Aquí, presentamos un protocolo para producir un gran número de exosomas de grado GMP a partir de células madre mesenquimales del líquido sinovial utilizando un biorreactor 3D.
Los exosomas secretados por las células madre mesenquimales (MSC) se han sugerido como candidatos prometedores para las lesiones del cartílago y el tratamiento de la osteoartritis. Los exosomas para aplicación clínica requieren una producción a gran escala. Con este objetivo, las MSC de líquido sinovial humano (hSF-MSC) se cultivaron en perlas de microportadores y luego se cultivaron en un sistema de cultivo dinámico de tres dimensiones (3D). Mediante la utilización de la cultura dinámica 3D, este protocolo obtuvo con éxito exosomas a gran escala a partir de sobrenadantes de cultivo SF-MSC. Los exosomas se cosecharon por ultracentrifugación y se verificaron mediante un microscopio electrónico de transmisión, un ensayo de transmisión de nanopartículas y Western blotting. Además, se detectó la seguridad microbiológica de los exosomas. Los resultados de la detección de exosomas sugieren que este enfoque puede producir un gran número de exosomas de grado de buenas prácticas de fabricación (GMP). Estos exosomas podrían utilizarse en la investigación de la biología de exosomas y el tratamiento clínico de la osteoartritis.
La osteoartritis (OA), resultante del cartílago articular y la descomposición ósea subyacente, sigue siendo un desafío grave que conduce a la discapacidad 1,2. Sin suministro de sangre y nervios, la capacidad de autocuración del cartílago es mínima una vez lesionado 3,4. En las últimas décadas, las terapias basadas en la implantación autóloga de condrocitos (ACI) han progresado en el tratamiento de la OA5. Para el aislamiento y la expansión de los condrocitos, es necesario extraer cartílago pequeño del área que no soporta peso de la articulación OA, causando lesiones en el cartílago. Además, el procedimiento requerirá una segunda operación para implantar los condrocitos expandidos6. Por lo tanto, las terapias de un solo paso para el tratamiento de la OA sin lesiones del cartílago están bajo una exploración exhaustiva.
Las células madre mesenquimales (CMM) han sido sugeridas como alternativas prometedoras para el tratamiento de la OA 7,8. Originadas en múltiples tejidos, las MSC pueden diferenciarse en condrocitos con estimulación específica. Es importante destacar que las MSC pueden modular las respuestas inmunes a través de la antiinflamación9. Por lo tanto, las MSC tienen ventajas significativas en el tratamiento de la OA al reparar defectos del cartílago y modular la respuesta inmune, especialmente en el entorno inflamatorio. Para el tratamiento de la OA, las MSC del líquido sinovial (SF-MSC) han atraído recientemente mucha atención debido a su capacidad de diferenciación de condrocitos más fuerte que otras fuentes de MSC10,11. En particular, en la clínica ortopédica, la extracción de SF inflamatorio de la cavidad articular es una terapia de rutina para aliviar el síntoma de dolor de los pacientes con OA. El SF inflamatorio extraído generalmente se elimina como desechos médicos. Tanto los pacientes como los médicos están listos para considerar las CMM autólogas aisladas del SF inflamatorio como tratamiento de OA con muy pocos conflictos éticos. Sin embargo, la terapia SF-MSC se ve comprometida debido a los riesgos tumorigénicos, el almacenamiento prolongado y las barreras de envío distantes.
