine Routinetherapie zur Linderung der Schmerzsymptome von OA-Patienten. Extrahierte entzündliche SF wird normalerweise als medizinischer Abfall entsorgt. Sowohl Patienten als auch Ärzte sind bereit, autologe MSCs, die aus der entzündlichen SF isoliert wurden, als OA-Behandlung mit sehr wenigen ethischen Konflikten in Betracht zu ziehen. Die SF-MSC-Therapie ist jedoch aufgrund von tumorigenen Risiken, Langzeitlagerung und entfernten Transportbarrieren beeinträchtigt.

Exosomen, die von vielen Zelltypen, einschließlich MSCs, sezerniert werden, tragen die meisten Bioinformationen der Elternzelle. Es wurde eingehend als zellfreie Therapie^{untersucht 12,13}. Laut den aktualisierten Ressourcen, die auf der Website der Regierung für klinische Studien (ClinicalTrials.gov) verfügbar sind, werden umfangreichere klinische Exosomenstudien in den Forschungsbereichen Krebs, Bluthochdruck und neurodegenerative Erkrankungen initiiert und durchgeführt. Die SF-MSC-Exosomenbehandlung könnte eine aufregende und herausfordernde Studie sein, um mit OA fertig zu werden. Good Manufacturing Practice (GMP)-Qualität und großflächige Exosomenproduktion sind für die klinische Translation unerlässlich. Die Exosomenisolierung in kleinem Maßstab wurde auf der Grundlage einer zweidimensionalen (2D) Zellkultur durchgeführt. Großflächige Exosomenproduktionsstrategien müssen jedoch optimiert werden. In dieser Studie wurde eine groß angelegte Exosomenherstellungsmethode entwickelt, die auf einer massiven SF-MSC-Kultur unter xenofreien Bedingungen basiert. Nach Ultrazentrifugation aus Zellkulturüberständen wurden die Sicherheit und Funktion von Exosomen validiert.

Protocol

Diese Studie wurde vom Human Ethics Committee des Shenzhen Second People’s Hospital genehmigt. Ein schematisches Diagramm der aus hSF-MSCs isolierten Exosomen im vitro-Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt. 1. Kultur und Identifikation menschlicher SF-MSCs Ernten Sie 20 ml SF mit einer Spritze und Nadel von klinischen OA-Patienten.Desinfizieren Sie das Kniegelenk des OA-Patienten. Punktion von der Quadrizeps femoris-S…

Representative Results

Die Durchflusszytometrie wurde verwendet, um die Oberflächenmarker von SF-MSCs gemäß den von der Internationalen Gesellschaft für Zelltherapie14,15 empfohlenen Mindestkriterien zur Definition humaner MSCs zu identifizieren. Die Durchflusszytometrie-Analyse ergab, dass SF-MSCs, die in dieser Studie kultiviert wurden, die Identifizierungskriterien von MSCs erfüllten. Sie waren negativ für CD34, CD45 und HLA-DR (unter 3%) und positiv für CD73, CD90 und CD105 …

Discussion

Die mesenchymalen Stammzellen sind in der regenerativen Medizin aufgrund ihrer Selbsterneuerung, differenziert in Gewebezellen mit spezialisierten Funktionen und parakrinen Effekten weit verbreitet^16,17. Insbesondere die parakrinen Wirkungen von Exosomen haben viel Aufmerksamkeit erregt¹⁸. Exosomen tragen die Bioinformationen von MSCs und erfüllen ihre biologische Funktion und überwinden MSC-Mängel wie lästige Lagerung und Transport. S…

Materials

BCA assay kit	ThermoFisher	23227	Protein concentration assay
Blood agar plate	Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.	P0903	Bacteria culture
CD105 antibody	Elabscience	E-AB-F1243C	Flow cytometry
CD34 antibody	Elabscience	E-AB-F1143C	Flow cytometry
CD45 antibody	BD Bioscience	555483	Flow cytometry
CD63 antibody	Abclonal	A5271	Western blotting
CD73 antibody	Elabscience	E-AB-F1242C	Flow cytometry
CD81 antibody	ABclonal	A5270	Western blotting
CD9 antibody	Abclonal	A1703	Western blotting
CD90 antibody	Elabscience	E-AB-F1167C	Flow cytometry
Centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5810R
CO2 incubator	Thermo		Cell culture
Confocal laser scanning fluorescence microscopy	ZEISS	LSM 800
Cytodex	GE Healthcare		Microcarrier
Dil	ThermoFisher	D1556	Exosome label
EZ-PCR Mycoplasma detection kit	BI	20-700-20	Mycoplasma detection
Flowcytometry	Beckman		MSC identification
Gene Pulser II System	Bio-Rad Laboratories	1652660	Gene transfection
GraphPad Prism 8.0.2	GraphPad Software, Inc.	Version 8.0.2
HLA-DR antibody	Elabscience	E-AB-F1111C	Flow cytometry
Lowenstein-Jensen culture medium	Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd.	T0573	Mycobacterium tuberculosis culture
MesenGro	StemRD	MGro-500	MSC culture
Nanosight NS300	Malvern	Nanosight NS300	Nanoparticle tracking analysis
NTA 2.3 software	Malvern		Data analysis
Odyssey FC	Gene Company Limited		Fluorescent western blotting
OptiPrep electroporation buffer	Sigma	D3911	Gene transfection
Protease inhibitors cocktail	Sigma	P8340	Proteinase inhibitor
RNase A	Qiagen	158924	Removal of RNA
Sabouraud agar plate	Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.	P0919	Fungi culture
TEM		JEM-1200EX
The Rotary Cell Culture System (RCCS)	Synthecon	RCCS-4HD	3D culture
Ultracentrifuge	Beckman	Optima XPN-100	Exosome centrifuge