Her præsenterer vi en protokol til fremstilling af et stort antal GMP-grade exosomer fra synovialvæskemesenkymale stamceller ved hjælp af en 3D-bioreaktor.
Exosomer udskilt af mesenkymale stamceller (MSC’er) er blevet foreslået som lovende kandidater til bruskskader og slidgigtbehandling. Exosomer til klinisk anvendelse kræver produktion i stor skala. Til dette formål blev humane synovialvæske MSC’er (hSF-MSC’er) dyrket på mikrocarrierperler og derefter dyrket i et dynamisk tredimensionelt (3D) kultursystem. Ved at bruge 3D-dynamisk kultur opnåede denne protokol med succes store exosomer fra SF-MSC-kultursupernatanter. Exosomer blev høstet ved ultracentrifugering og verificeret af et transmissionselektronmikroskop, nanopartikeltransmissionsanalyse og western blotting. Også den mikrobiologiske sikkerhed af exosomer blev detekteret. Resultater af exosomdetektion tyder på, at denne tilgang kan producere et stort antal exosomer af god fremstillingspraksis (GMP) kvalitet. Disse exosomer kunne anvendes i exosombiologi forskning og klinisk slidgigt behandling.
Slidgigt (OA), der skyldes ledbrusk og underliggende knoglenedbrydning, er fortsat en alvorlig udfordring, der fører til handicap 1,2. Uden blod og nerveforsyning er brusk selvhelbredende evne minimal, når man først er blevet skadet 3,4. I de sidste årtier har terapier baseret på autolog chondrocytimplantation (ACI) gjort nogle fremskridt i OA-behandling5. For chondrocytisolering og ekspansion er det nødvendigt at høste lille brusk fra OA-leddets ikke-vægtbærende område, hvilket forårsager skader på brusk. Proceduren vil også kræve en anden operation for at implantere de ekspanderede kondrocytter6. Således er et-trins terapier til OA-behandling uden bruskskader under omfattende udforskning.
Mesenkymale stamceller (MSC’er) er blevet foreslået som lovende alternativer til OA-behandling 7,8. MSC’er stammer fra flere væv og kan differentiere sig til kondrocytter med specifik stimulering. Det er vigtigt, at MSC’er kan modulere immunresponser via anti-inflammation9. Derfor har MSC’er betydelige fordele ved OA-behandling ved at reparere bruskdefekter og modulere immunresponset, især i inflammationsmiljøet. Til OA-behandling har MSC’er fra synovialvæske (SF-MSC’er) for nylig tiltrukket sig stor opmærksomhed på grund af deres stærkere chondrocytdifferentieringsevne end andre MSC-kilder10,11. Især på ortopædisk klinik er ekstraktionen af inflammatorisk SF fra ledhulen en rutinemæssig terapi for at lindre smertesymptomet hos OA-patienter. Ekstraheret inflammatorisk SF bortskaffes normalt som medicinsk affald. Både patienter og læger er klar til at betragte autologe MSC’er isoleret fra den inflammatoriske SF som OA-behandling med meget få etiske konflikter. Imidlertid er SF-MSC-terapi kompromitteret på grund af tumorfremkaldende risici, langvarig opbevaring og fjerne forsendelsesbarrierer.
Exosomer, der udskilles af mange celletyper, herunder MSC’er, bærer det meste af forældrecellens bioinformation. Det er blevet undersøgt i dybden som en cellefri terapi12,13. Ifølge de opdaterede ressourcer, der er tilgængelige på webstedet for klinisk forsøgsregering (ClinicalTrials.gov), indledes og gennemføres mere omfattende exosome kliniske undersøgelser inden for forskningsområderne kræft, hypertension og neurodegenerative sygdomme. SF-MSC exosome-behandling kan være et spændende og udfordrende forsøg til at klare OA. God fremstillingspraksis (GMP) og storstilet exosomproduktion er afgørende for klinisk oversættelse. Exosomisolering i lille skala er blevet udført bredt baseret på todimensionel (2D) cellekultur. Imidlertid skal store exosomproduktionsstrategier optimeres. En storstilet exosomfremstillingsmetode blev udviklet i denne undersøgelse baseret på massiv SF-MSC-kultur under xeno-fri forhold. Efter ultracentrifugering fra cellekultursupernatanter blev exosomsikkerhed og funktion valideret.
