マウス肝細胞オルガノイドの確立と遺伝子操作
Summary
マウス肝細胞から長期 の外ビトロ 3Dオルガノイド培養システムが確立された。これらのオルガノイドは、shRNA/異所構造、siRNAトランスフェクションおよびCRISPR-Cas9エンジニアリングのレンチウイルス感染によって継代され、遺伝的に操作することができる。
Abstract
肝臓は哺乳類の中で最大の器官です。これは、グルコース貯蔵、タンパク質分泌、代謝および解毒において重要な役割を果たしています。肝機能の大部分の実行者として、原発性肝細胞は増殖能力が限られている。そのためには、肝臓生理学的および病理学的研究のための ex vivo 肝細胞拡張モデルの確立が必要です。ここでは、コラゲナーゼ灌流の2段階でマウス肝細胞を単離し、細胞と細胞の相互作用と身体機能を再現する「ミニ肝臓」として3Dオルガノイド培養を確立した。オルガノイドは、前駆細胞および成熟した肝細胞を含む不均一な細胞集団で構成される。マウス肝細胞または胎児肝細胞を2~3週間以内に分離して培養し、オルガノイドを形成するプロセスを詳細に紹介し、機械的に上下にピペットを通過させる方法を示す。また、shRNA/異所構造のレンチウイルス感染、siRNAトランスフェクション、CRISPR-Cas9エンジニアリング用にオルガノイドを単一細胞に消化する方法についても紹介します。オルガノイドは、肝臓生物学と病態生物学をモデル化することにより、薬物スクリーン、疾患モデリング、および基礎的な肝臓研究に使用することができます。
Introduction
オルガノイドは、自己更新幹細胞および多系統分化細胞1,2を含む体外(3D)インビトロクラスターです。多くの器官のオルガノイドは、腸、脳、結腸、腎臓、肝臓、膵臓、甲状腺、胃、皮膚、および肺を含む明確に定義されたニッチ因子によって、多能性または成体幹細胞から確立されている3,4,5,6,7.オルガノイドは、発症(胚性または誘発多能性幹細胞、PSCに由来する)または恒常性/再生進行(成人幹細胞、ASCに由来する)のいずれかを模倣することによって、身体細胞機能を再現し、疾患研究と治療の新たな道を開く8,9。
哺乳類の最大の器官として、肝臓は主に貯蔵、代謝および解毒を担当する。肝細胞と胆管球の2種類の上皮細胞型は、肝臓小葉の基本単位を構築する。肝細胞は肝機能の70-80%を担う10。肝臓は顕著な再生能力を有するが、肝細胞特徴の急速な喪失は、調節不全細胞分極化および脱分化による伝統的な単層培養中に起こり、研究者や臨床医が皿の中に「ギャップブリッジング」肝臓モデルを構築する必要性を高める。しかし、最近まで、原発肝細胞からのエクスビボ拡張モデルは十分に確立されていなかった11,12,13,14,15。肝オルガノイドは、胚/誘導多能性幹細胞、肝細胞様細胞への線維芽細胞変換、および組織由来細胞から確立することができる。肝オルガノイドの開発は、薬物スクリーンおよび肝毒性アッセイのためのインビトロモデルの適用を後押しする16,17。
ここでは、マウス原発肝細胞から肝オルガノイドを確立するための詳細なプロトコルについて説明する。このプロトコルを用いることで、2回のコラゲナーゼを用いた肝細胞オルガノイドの インビトロ 培養系を設定しました。これらのオルガノイドは、数ヶ月間の長期拡張のために継代することができる。彼らの生理機能は肝細胞と非常に一致している。さらに、レンチウイルス感染、siRNAの導入、有機体を用いたCRISPR-Cas9工学など、遺伝子操作の実施方法についても詳しく説明しています。肝細胞オルガノイドの伝播は、オルガノイドを使用して肝臓生物学を理解し、パーソナライズされた翻訳医療アプローチを開発する可能性に光を当てた。
Protocol
Representative Results
Discussion
成熟した肝細胞を長期間にわたって培養する能力は、肝臓の基礎科学、薬物毒物学、マラリアや肝炎ウイルスなどの肝刺激性宿主微生物感染症の研究の基本です。明確に定義されたニッチで、ここでのプロトコルは、肝細胞の培養システムを設定します。このプロトコルは、成熟した肝細胞を細胞と細胞の相互作用、ほとんどの肝細胞機能および遺伝子組換えを再現する異質性を持つ3D培養?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
組み換えR-spondin1を生産するための細胞株を親切に提供してくれたハンス・クレバーズ教授に感謝します。この研究は、中国国家主要研究開発プログラム(2019YFA0111400)、中国国立自然科学財団(31970779)からH.H.、山東大学青少年学際イノベーション研究グループ(2020QNQQT003)からH.H.への助成金によって支えられました。
Materials
| Perfusion Buffer | |||
| EGTA | Sangon Bitech | A600077-0100 | 3.50 g/L |
| Glucose | Sangon Bitech | A100188-0500 | 9.00 g/L |
| KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
| Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
| NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
| NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
| NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
| Phenol Red | Sangon Bitech | A100882-0025 | 0.06 g/L |
| Digestion Buffer | |||
| CaCl2 | Sangon Bitech | A501330-0005 | 0.50 M |
| Collagenase IV | Sigma | C1639 | 0.10 mg/mL |
| HEPES | Sangon Bitech | C621110-0010 | 23.80 g/L |
| KCl | Sangon Bitech | A100395-0500 | 4.00 g/L |
| Na2HPO4·12H2O | Sangon Bitech | A501727-0500 | 1.51 g/L |
| NaCl | Sangon Bitech | A501218-0001 | 80.0 g/L |
| NaH2PO4·2H2O | Sangon Bitech | A610404-0500 | 0.78 g/L |
| NaHCO3 | Sangon Bitech | A500873-0500 | 3.50 g/L |
| Tip-wash Buffer | |||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10091148 | stored at 4 °C |
| DPBS | Gibco | C14190500BT0 | stored at 4 °C |
| Wash Medium | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
| Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
| Culture Medium | |||
| A83-01 | Tocris | 2939 | Stock concentration 500 µM, final concentration 2 µM |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | stored at 4 °C |
| B-27 supplement 50x, minus vitamin A | Gibco | 1704-044 | 50 X |
| Chir 99021 | Tocris | 4423 | Stock concentration 30 mM, final concentration 3 µM |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | stored at 4 °C |
| Gastrin I | Tocris | 3006 | Stock concentration 100 mM, final concentration 10 nM |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 100 X |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100 X |
| Matrigel martix | BD | 356231 | stored at -20 °C |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165 | Stock concentration 500 mM, final concentration 1 mM |
| Nictinamide | Sigma Aldrich | N0636 | Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM |
| Penicillin/streptomycin | Sangon Bitech | A600135-0025 | 100 X |
| Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | Stock concentration 100 µg/ml,final concentration 50 ng/ml |
| Recombinant human FGF10 | Peprotech | 100-26 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 25 ng/ml |
| Recombinant Human TGF-α | Peprotech | 100-16A | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Recombinant Human TNF-α | Origene | TP750007-1000 | Stock concentration 100 µg/ml, final concentration 100 ng/ml |
| Rho kinase inhibitor Y-27632 | Abmole Bioscience | Y-27632 dihydrochloride | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
| Rspondin-1conditioned medium | Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%. | ||
| Others | |||
| 0.22 µm filter | Millipore | SCGPT01RE | |
| 16 # silicone tube | LangerPump | ||
| 24 well, suspension | Greiner bio-one | GN662102-100EA | |
| 37 °C Water Bath | |||
| 70 µm filter | BD | 352350 | |
| Accutase | stemcell | AT-104 | stored at 4 °C |
| Anti-CTNNB1 | BD | 610154 | Mouse |
| Anti-GAPDH | CST | 5174S | Rabbit |
| Anti-HDAC7 | Abcam | ab50212 | Mouse |
| Anti-KI67 | Abcam | ab15580 | Rabbit |
| Biological safety cabinet | ESCO | CCL-170B-8 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | stored at 4 °C |
| Centrifuge 5430 | eppendorf | 542700097 | |
| CO2 incubator | ESCO | AC2-4S1 | |
| DMSO | Sangon Bitech | A100231 | stored at RT |
| EVOS FL Color Imaging Systems | Invitrogen | AME4300 | |
| Hdac3 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909192555 | stored at -20 °C |
| Hdac7 lentivirus | ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd | LV2020-2364 | stored at -80 °C |
| Hitrans G A | Shanghai Genechem Co.,Ltd. | REVG004 | Increased virus infection efficiency |
| Image Pro Plus software | Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA | version 6.0 | |
| Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 13778150 | Increased virus infection efficiency |
| Live cell dye | Luna | F23001 | stored at 4 °C |
| Low-speed desktop centrifuge | cence | TD5A-WS/TD5AWS | |
| Nucleofactor-α 2b Device | Lonza | ||
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | stored at 4 °C |
| Pasteur pipette | Sangon Bitech | F621006-0001 | |
| Peristaltic pump | LangerPump | BT100-2J | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Activate with methanol |
| PX458 | Addgene | 48138 | stored at -80 °C |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Scientific Heraeus | Labofuge 400 | |
| RSL3 | MCE | HY-100218A | Stock concentration 10 mM, final concentration 4 µM |
| Trypsin/EDTA | Gibico | 25200072 | stored at 4 °C |
| Wee1 siRNA | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | siG2003180909205971 | stored at -20 °C |
References
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 124-125 (2014).
- Sasai, Y. Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture. Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Paola, A., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570, 523-527 (2019).
- Atsuhiro, T., Ryuichi, N. Higher-Order Kidney Organogenesis from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Wang, D. S., et al. Long-Term Expansion of Pancreatic Islet Organoids from Resident Procr + Progenitors. Cell. 180 (6), 1198-1211 (2020).
- Jarno, D., Hans, C. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18, 407-418 (2018).
- Hans, C. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Forbes, S. J., Newsome, P. N. Liver regeneration-mechanisms and models to clinical application. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13 (8), 473-485 (2016).
- Zhang, K., et al. In Vitro Expansion of Primary Human Hepatocytes with Efficient Liver Repopulation Capacity. Cell Stem Cell. 23 (6), 806-819 (2018).
- Katsuda, T., et al. Conversion of Terminally Committed Hepatocytes to Culturable Bipotent Progenitor Cells with Regenerative Capacity. Cell Stem Cell. 20 (1), 41-55 (2017).
- Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Peng, W., et al. Inflammatory Cytokine TNFalpha Promotes the Long-Term Expansion of Primary Hepatocytes in 3D Culture. Cell. 175 (6), 1607-1619 (2018).
- Xiang, C., et al. Long-term functional maintenance of primary human hepatocytes in vitro. Science. 364 (6438), 399-402 (2019).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocol. 11 (9), 1724-1743 (2016).
