Summary
Ved hjelp av en selvorganiserende metode utvikler vi en protokoll med tillegg av kokos som kan øke genereringen av fotoreceptorer betydelig.
Abstract
Retinalcelletransplantasjon er en lovende terapeutisk tilnærming, som kan gjenopprette retinalarkitekturen og stabilisere eller til og med forbedre de visuelle evnene til den degenererte netthinnen. Likevel står fremgang i celleutskiftningsterapi for tiden overfor utfordringene ved å kreve en hyllevare kilde av høy kvalitet og standardiserte humane netthinner. Derfor er det nødvendig med en enkel og stabil protokoll for forsøkene. Her utvikler vi en optimalisert protokoll, basert på en selvorganiserende metode med bruk av eksogene molekyler og reagens A, samt manuell eksisjon for å generere tredimensjonale humane retinaorganoider (RO). Den humane Pluripotent Stem Cells (PSCs) -avledet RO uttrykker spesifikke markører for fotoreceptorer. Med tilsetning av COCO, en multifunksjonell antagonist, økes differensieringseffektiviteten til fotoreceptorforløpere og kjegler betydelig. Effektiv bruk av dette systemet, som har fordelene med cellelinjer og primære celler, og uten innkjøpsproblemer forbundet med sistnevnte, kan produsere sammenflytende retinale celler, spesielt fotoreceptorer. Dermed gir differensieringen av PSC til RO en optimal og biorelevant plattform for sykdomsmodellering, legemiddelscreening og celletransplantasjon.
Introduction
Pluripotente stamceller (PSC) er preget av deres selvfornyelse og evne til å differensiere til alle slags somatiske celler. Dermed har organoider avledet fra PSC blitt en viktig ressurs i regenerativ medisinforskning. Retinal degenerasjon er preget av tap av fotoreceptorer (stenger og kjegler) og retinal pigmentepitel. Retinal celle erstatning kan være en oppmuntrende behandling for denne sykdommen. Det er imidlertid ikke mulig å skaffe menneskelige netthinner for sykdomsforskning og terapi. Derfor er retinale organoider (ROs) avledet fra PSC, som effektivt og vellykket rekapitulerer flerlags innfødte retinale celler, gunstige for grunnleggende og translasjonell forskning 1,2,3. Vår forskning fokuserer på RO-differensiering for å gi tilstrekkelige og kvalitetsceller for å studere retinal degenerasjon4.
Metoder for differensiering av ROer dukker stadig opp, med tredimensjonal (3D) suspensjonsdifferensiering som ble utviklet av Sasai-laboratoriet i 20125. Vi introduserte CRX-tdTomato-taggen i humane embryonale stamceller (hESCs) for spesifikt å spore fotoreseptorforløpercellene og modifiserte metoden med tillegg av COCO, en multifunksjonell antagonist av Wnt-, TGF-β- og BMP-banene6. Kokos har vist seg å effektivt forbedre differensieringseffektiviteten til fotoreseptorforløpere og kjegler 6,7.
Til sammen, ved å modifisere den klassiske differensieringsmetoden, har vi utviklet en tilgjengelig protokoll for å høste rikelig fotoreceptorforløpere og kjegler fra humane ROs for å analysere retinal sykdom assosiert med fotoreceptorene gjennom laboratorieundersøkelser og for videre klinisk anvendelse / transplantasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble godkjent av den institusjonelle etiske komiteen i Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University. H9 hESCs ble hentet fra WiCell Research Institute og genetisk konstruert til tdTomato-merket cellelinje.
1. Generering av menneskelige ROer
- Kultur hESCs under feeder-frie forhold.
- Belegg en brønn av en 6-brønns plate med 1 ml 0,1 mg / ml reagens A (materialtabell) ved 37 ° C i minst en halv time etter produsentens instruksjoner. Tine en aliquot på 1x106 hESCs.
