إنشاء والتلاعب الجيني من الأورجانويدات مورين الكبدية
Summary
تم إنشاء نظام ثقافة عضوية ثلاثية الأبعاد سابقة طويلة الأجل من خلايا الكبد الماوس. يمكن تمرير هذه organoids والتلاعب بها وراثيا عن طريق عدوى الفيروس العدسي من بناء shRNA / خارج الرحم ، انتقال الحمض النووي الريبي والهندسة CRISPR-Cas9.
Abstract
الكبد هو أكبر عضو في الثدييات. وهو يلعب دورا هاما في تخزين الجلوكوز، إفراز البروتين، والتمثيل الغذائي وإزالة السموم. كمنفذ لمعظم وظائف الكبد، خلايا الكبد الأولية لديها قدرة محدودة على الانتشار. وهذا يتطلب إنشاء نماذج التوسع في خلايا الكبد في الجسم الحي السابق للبحوث الفسيولوجية والمرضية الكبد. هنا، قمنا بعزل خلايا الكبد المورين بخطوتين من التشوش الكولاجيني وأنشأنا ثقافة عضوية ثلاثية الأبعاد ك “الكبد المصغر” لتلخيص التفاعلات بين الخلايا الخلوية والوظائف الفيزيائية. تتكون الأجهزة العضوية من مجموعات خلايا غير متجانسة بما في ذلك السلف والخلايا الكبدية الناضجة. نحن نقدم هذه العملية بالتفصيل لعزل وثقافة خلايا الكبد مورين أو خلايا الكبد الجنينية لتشكيل organoids في غضون 2-3 أسابيع وتبين كيفية تمريرها عن طريق الأنابيب ميكانيكيا صعودا وهبوطا. وبالإضافة إلى ذلك، سوف نقدم أيضا كيفية هضم organoids في خلايا واحدة لعدوى الفيروس العدسي من shRNA / البناء خارج الرحم، سيرنا transfection و CRISPR-Cas9 الهندسة. يمكن استخدام الأجهزة العضوية لشاشات الأدوية ونمذجة الأمراض وأبحاث الكبد الأساسية من خلال نمذجة بيولوجيا الكبد وعلم الأحياء المرضية.
Introduction
الأجهزة العضوية هي ذاتية التنظيم وثلاثية الأبعاد (3D) في مجموعات المختبر التي تشمل الخلايا الجذعية ذاتية التجديد والخلايا المتباينة متعددة النسب1,2. تم إنشاء الأعضاء العضوية للعديد من الأعضاء إما من خلايا جذعية متعددة القدرات أو بالغة من خلال عوامل متخصصة محددة جيدا بما في ذلك الأمعاء والدماغ والقولون والكلى والكبد والبنكرياس والغدة الدرقية والمعدة والجلد والرئة3،4،5،6،7 . تقوم الأجهزة العضوية بتلخيص وظائف الخلايا الفيزيائية عن طريق محاكاة التطور (الناشئ عن الخلايا الجذعية الجنينية أو المستحثة متعددة القدرات ، PSCs) أو تطور التوازن / التجديد (نشأت من الخلايا الجذعية البالغة ، ASCs) ، مما يفتح آفاقا جديدة في أبحاث الأمراض والعلاج 8،9.
كأكبر عضو في الثدييات ، فإن الكبد مسؤول بشكل رئيسي عن التخزين والتمثيل الغذائي وإزالة السموم. نوعين من أنواع الخلايا الظهارية، خلايا الكبد وcholeangiocytes، وبناء الوحدة الأساسية لفصيص الكبد. خلايا الكبد هي المسؤولة عن 70-80٪ من وظائف الكبد10. على الرغم من أن الكبد لديه قدرة تجديد ملحوظة ، إلا أن الخسارة السريعة لميزات الخلايا الكبدية تحدث أثناء زراعة أحادية الطبقة التقليدية عن طريق استقطاب الخلايا غير التنظيمية والتمايز ، مما يزيد من حاجة الباحثين والأطباء لبناء نماذج الكبد “لسد الفجوة” في الطبق. ومع ذلك ، حتى وقت قريب لم تكن نماذج توسع الجسم الحي السابق من خلايا الكبد الأولية راسخة 11،12،13،14،15. يمكن إنشاء أعضاء الكبد من الخلايا الجذعية الجنينية / المستحثة متعددة القدرات ، وتحويل الخلايا الليفية إلى خلايا تشبه خلايا الكبد ، والخلايا المشتقة من الأنسجة. تطوير organoids الكبد يعزز تطبيق نموذج في المختبر لشاشات المخدرات وسمية الكبد المقايسات16,17.