De mesenkymale stamceller er blevet meget udbredt i regenerativ medicin på grund af deres selvfornyelse, differentieret til vævsceller med specialiserede funktioner og parakrine virkninger16,17. Især har de parakrine virkninger, der udøves af exosomer, tiltrukket sig stor opmærksomhed18. Exosomer bærer bioinformation fra MSC’er og udfører deres biologiske funktion og overvinder MSC-mangler, såsom besværlig opbevaring og forsendels…
The authors have nothing to disclose.
National Natural Science Foundation of China (nr. 81972116, nr. 81972085, nr. 81772394); Nøgleprogram for naturvidenskabsfonden i Guangdong-provinsen (nr. 2018B0303110003); Guangdong internationalt samarbejdsprojekt (nr. 2021A0505030011); Shenzhen videnskabs- og teknologiprojekter (nr. GJHZ20200731095606019, nr. JCYJ20170817172023838, nr. JCYJ20170306092215436, nr. JCYJ20170413161649437); Kina Postdoctoral Science Foundation (nr. 2020M682907); Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (nr. 2021A1515010985); Sanming Projekt af Medicin i Shenzhen (SZSM201612079); Særlige midler til opførelse af hospitaler på højt niveau i Guangdong-provinsen.
BCA assay kit | ThermoFisher | 23227 | Protein concentration assay |
Blood agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | P0903 | Bacteria culture |
CD105 antibody | Elabscience | E-AB-F1243C | Flow cytometry |
CD34 antibody | Elabscience | E-AB-F1143C | Flow cytometry |
CD45 antibody | BD Bioscience | 555483 | Flow cytometry |
CD63 antibody | Abclonal | A5271 | Western blotting |
CD73 antibody | Elabscience | E-AB-F1242C | Flow cytometry |
CD81 antibody | ABclonal | A5270 | Western blotting |
CD9 antibody | Abclonal | A1703 | Western blotting |
CD90 antibody | Elabscience | E-AB-F1167C | Flow cytometry |
Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
Confocal laser scanning fluorescence microscopy | ZEISS | LSM 800 | |
Cytodex | GE Healthcare | Microcarrier | |
Dil | ThermoFisher | D1556 | Exosome label |
EZ-PCR Mycoplasma detection kit | BI | 20-700-20 | Mycoplasma detection |
Flowcytometry | Beckman | MSC identification | |
Gene Pulser II System | Bio-Rad Laboratories | 1652660 | Gene transfection |
GraphPad Prism 8.0.2 | GraphPad Software, Inc. | Version 8.0.2 | |
HLA-DR antibody | Elabscience | E-AB-F1111C | Flow cytometry |
Lowenstein-Jensen culture medium | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | T0573 | Mycobacterium tuberculosis culture |
MesenGro | StemRD | MGro-500 | MSC culture |
Nanosight NS300 | Malvern | Nanosight NS300 | Nanoparticle tracking analysis |
NTA 2.3 software | Malvern | Data analysis | |
Odyssey FC | Gene Company Limited | Fluorescent western blotting | |
OptiPrep electroporation buffer | Sigma | D3911 | Gene transfection |
Protease inhibitors cocktail | Sigma | P8340 | Proteinase inhibitor |
RNase A | Qiagen | 158924 | Removal of RNA |
Sabouraud agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd. | P0919 | Fungi culture |
TEM | JEM-1200EX | ||
The Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-4HD | 3D culture |
Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |