Estabelecimento e Manipulação Genética de Organoides Hepatocitos De Murine
Summary
Um sistema de cultura organoide 3D ex vitro de longo prazo foi estabelecido a partir de hepatócitos de camundongos. Esses organoides podem ser passagemdos e geneticamente manipulados por infecção por lentivírus de construção shRNA/ectópica, transfecção de siRNA e engenharia CRISPR-Cas9.
Abstract
O fígado é o maior órgão em mamíferos. Desempenha um papel importante no armazenamento de glicose, secreção de proteínas, metabolismo e desintoxicação. Como executor da maioria das funções hepáticas, hepatócitos primários têm capacidade de proliferação limitada. Isso requer o estabelecimento de modelos de expansão de hepatócitos ex vivo para pesquisa fisiológica e patológica hepática. Aqui, isolamos hepatócitos murinos por dois passos de perfusão de colagenase e estabelecemos uma cultura organoide 3D como o “mini-fígado” para recapitular interações célula-células e funções físicas. Os organoides consistem em populações de células heterogêneas, incluindo progenitores e hepatócitos maduros. Introduzimos o processo de forma detalhada para isolar e cultivar os hepatócitos murinos ou hepatócitos fetais para formar organoides dentro de 2-3 semanas e mostrar como passá-los mecanicamente tubos para cima e para baixo. Além disso, também introduziremos como digerir os organoides em células únicas para infecção por lentivírus de construção shRNA/ectópica, transfecção de siRNA e engenharia CRISPR-Cas9. Os organoides podem ser usados para telas de drogas, modelagem de doenças e pesquisa hepática básica, modelando biologia hepática e patobiologia.
Introduction
Organoides são aglomerados in vitro auto-organizados, tridimensionais (3D) que incluem células-tronco auto-renovadores e células diferenciadas multi-linhagem1,2. Os organoides de muitos órgãos foram estabelecidos a partir de células-tronco pluripotentes ou adultas por fatores de nicho bem definidos, incluindo o intestino, o cérebro, o cólon, o rim, o fígado, o pâncreas, a tireoide, o estômago, a pele e o pulmão3,4,5,6,7 . Os organoides recapitulam funções celulares físicas imitando o desenvolvimento (originário de células-tronco pluripotentes embrionárias ou induzidas, PSCs) ou progressão de homeostase/regeneração (originária de células-tronco adultas, ASCs), o que abre novos caminhos na pesquisa e terapia de doenças8,9.
Como o maior órgão dos mamíferos, o fígado é o principal responsável pelo armazenamento, metabolismo e desintoxicação. Dois tipos de células epiteliais, hepatócitos e cholangiocitos, constroem a unidade básica de um lobule hepático. Hepatócitos são responsáveis por 70-80% da função hepática10. Embora o fígado tenha notável capacidade de regeneração, a perda rápida de características hepatócidas acontece durante a cultura tradicional de monocamadas por polarização celular disregulada e dediferenciação, o que aumenta a necessidade de pesquisadores e médicos construirem modelos hepáticos de “ponte de lacunas” em um prato. No entanto, até recentemente, os modelos de expansão ex vivo dos hepatócitos primários não tinham sido bem estabelecidos11,12,13,14,15. Organoides hepáticos podem ser estabelecidos a partir de células-tronco pluripotentes embrionárias/induzidas, conversão de fibroblasto em células semelhantes a hepatócitos e células derivadas de tecidos. O desenvolvimento de organoides hepáticos aumenta a aplicação de um modelo in vitro para telas de drogas e ensaios de toxicidade hepática16,17.
Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para estabelecer organoides hepáticos de hepatócitos primários murinas. Usando este protocolo, criamos um sistema de cultura in vitro de organoides hepatocitos com duas perfusões de colagemnase. Esses organoides podem ser aprovados para expansão a longo prazo por meses. Sua função fisiológica é altamente consistente com hepatócitos. Além disso, também fornecemos uma descrição detalhada de como realizar manipulação genética, como infecção por lentivírus, transdução de siRNA e engenharia CRISPR-Cas9 usando organoides. A propagação de organoides hepatocitos esclareceu a possibilidade de usar organoides para entender a biologia hepática e desenvolver abordagens personalizadas e translacionais de medicina.
Protocol
Representative Results
Discussion
A capacidade de cultivar hepatócitos maduros por longos períodos é fundamental no estudo da ciência básica hepática, toxicologia medicamentosa e infecções hepatotrópicos de microbiologia hospedeira, como malária e vírus da hepatite. Com um nicho bem definido, o protocolo aqui cria um sistema de cultura para hepatócitos. Este protocolo leva hepatócitos maduros a expandir-se na cultura 3D com uma heterogeneidade que recapitula a interação célula-célula, a maioria da função hepatocita e modificações gen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Professor Hans Clevers por fornecer gentilmente as linhas celulares para produzir r-spondin1 recombinantes. Este trabalho foi apoiado pelas bolsas do Programa Nacional de P&D da China (2019YFA0111400), da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (31970779) ao H.H., e do Grupo de Pesquisa Interdisciplinar e de Inovação da Juventude da Universidade de Shandong (2020QNQT003) ao H.H.
Materials
| Perfusion Buffer | |||
| EGTA | Sangon Bitech | A600077-0100 | 3.50 g/L |
| Glucose | Sangon Bitech | A100188-0500 | 9.00 g/L |
| KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
| Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
| NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
| NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
| NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
| Phenol Red | Sangon Bitech | A100882-0025 | 0.06 g/L |
| Digestion Buffer | |||
| CaCl2 | Sangon Bitech | A501330-0005 | 0.50 M |
| Collagenase IV | Sigma | C1639 | 0.10 mg/mL |
| HEPES | Sangon Bitech | C621110-0010 | 23.80 g/L |
| KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
| Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
| NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
| NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
| NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
| Tip-wash Buffer | |||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091148 | stored at 4 °C |
| DPBS | Gibco | C14190500BT0 | stored at 4 °C |
| Wash Medium | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
| Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
| Culture Medium | |||
| A83-01 | Tocris | 2939 | Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
| B-27 supplement 50x, minus vitamin A | Gibco | 1704-044 | 50 X |
| Chir 99021 | Tocris | 4423 | Stock concentration 30 mM, final concentration 3 µM |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | stored at 4 °C |
| Gastrin I | Tocris | 3006 | Stock concentration 100 mM, final concentration 10 nM |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
| Matrigel martix | BD | 356231 | stored at -20 °C |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165 | Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM |
| Nictinamide | Sigma Aldrich | N0636 | Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM |
| Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
| Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | Stock concentration 100 µg/ml,final concentration 50 ng/ml |
| Recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 25 ng/ml |
| Recombinant Human TGF-α | Peprotech | 100-16A | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Recombinant Human TNF-α | Origene | TP750007-1000 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Rho kinase inhibitor Y-27632 | Abmole Bioscience | Y-27632 dihydrochloride | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Rspondin-1conditioned medium | Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%. | ||
| Others | |||
| 0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | |
| 16 # silicone tube | LangerPump | ||
| 24 well, suspension | Greiner bio-one | GN662102-100EA | |
| 37 °C Water Bath | |||
| 70 µm filter | BD | 352350 | |
| Accutase | stemcell | AT-104 | stored at 4 °C |
| Anti-CTNNB1 | BD | 610154 | Mouse |
| Anti-GAPDH | CST | 5174S | Rabbit |
| Anti-HDAC7 | Abcam | ab50212 | Mouse |
| Anti-KI67 | Abcam | ab15580 | Rabbit |
| Biological safety cabinet | ESCO | CCL-170B-8 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | stored at 4 °C |
| Centrifuge 5430 | eppendorf | 542700097 | |
| CO2 incubator | ESCO | AC2-4S1 | |
| DMSO | Sangon Bitech | A100231 | stored at RT |
| EVOS FL Color Imaging Systems | Invitrogen | AME4300 | |
| Hdac3 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909192555 | stored at -20 °C |
| Hdac7 lentivirus | ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd | LV2020-2364 | stored at -80 °C |
| Hitrans G A | Shanghai Genechem Co.,Ltd. | REVG004 | Increased virus infection efficiency |
| Image Pro Plus software | Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA | version 6.0 | |
| Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 13778150 | Increased virus infection efficiency |
| Live cell dye | Luna | F23001 | stored at 4 °C |
| Low-speed desktop centrifuge | cence | TD5A-WS/TD5AWS | |
| Nucleofactor-α 2b Device | Lonza | ||
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | stored at 4 °C |
| Pasteur pipette | Sangon Bitech | F621006-0001 | |
| Peristaltic pump | LangerPump | BT100-2J | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Activate with methanol |
| PX458 | Addgene | 48138 | stored at -80 °C |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Scientific Heraeus | Labofuge 400 | |
| RSL3 | MCE | HY-100218A | Stock concentration 10 mM, final concentration 4 µM |
| Trypsin/EDTA | Gibico | 25200072 | stored at 4 °C |
| Wee1 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909205971 | stored at -20 °C |
References
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