MERK: Forbered 3 ml forvarmet reagens B (materialtabell) og overfør de kryopreserverte cellene (1 ml) til 3 ml ferskt medium. Ikke pipette hESCs til enkeltceller. - Sentrifuge ved 200 x g i 5 minutter og fjern supernatanten.
- Frø cellene inn i reagenset A-belagt plate med 2 ml reagens B og bytt 2 ml reagens B daglig. Passasjeceller når de når omtrent 80% samløp (vanligvis rundt 4 dager).
- Belegg en brønn av en 6-brønns plate med 1 ml 0,1 mg / ml reagens A (materialtabell) ved 37 ° C i minst en halv time etter produsentens instruksjoner. Tine en aliquot på 1x106 hESCs.
- Dag 0
- Distanser hESCs til en encellet suspensjon ved bruk av medium I (tabell 1). Klargjør medium I ved å blande følgende: 20 % (v/v) KnockOut serumerstatning (KSR), 0,1 mM MEM ikke-essensiell aminosyreløsning (NEAA), 1 mM pyruvat,3 μM IWR-1-endo (IWR1e), 30 ng/ml COCO, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin (PS), 0,1 mM β-merkaptoetanol og Glasgows Eagle's minimal essential medium (GMEM).
MERK: Før dissosiasjonsstart, tilbered medium I og overfør 12 ml medium I med 20 μM Y-27632 til en 10 cm petriskål, 500 μL reagens C (materialtabell) inneholdende 0,05 mg / ml reagens D (materialtabell) og 20 μM Y-27632 i et 1,5 ml rør. Utfør trinnene ovenfor i mørket, da komponent IWR1e i medium I er lysfølsom. - Vask hESC-ene med forvarmet 1x Dulbeccos fosfatbufrede saltvannsbuffer (DPBS)-buffer.
- Tilsett det tilberedte 500 μL reagenset (i 1,5 ml) røret og inkuber hESCene i 3,5 minutter ved 37 °C og 5 % CO2.
- Løsne cellene ved å bla på siden og bunnen av platen i noen sekunder og tilsett 500 μL tilberedt medium I fra petriskålen i hESC-platen.
MERK: Forbered et 1,5 ml rør med 900 μL 1x DPBS og bruk et hemocytometer for celletelling. - Høst cellene i et nytt 1,5 ml rør og pipette cellesuspensjonen opp og ned og ta deretter ut 100 μL fra røret og legg deretter inn i røret med 900 μL DPBS for celletelling.
- Spre venstre 900 μL cellesuspensjon og fortynn deretter cellene med tilberedt medium I i petriskålen til 9 x 104 celler/ml.
MERK: Hele volumet av mediet er 12 ml; 1, 08 x 106 celler er nødvendig totalt. - Tilsett 100 μL cellesuspensjon til hver brønn i en ikke-tilhenger, V-bunn, 96-brønnplate (materialtabell).
MERK: Bruk en flerkanalspipette for å forkorte tiden og sikre at hver brønn inneholder et tilsvarende cellenummer. Rist petriskålen hver gang før du fjerner 100 μL porsjoner. Det er viktig at cellene er jevnt fordelt. - Spinn lett ned 96-brønnsplaten i en lavhastighets shaker i 5 minutter og inkuber deretter ved 37 ° C og 5% CO2.
MERK: Hold platen mørk. Sett dagen som dag 0.
- Distanser hESCs til en encellet suspensjon ved bruk av medium I (tabell 1). Klargjør medium I ved å blande følgende: 20 % (v/v) KnockOut serumerstatning (KSR), 0,1 mM MEM ikke-essensiell aminosyreløsning (NEAA), 1 mM pyruvat,3 μM IWR-1-endo (IWR1e), 30 ng/ml COCO, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin (PS), 0,1 mM β-merkaptoetanol og Glasgows Eagle's minimal essential medium (GMEM).
- Dag 2
- Tilsett 1% reagens A (materialtabell). Klargjør reagens A (proteinkonsentrasjon på 10 mg/ml) ved å tilsette 133,4 μL reagens A i 2 ml medium I.