هنا، ونحن نصف بروتوكول مفصل لإنشاء organoids الكبد من خلايا الكبد مورين الأولية. باستخدام هذا البروتوكول، وضعنا نظام ثقافة في المختبر من organoids الكبدية مع اثنين من perfusions من الكولاجيناز. يمكن تمرير هذه الأجهزة العضوية للتوسع على المدى الطويل لعدة أشهر. وظيفتها الفسيولوجية تتفق إلى حد كبير مع خلايا الكبد. علاوة على ذلك، نقدم أيضا وصفا مفصلا لكيفية إجراء التلاعب الجيني، مثل عدوى الفيروس العدسي، ونقل سيرنا، والهندسة CRISPR-Cas9 باستخدام الأجهزة العضوية. انتشار الخلايا الكبدية organoids تسليط الضوء على إمكانية استخدام organoids لفهم بيولوجيا الكبد وتطوير نهج الطب الشخصية والترجمة.
Protocol
Representative Results
Discussion
القدرة على زراعة خلايا الكبد الناضجة على مدى فترات طويلة أمر أساسي في دراسة العلوم الأساسية للكبد، وعلم السموم المخدرات والتهابات الميكروبيولوجيا المضيفة الهباتوتروبية مثل الملاريا وفيروسات التهاب الكبد. مع مكانة محددة جيدا ، يضع البروتوكول هنا نظاما ثقافة للخلايا الكبدية. يدفع هذا ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر البروفيسور هانز ذكيز على التكرم بتوفير خطوط الخلية لإنتاج R-spondin1 المؤتلف. وقد دعم هذا العمل المنح المقدمة من البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2019YFA0111400)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31970779) إلى H.H.، ومجموعة أبحاث صناديق الشباب متعددة التخصصات والابتكار في جامعة شاندونغ (2020QNQT003) إلى H.H.
Materials
| Perfusion Buffer | |||
| EGTA | Sangon Bitech | A600077-0100 | 3.50 g/L |
| Glucose | Sangon Bitech | A100188-0500 | 9.00 g/L |
| KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
| Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
| NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
| NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
| NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
| Phenol Red | Sangon Bitech | A100882-0025 | 0.06 g/L |
| Digestion Buffer | |||
| CaCl2 | Sangon Bitech | A501330-0005 | 0.50 M |
| Collagenase IV | Sigma | C1639 | 0.10 mg/mL |
| HEPES | Sangon Bitech | C621110-0010 | 23.80 g/L |
| KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
| Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
| NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
| NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
| NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
| Tip-wash Buffer | |||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091148 | stored at 4 °C |
| DPBS | Gibco | C14190500BT0 | stored at 4 °C |
| Wash Medium | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
| Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
| Culture Medium | |||
| A83-01 | Tocris | 2939 | Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
| B-27 supplement 50x, minus vitamin A | Gibco | 1704-044 | 50 X |
| Chir 99021 | Tocris | 4423 | Stock concentration 30 mM, final concentration 3 µM |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | stored at 4 °C |
| Gastrin I | Tocris | 3006 | Stock concentration 100 mM, final concentration 10 nM |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
| Matrigel martix | BD | 356231 | stored at -20 °C |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165 | Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM |
| Nictinamide | Sigma Aldrich | N0636 | Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM |
| Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
| Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | Stock concentration 100 µg/ml,final concentration 50 ng/ml |
| Recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 25 ng/ml |
| Recombinant Human TGF-α | Peprotech | 100-16A | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Recombinant Human TNF-α | Origene | TP750007-1000 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Rho kinase inhibitor Y-27632 | Abmole Bioscience | Y-27632 dihydrochloride | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Rspondin-1conditioned medium | Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%. | ||
