3次元バイオリアクター培養による滑液間葉系幹細胞由来エクソソームの大規模調製
Summary
ここでは、3Dバイオリアクターを用いて滑液間葉系幹細胞から多数のGMPグレードのエキソソームを作製するためのプロトコールを提示する。
Abstract
間葉系幹細胞(MSC)によって分泌されるエクソソームは、軟骨損傷および変形性関節症治療の有望な候補として示唆されている。臨床応用のためのエキソソームは、大規模な生産を必要とします。この目的のために、ヒト滑液MSC(hSF-MSC)をマイクロキャリアビーズ上で成長させ、動的3次元(3D)培養システムで培養しました。3D動的培養を利用することにより、SF-MSC培養上清から大規模なエクソソームを得ることに成功した。エキソソームを超遠心により回収し、透過型電子顕微鏡、ナノ粒子透過アッセイ、およびウェスタンブロッティングによって検証しました。また、エクソソームの微生物学的安全性も検出されました。エキソソーム検出の結果は、このアプローチが多数の適正製造基準(GMP)グレードのエキソソームを生成できることを示唆しています。これらのエキソソームは、エキソソーム生物学研究および臨床変形性関節症治療に利用することができる。
Introduction
関節軟骨とその根底にある骨の破壊に起因する変形性関節症(OA)は、障害につながる深刻な課題であり続けています1,2。血液と神経の供給がなければ、軟骨の自己治癒能力は一度損傷すると最小限になります3,4。過去数十年で、自家軟骨細胞移植(ACI)に基づく治療法は、OA治療においてある程度の進歩を遂げました5。軟骨細胞の単離と拡張のためには、OA関節の非体重支持領域から小さな軟骨を採取する必要があり、軟骨に損傷を与えます。また、この手順は、拡張した軟骨細胞6を移植するための第2の操作を必要とするであろう。したがって、軟骨損傷のないOA治療のためのワンステップ療法が広範囲に検討されています。
間葉系幹細胞(MSC)は、OA治療の有望な代替手段として示唆されています7,8。複数の組織に由来するMSCは、特定の刺激で軟骨細胞に分化することができます。重要なことに、間葉系幹細胞は抗炎症を介して免疫応答を調節することができます9。したがって、間葉系幹細胞は、軟骨欠損を修復し、特に炎症環境において免疫応答を調節することにより、OA治療において大きな利点を有する。OA治療では、滑液由来のMSC(SF-MSC)は、他のMSCソースよりも軟骨細胞分化能が強いため、最近注目を集めています10,11。特に整形外科クリニックでは、関節腔からの炎症性SFの抽出は、OA患者の疼痛症状を緩和するための日常的な治療法です。抽出された炎症性SFは、通常、医療廃棄物として処分される。患者と医師の両方が、炎症性SFから分離された自家間葉系幹細胞を、倫理的葛藤がほとんどないOA治療と見なす準備ができています。ただし、SF-MSC療法は、腫瘍形成のリスク、長期保存、および遠隔輸送の障壁のために損なわれます。
MSCを含む多くの細胞タイプによって分泌されるエキソソームは、親細胞の生体情報の大部分を運びます。無細胞療法として詳細に検討されている12、13。臨床試験政府(ClinicalTrials.gov)のウェブサイトで入手可能な最新のリソースによると、癌、高血圧、および神経変性疾患の研究分野で、より広範なエキソソーム臨床試験が開始され、実施されています。SF-MSCエキソソーム治療は、OAに対処するための刺激的で挑戦的な試験になる可能性があります。適正製造基準(GMP)グレードの大規模なエキソソーム生産は、臨床翻訳に不可欠です。小規模なエキソソーム単離は、2次元(2D)細胞培養に基づいて広く行われています。しかし、大規模なエクソソーム生産戦略には最適化が必要です。本研究では、ゼノフリー条件下での大量のSF-MSC培養に基づいて、大規模なエキソソーム製造方法を開発しました。細胞培養上清からの超遠心分離後、エキソソームの安全性と機能が検証されました。
Protocol
Representative Results
Discussion
間葉系幹細胞は、その自己複製、特殊な機能を有する組織細胞への分化、およびパラクリン効果により、再生医療において広く利用されてきた16,17。特に、エクソソームが及ぼすパラクリン効果が大きな注目を集めている18。エクソソームは間葉系幹細胞の生体情報を運び、その生物学的機能を果たし、面倒な保管や出荷などのMSC?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
中国国家自然科学基金会(第81972116号、第81972085号、第81772394号);広東省自然科学財団の主要プログラム(No.2018B0303110003);広東省国際協力プロジェクト(No.2021A0505030011);深セン科学技術プロジェクト(No.GJHZ20200731095606019、いいえ。JCYJ20170817172023838, No.JCYJ20170306092215436, No.JCYJ20170413161649437);中国ポスドク科学基金会(No.2020M682907);広東省基礎応用基礎研究財団(No.2021A1515010985);深センの三明医学プロジェクト(SZSM201612079);広東省の高レベル病院の建設のための特別基金。
Materials
| BCA assay kit | ThermoFisher | 23227 | Protein concentration assay |
| Blood agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | P0903 | Bacteria culture |
| CD105 antibody | Elabscience | E-AB-F1243C | Flow cytometry |
| CD34 antibody | Elabscience | E-AB-F1143C | Flow cytometry |
| CD45 antibody | BD Bioscience | 555483 | Flow cytometry |
| CD63 antibody | Abclonal | A5271 | Western blotting |
| CD73 antibody | Elabscience | E-AB-F1242C | Flow cytometry |
| CD81 antibody | ABclonal | A5270 | Western blotting |
| CD9 antibody | Abclonal | A1703 | Western blotting |
| CD90 antibody | Elabscience | E-AB-F1167C | Flow cytometry |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
| CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
| Confocal laser scanning fluorescence microscopy | ZEISS | LSM 800 | |
| Cytodex | GE Healthcare | Microcarrier | |
| Dil | ThermoFisher | D1556 | Exosome label |
| EZ-PCR Mycoplasma detection kit | BI | 20-700-20 | Mycoplasma detection |
| Flowcytometry | Beckman | MSC identification | |
| Gene Pulser II System | Bio-Rad Laboratories | 1652660 | Gene transfection |
| GraphPad Prism 8.0.2 | GraphPad Software, Inc. | Version 8.0.2 | |
| HLA-DR antibody | Elabscience | E-AB-F1111C | Flow cytometry |
| Lowenstein-Jensen culture medium | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co. , Ltd. | T0573 | Mycobacterium tuberculosis culture |
| MesenGro | StemRD | MGro-500 | MSC culture |
| Nanosight NS300 | Malvern | Nanosight NS300 | Nanoparticle tracking analysis |
| NTA 2.3 software | Malvern | Data analysis | |
| Odyssey FC | Gene Company Limited | Fluorescent western blotting | |
| OptiPrep electroporation buffer | Sigma | D3911 | Gene transfection |
| Protease inhibitors cocktail | Sigma | P8340 | Proteinase inhibitor |
| RNase A | Qiagen | 158924 | Removal of RNA |
| Sabouraud agar plate | Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd. | P0919 | Fungi culture |
| TEM | JEM-1200EX | ||
| The Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-4HD | 3D culture |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |
References
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