MERK: Hold reagens A ved 4 °C over natten før bruk for å oppnå fullstendig og jevn smelting. Vær oppmerksom på produktinformasjonen og søk i katalognummeret og partinummeret på selskapets offisielle nettside for å få proteinkonsentrasjonen av reagens A, da hver flaske reagens A har en annen proteinkonsentrasjon. Hvis proteinkonsentrasjonen er lav, vil et økt volum av reagens A være nyttig. - Tilsett 20 μL forberedt reagens A til hver brønn og pipette to ganger i midten for å spre de døde cellene.
MERK: Vedlikehold reagens A og 96-brønnsplaten under kjølige forhold og fullfør alle trinnene på isen. Plasser platen i mørket.
- Tilsett 1% reagens A (materialtabell). Klargjør reagens A (proteinkonsentrasjon på 10 mg/ml) ved å tilsette 133,4 μL reagens A i 2 ml medium I.
- Dag 2-12
- Rengjør bunnen av 96-brønnsplaten og rug ved 37 °C og 5 % CO2 til dag 6. På dag 6, bytt halvparten av mediet ved å fjerne 58 μL av mediet fra hver brønn og tilsette 60 μL medium I.
MERK: Bruk en flerkanalspipette for å fullføre den halve middels endringen. Utfør dette trinnet forsiktig for å sikre at ingen cellepellets fjernes fra brønnen. Aspirer mediet til en ren 10 cm petriskål. Hvis det er cellepellets inni, legg dem tilbake til 96-brønnsplaten.
- Rengjør bunnen av 96-brønnsplaten og rug ved 37 °C og 5 % CO2 til dag 6. På dag 6, bytt halvparten av mediet ved å fjerne 58 μL av mediet fra hver brønn og tilsette 60 μL medium I.
- Dag 12- 18
- Bytt medium til medium II (tabell 1) på dag 12. Klargjør medium II ved bruk av 1% (v / v) reagens A ved å blande følgende: 10% føtalt bovint serum (FBS), 0,1 mM NEAA, 1 mM pyruvat, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 0,1 mM β-merkaptoetanol, 100 nM SAG dihydroklorid og GMEM. Oppbevar den under kjølige og mørke forhold.
- Høst cellepellets i et 15 ml konisk rør fra 96-brønnsplaten og la pellets legge seg naturlig i 5 minutter ved romtemperatur.
MERK: Fjern mediet og pellets forsiktig under overflaten for å unngå bobler. - Fjern supernatanten mens du tar vare på organoider. Overfør celleaggregatene til en 10 cm suspensjonsfat som inneholder 18 ml tilberedt medium II med reagens A.
MERK: Ikke tilsett det tilberedte medium II i 10 cm parabolen på forhånd, da reagens A skal være ved 4 °C. - Inkuber ved 37 °C og 5 % CO2 til dag 18.
- Fra dag 18 og utover
- Endre mediet til medium III (tabell 1). Forbered medium III under mørke forhold ved å blande følgende: 10% FBS, 1xsupplement 1, 0,5 μM retinsyre (RA), 100 μM taurin, 100 U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin og 1: 1 blanding av Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM) / næringsblanding F-12.
- På dag 18, når en halvtransparent optisk vesikkel genereres, kutt organoider ved hjelp av en mikrokirurgisk kniv.
MERK: Klipp organoiden, vanligvis i fire stykker, i en petriskål med medium II. Hvert stykke skal vokse til en intakt optisk kopp i de følgende ukene. - Samle alle pellets til midten av parabolen. Høst cellene i et 15 ml konisk falkerør og tillat naturlig sedimentering. Fjern deretter supernatanten forsiktig.
MERK: På grunn av deres størrelser kan organoider aggregeres i midten ved å rotere petriskålen i en retning i 90 ° på et horisontalt plan noen ganger. - Stopp og spred pellets i to 10 cm petriskåler, med 18 ml medium III per tallerken, og overfør forsiktig oppvasken til inkubatoren for å unngå celleaggregering. Fortsett å dyrke i medium III ved 37 °C og 5 % CO2 og bytt medium ukentlig. CRX uttrykte seg etter dag 45 og frem til dag 120 kunne vi påvise utsegmentet av fotoreseptoren.
2. Analysere menneskelige ROer
- FACS-analyse
- Sett sammen tre CRX-tdTomato og tre H9 ES-avledede organoider fra oppvasken ved å bruke de kuttede 1 ml spissene. Vask organoider med 1 ml forvarmet (romtemperatur) DPBS.
- Forbered fordøyelsesbufferen ved å blande 0,25 % trypsin-EDTA-oppløsning med 0,05 mg/ml reagens D.
- Dissocier organoidene i enkeltceller ved å bruke den forberedte fordøyelsesbufferen i 8 minutter ved 37 °C. Tilsett deretter samme volum DPBS med 10% FBS og 0,05 mg / ml reagens D for å inaktivere reaksjonen.
- Suspender og spred cellene lett og filtrer deretter ved hjelp av en 100 μm cellesil og bruk et FACS-system (Fluorescence-Activated Cell Sortering) ved 561 nm eksitasjonslaserlinje og 780/60 filter for å analysere CRX-tdTomato positive signaler.
MERK: CRX ekspreteres initialt på dag 45 og øker med modning av organoider. Ti tusen celler brukes til hver test, for hvert tidspunkt blir minst tre repetisjoner fullført.
- Kvantifisering av fluorescensintensitet av ROs
- Forbered de levedyktige organoider tilfeldig for bildebehandling.
MERK: Still inn parametrene og bruk de samme filtrene og parametrene for alle fluorescensintensitetsmonitorene. - Ta bilder og analyser gjennomsnittlig fluorescensintensitet ved hjelp av egnet programvare (f.eks.
- Importer bildene og konverter deretter til 8-biters ved hjelp av Image | Type.
- Juster terskelen ved hjelp av standardparameterne etter bilde | Juster | Terskel.
- Bestemme det målte området, og deretter evaluere den grå verdien ved hjelp av Analyser | Måle.
MERK: Middelverdiene i resultatpanelet er den gjennomsnittlige fluorescensintensiteten til det målte området.
- Forbered de levedyktige organoider tilfeldig for bildebehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den skjematiske illustrasjonen viser differensieringsprotokollen for å forbedre forløperceller med kokos (figur 1). Fra PSC til ROer kan mange detaljer føre til resultatvariasjoner. Det anbefales å registrere hvert trinn og til og med katalognummeret og partinummeret til hvert medium for å spore hele prosedyren.
Her gir vi lyse feltbilder for dagene 6, 12, 18 og 45 (figur 2). På dag 6 er organoidene vanligvis rundt 600 μm i diameter i en 96-brønns plate, med tette forbindelser inne og lys kant (figur 2A). På dag 12 genererer de optiske vesikkellignende strukturene først (figur 2B). Fra dag 12 til dag 18 er tilstedeværelsen av optiske vesikkelstrukturer klar, og de fortsatte å vokse etter dag 18. Organoidene uten vesikkellignende arkitektur kastes (figur 2C). På dag 30 er den vesikkellignende arkitekturen tydeligere, og det er lettere å skille de overlegne ROene fra de dårligere (figur 2D-E). Organoidene som mister den gjennomsiktige strukturen (stjerner i figur 2D-E), bør fjernes i løpet av de påfølgende dagene.
Organoidene uttrykker CRX, som er en markør for fotoreseptorforløpere, fra dag 45 og utover (figur 2F,2I). Andre markører for fotoreseptorforløpere, som RCVRN og OTX2, ble også positivt påvist ved dag 45 (figur 2G-H). Tilsetningen av kokos fremmer genereringen av fotoreseptorforløpere.