| Others | |||
| 0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | |
| 16 # silicone tube | LangerPump | ||
| 24 well, suspension | Greiner bio-one | GN662102-100EA | |
| 37 °C Water Bath | |||
| 70 µm filter | BD | 352350 | |
| Accutase | stemcell | AT-104 | stored at 4 °C |
| Anti-CTNNB1 | BD | 610154 | Mouse |
| Anti-GAPDH | CST | 5174S | Rabbit |
| Anti-HDAC7 | Abcam | ab50212 | Mouse |
| Anti-KI67 | Abcam | ab15580 | Rabbit |
| Biological safety cabinet | ESCO | CCL-170B-8 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | stored at 4 °C |
| Centrifuge 5430 | eppendorf | 542700097 | |
| CO2 incubator | ESCO | AC2-4S1 | |
| DMSO | Sangon Bitech | A100231 | stored at RT |
| EVOS FL Color Imaging Systems | Invitrogen | AME4300 | |
| Hdac3 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909192555 | stored at -20 °C |
| Hdac7 lentivirus | ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd | LV2020-2364 | stored at -80 °C |
| Hitrans G A | Shanghai Genechem Co.,Ltd. | REVG004 | Increased virus infection efficiency |
| Image Pro Plus software | Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA | version 6.0 | |
| Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 13778150 | Increased virus infection efficiency |
| Live cell dye | Luna | F23001 | stored at 4 °C |
| Low-speed desktop centrifuge | cence | TD5A-WS/TD5AWS | |
| Nucleofactor-α 2b Device | Lonza | ||
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | stored at 4 °C |
| Pasteur pipette | Sangon Bitech | F621006-0001 | |
| Peristaltic pump | LangerPump | BT100-2J | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Activate with methanol |
| PX458 | Addgene | 48138 | stored at -80 °C |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Scientific Heraeus | Labofuge 400 | |
| RSL3 | MCE | HY-100218A | Stock concentration 10 mM, final concentration 4 µM |
| Trypsin/EDTA | Gibico | 25200072 | stored at 4 °C |
| Wee1 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909205971 | stored at -20 °C |
References
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 124-125 (2014).
- Sasai, Y. Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture. Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Paola, A., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570, 523-527 (2019).
- Atsuhiro, T., Ryuichi, N. Higher-Order Kidney Organogenesis from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Wang, D. S., et al. Long-Term Expansion of Pancreatic Islet Organoids from Resident Procr + Progenitors. Cell. 180 (6), 1198-1211 (2020).
- Jarno, D., Hans, C. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18, 407-418 (2018).
- Hans, C. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Forbes, S. J., Newsome, P. N. Liver regeneration-mechanisms and models to clinical application. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13 (8), 473-485 (2016).
- Zhang, K., et al. In Vitro Expansion of Primary Human Hepatocytes with Efficient Liver Repopulation Capacity. Cell Stem Cell. 23 (6), 806-819 (2018).
- Katsuda, T., et al. Conversion of Terminally Committed Hepatocytes to Culturable Bipotent Progenitor Cells with Regenerative Capacity. Cell Stem Cell. 20 (1), 41-55 (2017).
- Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Peng, W., et al. Inflammatory Cytokine TNFalpha Promotes the Long-Term Expansion of Primary Hepatocytes in 3D Culture. Cell. 175 (6), 1607-1619 (2018).
- Xiang, C., et al. Long-term functional maintenance of primary human hepatocytes in vitro. Science. 364 (6438), 399-402 (2019).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocol. 11 (9), 1724-1743 (2016).
