3 डी बायोरिएक्टर कल्चर द्वारा श्लेष द्रव मेसेनकाइमल स्टेम सेल-व्युत्पन्न एक्सोसोम की बड़े पैमाने पर तैयारी
Summary
यहां, हम 3 डी बायोरिएक्टर का उपयोग करके श्लेष द्रव मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं से बड़ी संख्या में जीएमपी-ग्रेड एक्सोसोम का उत्पादन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं (एमएससी) द्वारा स्रावित एक्सोसोम को उपास्थि की चोटों और पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस उपचार के लिए आशाजनक उम्मीदवारों के रूप में सुझाया गया है। नैदानिक अनुप्रयोग के लिए एक्सोसोम को बड़े पैमाने पर उत्पादन की आवश्यकता होती है। इस उद्देश्य के लिए, मानव श्लेष द्रव एमएससी (एचएसएफ-एमएससी) को माइक्रोकैरियर मोतियों पर उगाया गया था, और फिर एक गतिशील तीन-आयाम (3 डी) संस्कृति प्रणाली में सुसंस्कृत किया गया था। 3 डी गतिशील संस्कृति का उपयोग करने के माध्यम से, इस प्रोटोकॉल ने सफलतापूर्वक एसएफ-एमएससी संस्कृति सुपरनैटेंट से बड़े पैमाने पर एक्सोसोम प्राप्त किए। एक्सोसोम को अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा काटा गया था और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप, नैनोपार्टिकल ट्रांसमिशन परख और पश्चिमी सोख्ता द्वारा सत्यापित किया गया था। इसके अलावा, एक्सोसोम की सूक्ष्मजीवविज्ञानी सुरक्षा का पता लगाया गया था। एक्सोसोम का पता लगाने के परिणाम बताते हैं कि यह दृष्टिकोण बड़ी संख्या में अच्छी विनिर्माण प्रथाओं (जीएमपी) ग्रेड एक्सोसोम का उत्पादन कर सकता है। इन एक्सोसोम का उपयोग एक्सोसोम जीव विज्ञान अनुसंधान और नैदानिक पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस उपचार में किया जा सकता है।
Introduction
ऑस्टियोआर्थराइटिस (ओए), संयुक्त उपास्थि और अंतर्निहित हड्डी के टूटने के परिणामस्वरूप, विकलांगता 1,2 के लिए एक गंभीर चुनौती बनी हुई है। रक्त और तंत्रिका आपूर्ति के बिना, उपास्थि आत्म-उपचार क्षमता एक बार घायल होने के बाद न्यूनतम होती है 3,4. पिछले दशकों में, ऑटोलॉगस चोंड्रोसाइट्स प्रत्यारोपण (एसीआई) पर आधारित उपचारों ने ओए उपचार 5 में कुछ प्रगति कीहै। चोंड्रोसाइट्स अलगाव और विस्तार के लिए, ओए संयुक्त के गैर-वजन वाले क्षेत्र से छोटे उपास्थि की कटाई आवश्यक है, जिससे उपास्थि को चोटें लगती हैं। इसके अलावा, विस्तारित चोंड्रोसाइट्स6 को प्रत्यारोपित करने के लिए प्रक्रिया को दूसरे ऑपरेशन की आवश्यकता होगी। इस प्रकार, उपास्थि की चोटों के बिना ओए उपचार के लिए एक-चरण उपचार व्यापक अन्वेषण के अधीन हैं।
मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एमएससी) को ओए उपचार 7,8 के लिए आशाजनक विकल्प के रूपमें सुझाया गया है। कई ऊतकों से उत्पन्न, एमएससी विशिष्ट उत्तेजना के साथ चोंड्रोसाइट्स में अंतर कर सकते हैं। महत्वपूर्ण रूप से, एमएससी एंटी-सूजन 9 के माध्यम से प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं कोसंशोधित कर सकते हैं। इसलिए, एमएससी उपास्थि दोषों की मरम्मत और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को संशोधित करके ओए उपचार में महत्वपूर्ण लाभ रखते हैं, खासकर सूजन वातावरण में। ओए उपचार के लिए, श्लेष द्रव (एसएफ-एमएससी) से एमएससी ने हाल ही में अन्य एमएससी स्रोतों10,11 की तुलना में अपनी मजबूत चोंड्रोसाइट्स भेदभाव क्षमता के कारण बहुत ध्यान आकर्षित किया है। विशेष रूप से, आर्थोपेडिक क्लिनिक में, संयुक्त गुहा से भड़काऊ एसएफ का निष्कर्षण ओए रोगियों के दर्द लक्षण को दूर करने के लिए एक नियमित चिकित्सा है। निकाले गए भड़काऊ एसएफ को आमतौर पर चिकित्सा अपशिष्ट के रूप में निपटाया जाता है। रोगी और डॉक्टर दोनों भड़काऊ एसएफ से अलग ऑटोलॉगस एमएससी को बहुत कम नैतिक संघर्षों के साथ ओए उपचार के रूप में मानने के लिए तैयार हैं। हालांकि, एसएफ-एमएससी थेरेपी ट्यूमरोजेनिक जोखिमों, लंबे समय तक भंडारण और दूर के शिपमेंट बाधाओं के कारण समझौता किया जाता है।
एमएससी सहित कई सेल प्रकारों द्वारा स्रावित एक्सोसोम, अधिकांश मूल सेल जैव-जानकारी ले जाते हैं। सेल-फ्री थेरेपी12,13 के रूप में इसकी गहराई से जांच की गई है। नैदानिक परीक्षण सरकार (ClinicalTrials.gov) की वेबसाइट पर उपलब्ध अद्यतन संसाधनों के अनुसार, कैंसर, उच्च रक्तचाप और न्यूरो-डीजेनेरेटिव रोगों के अनुसंधान क्षेत्रों में अधिक व्यापक एक्सोसोम नैदानिक अध्ययन शुरू किए गए हैं और किए गए हैं। एसएफ-एमएससी एक्सोसोम उपचार ओए से निपटने के लिए एक रोमांचक और चुनौतीपूर्ण परीक्षण हो सकता है। नैदानिक अनुवाद के लिए अच्छा विनिर्माण अभ्यास (जीएमपी)-ग्रेड और बड़े पैमाने पर एक्सोसोम उत्पादन आवश्यक हैं। दो-आयामी (2 डी) सेल संस्कृति के आधार पर छोटे पैमाने पर एक्सोसोम अलगाव व्यापक रूप से किया गया है। हालांकि, बड़े पैमाने पर एक्सोसोम उत्पादन रणनीतियों को अनुकूलन की आवश्यकता होती है। इस अध्ययन में एक बड़े पैमाने पर एक्सोसोम विनिर्माण विधि विकसित की गई थी, जो क्सीन-मुक्त परिस्थितियों में बड़े पैमाने पर एसएफ-एमएससी संस्कृति पर आधारित थी। सेल कल्चर सुपरनैटेंट से अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, एक्सोसोम सुरक्षा और कार्य को मान्य किया गया था।
Protocol
Representative Results
Discussion
मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं का व्यापक रूप से पुनर्योजी चिकित्सा में उनके आत्म-नवीकरण के कारण उपयोग किया जाता है, विशेष कार्यों के साथ ऊतक कोशिकाओं में विभेदित किया जाता है, और पैराक्रिन प्रभाव16,17<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
चीन का राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (नंबर 81972116, नंबर 81972085, नंबर 81772394); गुआंग्डोंग प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन का प्रमुख कार्यक्रम (संख्या 2018 बी 0303110003); गुआंग्डोंग अंतर्राष्ट्रीय सहयोग परियोजना (संख्या 2021 ए0505030011); शेन्ज़ेन विज्ञान और प्रौद्योगिकी परियोजनाएं (सं। GJHZ20200731095606019, सं. JCYJ20170817172023838, सं. JCYJ20170306092215436, सं. JCYJ20170413161649437); चीन पोस्टडॉक्टरल साइंस फाउंडेशन (संख्या 2020 एम 682907); गुआंग्डोंग बेसिक और एप्लाइड बेसिक रिसर्च फाउंडेशन (संख्या 2021 ए 1515010985); शेन्ज़ेन में चिकित्सा की संमिंग परियोजना (एसजेडएसएम 201612079); गुआंग्डोंग प्रांत में उच्च स्तरीय अस्पतालों के निर्माण के लिए विशेष निधियां।
Materials
| BCA assay kit | ThermoFisher | 23227 | Protein concentration assay |
| Blood agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | P0903 | Bacteria culture |
| CD105 antibody | Elabscience | E-AB-F1243C | Flow cytometry |
| CD34 antibody | Elabscience | E-AB-F1143C | Flow cytometry |
| CD45 antibody | BD Bioscience | 555483 | Flow cytometry |
| CD63 antibody | Abclonal | A5271 | Western blotting |
| CD73 antibody | Elabscience | E-AB-F1242C | Flow cytometry |
| CD81 antibody | ABclonal | A5270 | Western blotting |
| CD9 antibody | Abclonal | A1703 | Western blotting |
| CD90 antibody | Elabscience | E-AB-F1167C | Flow cytometry |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
| CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
| Confocal laser scanning fluorescence microscopy | ZEISS | LSM 800 | |
| Cytodex | GE Healthcare | Microcarrier | |
| Dil | ThermoFisher | D1556 | Exosome label |
| EZ-PCR Mycoplasma detection kit | BI | 20-700-20 | Mycoplasma detection |
| Flowcytometry | Beckman | MSC identification | |
| Gene Pulser II System | Bio-Rad Laboratories | 1652660 | Gene transfection |
| GraphPad Prism 8.0.2 | GraphPad Software, Inc. | Version 8.0.2 | |
| HLA-DR antibody | Elabscience | E-AB-F1111C | Flow cytometry |
| Lowenstein-Jensen culture medium | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | T0573 | Mycobacterium tuberculosis culture |
| MesenGro | StemRD | MGro-500 | MSC culture |
| Nanosight NS300 | Malvern | Nanosight NS300 | Nanoparticle tracking analysis |
| NTA 2.3 software | Malvern | Data analysis | |
| Odyssey FC | Gene Company Limited | Fluorescent western blotting | |
| OptiPrep electroporation buffer | Sigma | D3911 | Gene transfection |
| Protease inhibitors cocktail | Sigma | P8340 | Proteinase inhibitor |
| RNase A | Qiagen | 158924 | Removal of RNA |
| Sabouraud agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd. | P0919 | Fungi culture |
| TEM | JEM-1200EX | ||
| The Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-4HD | 3D culture |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |
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