Figur 1. Tidsplan for trinnvis behandling for RO-differensiering fra hESC. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Human retinal organoid generasjon. (AB) Tidlig stadium optisk vesikkellignende struktur dannet i en 96-brønnplate. De svarte pilene indikerer de optiske vesikkellignende strukturene. (C) Den første dagen med suspensjonskultur i en petriskål på dag 18. (D-E) Optiske koppstrukturer observeres på dette stadiet. Stjernene viser de nedre organoidene (F) Det lyse feltbildet på dag 45. Skalastenger = 400 μm. (G-H) Immunostaining-resultater av RCVRN (G) og OTX2 (H) på dag 45. Skalastenger = 50 μm. (I) TdTomato-positive signaler indikerer uttrykket av CRX på dag 45 i (F). Skala barer = 400 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Middels I (50 ml) | ||||||||
| KSR | G-MEM | NEAA | Pyruvat | b-ME | IWR1e | COCO | PS | |
| Prosentvis % ELLER endelig konsentrasjon | 20 | 78 | 0,1 mM | 1 mM | 0,1 mM | 3 μM | 30 ng/ml | 1 |
| Volum | 10 ml | 39 ml | 0,5 ml | 0,5 ml | 90,9 μL | 5 μL | 10 μL | 0,5 ml |
| Butikkkonsentrasjonen til IWR1e er 30 mM. KOKOS er 150 μg/ml. | ||||||||
| Middels II (50 ml) | ||||||||
| FBS | G-MEM | NEAA | Pyruvat | b-ME | SAG | PS | ||
| Prosentvis % ELLER endelig konsentrasjon | 10 | 88 | 0,1 mM | 1 mM | 0,1 mM | 100 nM | 1 | |
| Volum | 5 ml | 44 ml | 0,5 ml | 0,5 ml | 90,9 μL | 2,5 μL | 0,5 ml | |
| Butikkkonsentrasjonen av SAG er 2 mM. | ||||||||
| Middels III (50 ml) | ||||||||
| FBS | DMEM / F12- Glutamax | Tillegg 1 | RA | Taurine | PS | |||
| Prosentvis % ELLER endelig konsentrasjon | 10 | 88 | 1 | 0,5 μM | 100 μM | 1 | ||
| Volum | 5 ml | 44 ml | 0,5 ml | 5 μL | 50 μL | 0,5 ml | ||
| Butikkkonsentrasjonen av RA er 5 mM, og Taurin er 100 mM. | ||||||||
Tabell 1: Middels I, II og II oppskrifter
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Retinal organoid differensiering er en ønskelig metode for generering av rikelig funksjonelle retinale celler. RO er en sammensetning av forskjellige retinale celler, som ganglionceller, bipolare celler og fotoreceptorer, generert av pluripotente stamceller mot nevrale retina 4,5,8,9. Selv om sammenflytende ROs kan høstes, er det tidkrevende, noe som kan kreve lange dyrkingsperioder (opptil 180 dager). For fotoreseptortransplantasjon, eller studier av kjeglestang- eller stavkegledystrofi, er det imidlertid fordelaktig å oppnå en relativt høy prosentandel fotoreceptorer i 3D-dyrkingssystemet10.
Det er også utfordrende å overvåke organoidenes utvikling uten å avbryte de normale utviklingsprosessene. Derfor brukte vi CRX, et kjeglestang-homeobox-protein, hovedsakelig uttrykt i fotoreseptorforløpere, som et målgen for å spore fotoreseptorforløperceller under deres 3D-differensiering. Med tdTomato-systemet kan CRX-uttrykkende celler spores spatio-temporalt av den røde fluorescensen uten å forstyrre retinalisering under 3D-differensieringen. Bruken av CRX-tdTomato-systemet kan akselerere prosessen med narkotikascreening for fotoreseptorforløperdifferensiering i ROene.