Los exosomas, secretados por muchos tipos de células, incluidas las MSC, llevan la mayor parte de la bioinformación de las células madre. Ha sido investigado en profundidad como terapia libre de células12,13. De acuerdo con los recursos actualizados disponibles en el sitio web del gobierno de ensayos clínicos (ClinicalTrials.gov), se inician y realizan estudios clínicos de exosomas más extensos en los campos de investigación del cáncer, la hipertensión y las enfermedades neurodegenerativas. El tratamiento con exosomas SF-MSC podría ser un ensayo emocionante y desafiante para hacer frente a la OA. La producción de exosomas a gran escala y de grado de buenas prácticas de fabricación (GMP) es esencial para la traducción clínica. El aislamiento de exosomas a pequeña escala se ha realizado ampliamente en base al cultivo celular bidimensional (2D). Sin embargo, las estrategias de producción de exosomas a gran escala necesitan optimización. En este estudio se desarrolló un método de fabricación de exosomas a gran escala, basado en el cultivo masivo de SF-MSC en condiciones libres de xeno. Después de la ultracentrifugación de sobrenadantes de cultivo celular, se validó la seguridad y la función del exosoma.
Las células madre mesenquimales han sido ampliamente utilizadas en medicina regenerativa debido a su autorrenovación, diferenciadas en células tisulares con funciones especializadas y efectos paracrinos16,17. Cabe destacar que los efectos paracrinos ejercidos por los exosomas han atraído mucha atención18. Los exosomas transportan la bioinformación de las MSC y realizan su función biológica y superan las deficiencias de MSC, como el…
The authors have nothing to disclose.
Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81972116, Nº 81972085, Nº 81772394); Programa clave de la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Guangdong (No.2018B0303110003); Proyecto de Cooperación Internacional de Guangdong (No.2021A0505030011); Proyectos de Ciencia y Tecnología de Shenzhen (No. GJHZ20200731095606019, No. JCYJ20170817172023838, No. JCYJ20170306092215436, No. JCYJ20170413161649437); Fundación de Ciencias Postdoctorales de China (No.2020M682907); Fundación de Investigación Básica y Aplicada de Guangdong (No.2021A1515010985); Proyecto Sanming de Medicina en Shenzhen (SZSM201612079); Fondos especiales para la construcción de hospitales de alto nivel en la provincia de Guangdong.
BCA assay kit | ThermoFisher | 23227 | Protein concentration assay |
Blood agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | P0903 | Bacteria culture |
CD105 antibody | Elabscience | E-AB-F1243C | Flow cytometry |
CD34 antibody | Elabscience | E-AB-F1143C | Flow cytometry |
CD45 antibody | BD Bioscience | 555483 | Flow cytometry |
CD63 antibody | Abclonal | A5271 | Western blotting |
CD73 antibody | Elabscience | E-AB-F1242C | Flow cytometry |
CD81 antibody | ABclonal | A5270 | Western blotting |
CD9 antibody | Abclonal | A1703 | Western blotting |
CD90 antibody | Elabscience | E-AB-F1167C | Flow cytometry |
Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
Confocal laser scanning fluorescence microscopy | ZEISS | LSM 800 | |
Cytodex | GE Healthcare | Microcarrier | |
Dil | ThermoFisher | D1556 | Exosome label |
EZ-PCR Mycoplasma detection kit | BI | 20-700-20 | Mycoplasma detection |
Flowcytometry | Beckman | MSC identification | |
Gene Pulser II System | Bio-Rad Laboratories | 1652660 | Gene transfection |
GraphPad Prism 8.0.2 | GraphPad Software, Inc. | Version 8.0.2 | |
HLA-DR antibody | Elabscience | E-AB-F1111C | Flow cytometry |
Lowenstein-Jensen culture medium | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | T0573 | Mycobacterium tuberculosis culture |
MesenGro | StemRD | MGro-500 | MSC culture |
Nanosight NS300 | Malvern | Nanosight NS300 | Nanoparticle tracking analysis |
NTA 2.3 software | Malvern | Data analysis | |
Odyssey FC | Gene Company Limited | Fluorescent western blotting | |
OptiPrep electroporation buffer | Sigma | D3911 | Gene transfection |
Protease inhibitors cocktail | Sigma | P8340 | Proteinase inhibitor |
RNase A | Qiagen | 158924 | Removal of RNA |
Sabouraud agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd. | P0919 | Fungi culture |
TEM | JEM-1200EX | ||
The Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-4HD | 3D culture |
Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |