Preparação em larga escala de exossomos derivados de células-tronco mesenquimais do líquido sinovial por cultura de biorreator 3D
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para produzir um grande número de exossomos de grau GMP a partir de células-tronco mesenquimais do líquido sinovial usando um biorreator 3D.
Abstract
Exossomos secretados por células-tronco mesenquimais (CTMs) têm sido sugeridos como candidatos promissores para lesões cartilaginosas e tratamento da osteoartrite. Exossomos para aplicação clínica requerem produção em larga escala. Para esse fim, as MSCs do líquido sinovial humano (hSF-MSCs) foram cultivadas em esferas de microcarreador e, em seguida, cultivadas em um sistema de cultura tridimensional dinâmico (3D). Através da utilização da cultura dinâmica 3D, este protocolo obteve com sucesso exossomos em larga escala de sobrenadantes da cultura SF-MSC. Os exossomos foram colhidos por ultracentrifugação e verificados por microscópio eletrônico de transmissão, ensaio de transmissão de nanopartículas e western blotting. Além disso, a segurança microbiológica dos exossomos foi detectada. Os resultados da detecção de exossomos sugerem que essa abordagem pode produzir um grande número de exossomos de boas práticas de fabricação (BPF). Esses exossomos podem ser utilizados em pesquisas de biologia de exossomos e tratamento clínico da osteoartrite.
Introduction
A osteoartrite (OA), resultante da cartilagem articular e da degradação óssea subjacente, continua sendo um desafio grave que leva à incapacidade 1,2. Sem suprimento de sangue e nervos, a capacidade de auto-cicatrização da cartilagem é mínima uma vez lesada 3,4. Nas últimas décadas, terapias baseadas no implante autólogo de condrócitos (ACI) têm feito alguns progressos no tratamento da OA5. Para o isolamento e expansão dos condrócitos, é necessária a colheita de pequenas cartilagens da área de suporte de peso da articulação OA, causando lesões na cartilagem. Além disso, o procedimento exigirá uma segunda operação para implantar os condrócitos expandidos6. Assim, terapias de uma etapa para o tratamento da OA sem lesões cartilaginosas estão sob extensa exploração.
As células-tronco mesenquimais (CTMs) têm sido sugeridas como alternativas promissoras para o tratamento da OA 7,8. Originárias de múltiplos tecidos, as CTMs podem se diferenciar em condrócitos com estimulação específica. É importante ressaltar que as CTMs podem modular as respostas imunes por meio da anti-inflamação9. Portanto, as MSCs possuem vantagens significativas no tratamento da OA, reparando defeitos da cartilagem e modulando a resposta imune, especialmente no meio inflamatório. Para o tratamento da OA, as CTMs do líquido sinovial (SF-MSCs) têm atraído recentemente muita atenção devido à sua maior capacidade de diferenciação de condrócitos do que outras fontes deCTMs 10,11. Notavelmente, na clínica ortopédica, a extração de SF inflamatória da cavidade articular é uma terapia de rotina para aliviar o sintoma de dor de pacientes com OA. A SF inflamatória extraída geralmente é descartada como resíduo médico. Tanto os pacientes quanto os médicos estão prontos para considerar as CTMs autólogas isoladas da SF inflamatória como tratamento da OA com muito poucos conflitos éticos. No entanto, a terapia SF-MSC está comprometida devido a riscos tumorigênicos, armazenamento de longo prazo e barreiras de remessa distantes.
Os exossomos, secretados por muitos tipos de células, incluindo MSCs, carregam a maior parte da bioinformação da célula-mãe. Tem sido investigada em profundidade como terapia livre de células12,13. De acordo com os recursos atualizados disponíveis no site do governo de ensaios clínicos (ClinicalTrials.gov), estudos clínicos exossômicos mais extensos são iniciados e realizados nos campos de pesquisa de câncer, hipertensão e doenças neurodegenerativas. O tratamento com exossomos SF-MSC pode ser um estudo empolgante e desafiador para lidar com a OA. A produção de exossomos de boas práticas de fabrico (BPF) e de exossomas em larga escala é essencial para a tradução clínica. O isolamento exossomático em pequena escala tem sido amplamente realizado com base em cultura de células bidimensionais (2D). No entanto, as estratégias de produção de exossomos em larga escala precisam de otimização. Um método de fabricação de exossomos em larga escala foi desenvolvido neste estudo, baseado na cultura maciça de SF-MSC em condições livres de xeno. Após a ultracentrifugação de sobrenadantes de cultura celular, a segurança e a função do exossomo foram validadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
As células-tronco mesenquimais têm sido amplamente utilizadas na medicina regenerativa devido à sua auto-renovação, diferenciadas em células teciduais com funções especializadas e efeitos parácrinos16,17. Notavelmente, os efeitos parácrinos exercidos pelos exossomos têm atraído muita atenção18. Os exossomos carregam a bioinformação das MSCs e desempenham sua função biológica e superam as deficiências das MSC, como armaz…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No. 81972116, No. 81972085, No. 81772394); Programa Chave da Fundação de Ciências Naturais da Província de Guangdong (No.2018B0303110003); Projecto de Cooperação Internacional de Guangdong (No.2021A0505030011); Projetos de Ciência e Tecnologia de Shenzhen (No. GJHZ20200731095606019, Não. JCYJ20170817172023838, Não. JCYJ20170306092215436, Não. JCYJ20170413161649437); Fundação de Ciência de Pós-Doutorado da China (No.2020M682907); Fundação de Investigação Básica e Aplicada de Guangdong (No.2021A1515010985); Projeto Sanming de Medicina em Shenzhen (SZSM201612079); Fundos Especiais para a Construção de Hospitais de Alto Nível na Província de Guangdong.
Materials
| BCA assay kit | ThermoFisher | 23227 | Protein concentration assay |
| Blood agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | P0903 | Bacteria culture |
| CD105 antibody | Elabscience | E-AB-F1243C | Flow cytometry |
| CD34 antibody | Elabscience | E-AB-F1143C | Flow cytometry |
| CD45 antibody | BD Bioscience | 555483 | Flow cytometry |
| CD63 antibody | Abclonal | A5271 | Western blotting |
| CD73 antibody | Elabscience | E-AB-F1242C | Flow cytometry |
| CD81 antibody | ABclonal | A5270 | Western blotting |
| CD9 antibody | Abclonal | A1703 | Western blotting |
| CD90 antibody | Elabscience | E-AB-F1167C | Flow cytometry |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
| CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
| Confocal laser scanning fluorescence microscopy | ZEISS | LSM 800 | |
| Cytodex | GE Healthcare | Microcarrier | |
| Dil | ThermoFisher | D1556 | Exosome label |
| EZ-PCR Mycoplasma detection kit | BI | 20-700-20 | Mycoplasma detection |
| Flowcytometry | Beckman | MSC identification | |
| Gene Pulser II System | Bio-Rad Laboratories | 1652660 | Gene transfection |
| GraphPad Prism 8.0.2 | GraphPad Software, Inc. | Version 8.0.2 | |
| HLA-DR antibody | Elabscience | E-AB-F1111C | Flow cytometry |
| Lowenstein-Jensen culture medium | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | T0573 | Mycobacterium tuberculosis culture |
| MesenGro | StemRD | MGro-500 | MSC culture |
| Nanosight NS300 | Malvern | Nanosight NS300 | Nanoparticle tracking analysis |
| NTA 2.3 software | Malvern | Data analysis | |
| Odyssey FC | Gene Company Limited | Fluorescent western blotting | |
| OptiPrep electroporation buffer | Sigma | D3911 | Gene transfection |
| Protease inhibitors cocktail | Sigma | P8340 | Proteinase inhibitor |
| RNase A | Qiagen | 158924 | Removal of RNA |
| Sabouraud agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd. | P0919 | Fungi culture |
| TEM | JEM-1200EX | ||
| The Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-4HD | 3D culture |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |
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