Ved hjelp av vår metode kan rundt 70% organoider utvikle seg til retinale organoider, som viser vesikkellignende strukturer. Viktigere, med snittet av overlegne organoider, kunne vi vanligvis høste rundt 100 retinale organoider fra en 96-brønnplate. I tillegg genereres rikelig fotoreseptorforløpere i det tidlige stadiet av RO-modning med COCO-kulturen, noe som bidrar til progresjon mot direkte differensiering av visse celler gjennom veiregulering11,12. Proteinkonsentrasjonen av reagens A er avgjørende for differensieringen. Til sammen er tilstrekkelig reagens A med aggregatene de første dagene samt skjæring av organoidene på dag 18 viktig for å høste rikelig RO med høy kvalitet. Denne metoden fremmer også utviklingen av retningsdifferensiering av fotoreceptorceller i 3D-organoider og bidrar til transplantasjon av fotoreceptorceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi takker medlemmer av 502 laboratorium for teknisk støtte og nyttige kommentarer angående manuskriptet. Dette arbeidet ble delvis støttet av Beijing Municipal Natural Science Foundation (Z200014) og National Key R&D Program of China (2017YFA0105300).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| COCO | R&D Systems | 3047-CC-050 | DAN Domain family of BMP antagonists |
| DMEM/F-12 | Gibco | 10565-042 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells | Biological Industry | 04-002-1A | |
| GMEM | Gibco | 11710-035 | |
| KnockOut Serum Replacement-Multi-Species | Gibco | A3181502 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X) | sigma | M7145 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Primesurface 96 V-plate | Sbio | MS9096SZ | Cell aggregation in 1.2.7 |
| Pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Reagent A | BD | 356231 | Matrigel in 1.1.1 |
| Reagent B | StemCell | 5990 | mTeSR- E8 , PSCs basal medium in 1.1.2 |
| Reagent C | Gibco | 12563-011 | TrypLE Express in 1.2 |
| Reagent D | Roche | 11284932001 | DNase I , in 1.2 |
| Retinoic acid | Sigma | R2625-100MG | |
| SAG | Enzo Life Science | ALX-270-426-M001 | |
| Supplement 1 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 Supplement (100X), Liquid, supplemet in medum III |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | organoids dissociation in 2.1.3 |
| Wnt Antagonist I, IWR-1-endo - Calbiochem | Sigma | 681669 | Wnt inhibitor |
| Y-27632 2HCl | Selleck | S1049 |
References
- Xie, H., et al. Chromatin accessibility analysis reveals regulatory dynamics of developing human retina and hiPSC-derived retinal organoids. Science Advances. 6 (6), 5247 (2020).
- Lu, Y. F., et al. Single-Cell Analysis of Human Retina Identifies Evolutionarily Conserved and Species-Specific Mechanisms Controlling Development. Developmental Cell. 53 (4), 473-491 (2020).
- Cowan, C. S., et al. Cell Types of the Human Retina and Its Organoids at Single-Cell Resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
- Jin, Z. B., et al. Stemming retinal regeneration with pluripotent stem cells. Progress in Retinal and Eye Research. 69, 38-56 (2019).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Pan, D., et al. COCO enhances the efficiency of photoreceptor precursor differentiation in early human embryonic stem cell-derived retinal organoids. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 366 (2020).
- Zhou, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling. Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).
- Deng, W. L., et al. Gene Correction Reverses Ciliopathy and Photoreceptor Loss in iPSC-Derived Retinal Organoids from Retinitis Pigmentosa Patients. Stem Cell Reports. 10 (4), 1267-1281 (2018).
- Gao, M. L., et al. Patient-Specific Retinal Organoids Recapitulate Disease Features of Late-Onset Retinitis Pigmentosa. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 128 (2020).
- Zhang, C. J., Ma, Y., Jin, Z. B. The road to restore vision with photoreceptor regeneration. Experimental Eye Research. 202, 108283 (2020).
- Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. 111 (23), 8518-8523 (2014).
- Kuwahara, A., et al. Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nature Communications. 6, 6286 (2015).
